FRETはレシオメトリックで細胞周期のキナーゼおよびホスファターゼの活動を監視

このビデオでは、キナーゼとホスファターゼの活性をForrester Resonance Energy transferまたはfretを使用して、細胞サイクル全体にわたってモニターしています。ここでは、ポロ様のキナーゼ1またはLK one活性プローブの一方の端にシアン蛍光タンパク質CFPが配置され、もう一方の端に黄色の蛍光タンパク質YFPが配置されています。このプローブはU2 OS細胞にトランスフェクションされます。

次に、G two two M遷移中のLK oneターゲットのリン酸化状態を調べるために、トランスフェクトしたU2 OS細胞をタイムラプス蛍光イメージングにかけます。CFPとYFPが近接し、CFPが励起されると、エネルギーがYFPに伝達され、YFPの入場を検出できます。しかし、プローブがリン酸化されると、タンパク質の確認的な変化により、CFPとYFPが分離します。

ここで、CFPが励起されると、強いCFP放射と弱いYFP放射のみが検出されます CFPとYFPの両方の励起後のYFP放射の比率を定量化すると、PLK 1の活性がG2で増加し、有糸分裂中にピークに達することが示されています。したがって、標準的な幾何学的撮影のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、細胞周期が撮影条件やプローブの発現によって乱されないことに特に注意が払われていることです。この方法は、特定のキナーゼまたはホスファターゼが活性化される場所やタイミングなど、細胞周期分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この方法は、細胞周期制御酵素に関する洞察を得ることができますが、細胞増殖アッセイなど、unres条件が必要な他のシステムにも適用できます。ヒトの細胞周期をモニターするために、U2 OS細胞にフレットベースのPK one活性プローブをトランスフェクションします。標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて、細胞をpur mycin中で少なくとも7日間選択します。

これにより、プローブを発現する細胞の集団が濃縮され、毒性発現レベルまたは細胞周期に深刻な影響を与える発現レベルを持つ細胞の数が制限されます。次に、CFPの限定的な希釈発現によって安定なクローンを選択し、次にYFPを調べて、それらがほぼ同じ比率ですべての細胞に存在することを確認します。この場合、一部の細胞にCFPまたはYFP組換えが発生した可能性が高い場合は、相同組換えが発生しにくい細菌(2つの細胞など)を使用してプラスミド調製を繰り返し、プラスミドを線分化してトランスフェクションを繰り返します。

細胞がプローブを安定して発現したら、細胞が付着して30〜50%コンフルエントになった後、1.5番のガラス底皿に播種します。培地をCO2に依存せず、フェノールレッドを含まないものに変更し、セルを電動落射蛍光顕微鏡に取り付けます 温度制御は摂氏37度に設定されています。顕微鏡には、CFPおよびYFP励起および発光フィルターを装備する必要があります。

CFP、YFPのモニタリングに適したROICミラーと、必要な解像度に適した対物レンズです。ここでは、20 x NA 0.75 エア オブジェクティブを使用します。透過光を使用して、細胞に焦点を合わせます。

この時点で蛍光灯は、細胞周期を乱す可能性のあるストレス応答を誘発するため、使用しないでください。光毒性を回避するには、必要な細胞内分解能を可能にする最大限に曲げを設定します。この実験では、核と細胞質を区別することが可能であるべきです。

露光時間を短く設定し、高減光フィルターを挿入します。次に、12ビットまたは16ビットのテスト画像を取得する YFP励起と発光を使用して、セル内の平均強度がバックグラウンド強度に最小バックグラウンド強度と最大バックグラウンド強度の差の5倍を加えたものにほぼ等しくなるように、露光時間と減光フィルターを調整します。画像が飽和していないことを確認するには、サンプル画像の蛍光強度を調べます。

画像の最大強度は、細胞が有糸分裂に入ったときに強度の違いを考慮して、ダイナミックレンジの半分未満にする必要があります。次に、CFP励起フィルターとYFP蛍光フィルターを使用してこのプロセスを繰り返します。トランスフェクションされた細胞を持つ複数の領域を選択します。ただし、ばく露条件の焦点を合わせたり最適化したりするために使用される領域は除きます。

これらの手順でストレス応答が引き起こされた可能性があるため、すべての細胞の最大強度がダイナミックレンジの半分未満であることを確認してください。YFP励起、YFP放射、CFP励起を使用して45分ごとに2つの画像を取得するようにソフトウェアに指示します。YFP発光フィルター。

また、実験の全長が細胞周期の持続時間を超えるように設定します。すべての設定が完了したら、取得が完了した後に画像の取得を開始し、取得した画像を開き、有糸分裂から有糸分裂までの細胞サイクル時間を監視します。ここでトランスフェクションしたプローブを発現する細胞の場合、細胞サイクル時間は約20〜25時間でした。

これを、使用するセルタイプの制御データと比較します。細胞サイクル時間が基準タイミングに対応している場合、フレットを解析できます。タイミングが確認できたら、画像を解析できます。

分析は、顕微鏡専用のほとんどのソフトウェアで実行できます。ここでは、image jフリーウェアをratio plusプラグインと一緒に使用しています。画像Jで画像を開くことから解析を開始します。画像がマルチカラースタック形式である場合は、個々のチャンネルをハイパースタックに変換して分離し、画像を選択します。

次に、ハイパースタック、次にハイパースタックにスタックします。[ハイパースタックへの変換]ウィンドウが開き、設定が表示されたら、[OK]をクリックします。画像が、その下に2つのスライダーバーとともに表示されます。

次に、画像をシングルチャネルスタックに分割するには、画像をクリックして[hyper stack reduce dimensionality]を選択します。これにより、縮小ウィンドウが開き、フレームとソースの保持が選択されていることを確認します。次に、[OK] をクリックします。

1つのチャンネルのみを含む新しい画像が表示されます。このプロセスを繰り返して、2 番目のチャネルで新しい画像を表示します。次に、最終的な画像の視覚的な鮮明さを高めるために、YFP励起YFP発光スタックを選択します。

[プロセス]をクリックし、[数学]をクリックします。次に乗算します 乗算ウィンドウが開いたら、3を入力して、YFP励起YFP放射スタックに3を掛けます。この手順はオプションであり、比率が 0 から 1 の範囲にないことを確認します。

次に、画像Jツールバーで、フリーハンドツールを選択します。次に、YFP励起、YFP発光スタックで、セルがない領域に関心領域またはROIを描画しますが、それは測定されるセルの近くにあり、ROIマネージャーにROIを追加し、[分析ツール]をクリックします。次にROIマネージャー。

ROIマネージャーウィンドウが表示されます。[追加]をクリックしてROI座標を保存し、YFP励起YFP発光スタックのROIの平均強度を測定します。[分析] をクリックし、[測定] を選択します。

結果ウィンドウが開きます。CFP励起YFP放出スタックを選択します。次に、ROIマネージャーでROIをダブルクリックし、測定を繰り返します。

測定値が結果ウィンドウに追加されます。スタック内の他の場所までスクロールして、このプロセスを複数の時点で繰り返します。結果ウィンドウで測定値を比較することにより、目的のセルに近いバックグラウンド強度がフィルム全体で類似していることを確認します。

最小強度を含むように測定値を設定するには、[分析]をクリックし、[測定値の設定]をクリックして、最小と最大のグレー値を指定します。次に、測定の選択肢を示すウィンドウが表示されます。必要に応じて明るさとコントラストを調整した後、セルの大部分をカバーするROIを描画し、両方のスタックの最小強度を測定します。

次に、背景の代わりにセルを使用して、前と同じように測定を行います。結果セクションの値を使用して、測定された最小強度とバックグラウンド強度の差を計算し、それを 2 で割ります。これにより、クリッピング値とオープン率と選択したプラグインの開始推定値が提供されます。

次に、比率をプラスします。次に、フレット比として、CFP励起YFP発光Sスタック1を選択するか、リン酸化によりフレット効率が低下するプローブを視覚化する逆フレット比を選択します。YFP励起 YFP発光Sスタック1を選択して、測定されたバックグラウンド強度とクリッピング値を挿入します。

結果表示ウィンドウの値を使用して、比率プラスウィンドウに貼り付けます。結果の比率スタックのスケーリングを設定し、適切なルックアップ テーブルを適用して比率の変化を視覚化します。このビデオで説明されているように、PLK 1のアクティビティをモニタリングするフレットベースのプローブを発現するU2 OS細胞を60時間撮影しました。

この画像は、娘細胞の分裂を含む、50個のフレットプローブ発現細胞の累積有糸分裂侵入を示しています。プローブを発現する細胞の大部分は、20時間から25時間の細胞周期時間で増殖し、プローブのイメージング条件や発現レベルが細胞周期のタイミングに影響を与えないことを示しています。1つの細胞を4つの分裂まで追う逆フレット比の偽色表現は、かなりのノイズがあるものの、PK 1の活性がG 2で増加し、有糸分裂中にピークに達する傾向が見られることを示しています。

生データを平均フィルタリングしてグラフとして表示すると、アクティビティのピーク間の時間を簡単に推定できます。この図は、前のグラフの画像に示したセルの逆フレット比を定量化したものです。活性化のタイミングを推定することができ、ここで見られるように、プローブのリン酸化は、有糸分裂でリン酸化がピークに達する約4時間前に見えるようになります。

この手順を試みるときは、細胞をストレスのない状態に保つことが重要であるため、これは光への曝露を最小限に抑え、温度やpHの変化を最小限に抑えることによって行われます。また、この方法は細胞内のキナーゼ活性とホスファターゼ活性のバランスをモニターすることを覚えておくことも重要です。この手順は、RNA干渉または阻害剤スクリーニングと組み合わせて、これらのキナーゼおよびホスフォターゼの上流の調節因子を同定できます。