Name: 生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: 学ぶストア作動性カルシウムエントリーの蛍光測定法。培養癌細胞と骨格筋線維を用いた生細胞イメージング技術で、細胞内カルシウム動態をリアルタイムに解析し、高スループットスクリーニングに応用可能です。

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私たちは、読書と、この原稿を編集するために博士ノアWeislederに感謝します。この作品は、MBに0535555N ZP、XZに米国心臓協会SDG2630086、および国立衛生研究所RC2AR058962-01 MBまでに研究費補助金UMDNJ財団62から09でサポートされていました。

<ol><li>Parekh, A. B., Putney, J. W. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Store-operated calcium channels.</a> Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).</li>
<li>Ma, J., Pan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+activation+of+store-operated+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Retrograde activation of store-operated calcium channel.</a> Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1+and+STIM1+deficiency+in+human+and+mice%3A+roles+of+store-operated+Ca2%2B+entry+in+the+immune+system+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond.</a> Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).</li>
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<li>Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+intracellular+Ca2%2B+by+caffeine+and+ryanodine+induces+apoptosis+of+chinese+hamster+ovary+cells+transfected+with+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).</li>
<li>Hirata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+store-operated+Ca2%2B+entry+and+altered+Ca2%2B+release+from+sarcoplasmic+reticulum+through+silencing+of+junctophilin+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes.</a> Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+to+fatigue+and+altered+calcium+handling+properties+of+sarcalumenin+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice.</a> Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).</li>
<li>Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azumolene+inhibits+a+component+of+store-operated+calcium+entry+coupled+to+the+skeletal+muscle+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor.</a> J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).</li>
<li>Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+coupling+between+skeletal+muscle+store-operated+Ca2%2B+entry+and+the+inositol+trisphosphate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).</li>
<li>Shuttleworth, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+relationships+between+Ca2%2B+store+mobilization+and+Ca2%2B+entry+in+an+exocrine+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Calcium%22%5BJournal%5D)">Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell.</a> Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

Ca 2 +結合およびCa 2 +フリーフラ-2の励起波長は、それぞれ340nmおよび380nmであるが、Caの2のフラ-2の最高の比ダイナミックレンジ+濃度測定は、特に、他の波長で発生する可能性があります顕微鏡システム。波長のようなシフトは、通常、様々な光学部品を添加した光路の変化によるものである。本研究では、フラ-2の励起波長は、フラ-2蛍光のスペクトル解析を行うことにより、350 nmと390 nmで測定した。 を含むいくつかのソースのバランスから、細胞質ゾルの結果細胞内Ca 2 +レベル、細胞内Ca 2 +放出は、細胞外Ca 2 +のエントリと同様に、小胞体と細胞膜でのCa 2 +排除機構。細胞内Ca 2 +放出とCa 2 + EXTRから一方向のSOC-介在Ca 2 +流入を単離するために、usionは、Mn 2 +が消光アッセイを使用することができます。のMn 2 +は SOCEを介して細胞に浸透することができることが知られているが、表面膜の押し出しまたはCa 2によってERの取り込み+ポンプへの浸透です。したがって、蛍光消光は、単方向のMn 2 + SOCEの活性化の度合いを推定する細胞内へのフラックスの測定を表しています。のMn 2 +クエンチアッセイは、このような波長で、等吸収点で行わフラ-2蛍光強度がCa 2 +濃度とは無関係です。されてい各システムの等吸収点は、スペクトラム·スキャンによって決定されるべきである。また、Mn 2 +の消光は、最終的な値は、Ca 2 +濃度の13の独立しているような方法で、任意の2つの波長で調整された蛍光によって記録することができます。 骨格筋におけるSOCEの活動の空間的および時間的情報を得るために、我々は同時measuremeを可能にするデュアル色素法を採用SOCE活動のNTおよびSRのCa 2 +肌の大人の哺乳類のEDL筋線維内のコンテンツ。 SRのCa 2の変化の間に相関が+コンテンツとSOCE活動は、SRのCa 2 +貯蔵の枯渇にSOCE活性化のしきい値と感度を示すためにプロットすることができます。 TT-ローディング溶液は、さらにカルシウム2とT-細管をロードするために最適化されている+とT-細管とSR-ローディング溶液のプライミングのために最大限のSRのCa 2 +ローディングを促進し、さらにT-細管をロードするように設計されています〜500μMのCa 2 +。 FCCPは、TT / SR-ローディング溶液とミトコンドリアからの影響を排除するためにSR-オゾンソリューションに含まれています。

特定の試薬や機器の表： <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td>メディアテック</td><td> 10から040-CV </td><td></td></tr><tr><td>ハムのF-12 </td><td>メディアテック</td><td> 10から080-CV </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>メディアテック</td><td> 10から013-CV </td><td></td></tr><tr><td>ガラスボトムディッシュ</td><td>マテック</td><td> P35G-1.5-14-C </td><td></td></tr><tr><td> AMフラ-2 </td><td> Invitrogen社（Molecular Probes）を</td><td> F1221 </td><td> -20°C、DMSOに溶解し、光から保護シールタイト、 </td></tr><tr><td>蛍光-5N AM </td><td> Invitrogen社（Molecular Probes）を</td><td> F14204 </td><td> -20°C、密封、Lから保護IGHT </td></tr><tr><td> rhodo-の異形5N </td><td> Invitrogen社（Molecular Probes）を</td><td> R14207 </td><td> -20°C、シールタイト、光から保護</td></tr><tr><td>石英キュベット</td><td> Starna細胞</td><td> 3-Q-10 </td><td></td></tr><tr><td>タプシガルギン</td><td> Tocris </td><td> 1138 </td><td></td></tr><tr><td> 2 Aminoethoxydiphenylborane（2-APB） </td><td> Tocris </td><td> 1224 </td><td></td></tr><tr><td> N-ベンジル-p-トルエンスルホンアミド（BTS） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 435600 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼタイプI </td><td>シグマ</td><td> C0130 </td><td></td></tr></tbody></table>設備： <ol><li>分光蛍光光度計（フォトンテクノロジーインターナショナル、NJ）：キセノンアークランプ、コンピュータ制御の高速ランダム·アクセス·モノクロ、キュベットベースの発光分光、ニコンTE-200倒立蛍光microscopE、S弗素40x/1.30油浸対物、PMT検出器。 </li><li>アルゴンレーザー453/477/488/514、HeNeレーザー543nm、ニコン倒立顕微鏡TE2000、60X対物レンズ（NA 1.4、油）：レーザー共焦点顕微鏡（BioRad社Radiance210​​0）をスキャンしています。 </li><li>倍率の実体顕微鏡&gt; 100（ツァイスSTEMI SV11 APO）。 </li></ol>

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

店は以前の容量性Ca 2 +のエントリと呼ばれる、Ca 2 +のエントリ（SOCE）を運営し、+枯渇小胞体（ER）や筋小胞体（SR）のCa 2 +ストアを補充する細胞に細胞外Ca 2 +の流入のために厳密に制御メカニズムです。 1,2。のCa 2 +ユビキタスセカンドメッセンジャーであるので、SOCEが増殖、アポトーシス、遺伝子の転写と運動性を含む細胞プロセスの様々な重要な役割を果たしているのを見て驚くことではありません。上皮細胞と骨格筋を含むほぼすべての細胞型で広い発生のため、この経路は、大きな関心3,4を受けています 。ただし、異なる細胞型と生理機能のSOCE特性の不均一性は、まだ5-7クリアされていません。 SOCEの機能チャネルのプロパティは、THIに関する知識の大きな体に対し、パッチクランプ法の研究によって明らかにすることができるの経路があるため、ハイスループットスクリーニングのため、その利便性と実現可能性の蛍光ベースの細胞内Ca 2 +測定によって得られている。このレポートの目的は、単層細胞、浮遊細胞や筋線維5,8-10でSOCEの活性化を測定するためにいくつかの蛍光ベースの方法を要約することである。最も一般的にこれらの蛍光法の使用は、直接細胞内Ca 2 +の動態を監視するために+ F 340nm、レシオメトリックのCa 2 +インジケーターフラ-2のF 波長380nm（発光波長510 nm）の比を使用しています。細胞内Ca 2から一方向SOCEの活性を分離するには+の放出とCa 2 +放出は、Mn 2 +クエンチアッセイが頻繁に使用されます。それは非常に高い親和性ウィットのために+ポンプ表面膜の押出プロセスまたはCa 2によってERの取り込みに不浸透性のある間のMn 2 +は SOCEを介して細胞に浸透することができることが知られているHフラ-2。その結果、細胞内に細胞外のMn 2 +のエントリによって誘発されるフラ-2蛍光の消光がSOCE 9の活性の測定を表しています。レシオメトリック測定とMn 2消光アッセイは、単一細胞を可視化する細胞集団モードまたは顕微鏡ベースのシステムでキュベットベースの蛍光光度計で実行することができます。単一細胞の測定の利点は、遺伝子操作を受け、個々の細胞は、遺伝子組み換えや変異細胞の研究をできるように、GFPまたはRFPレポーターを使用して選択することができることである。構造的に特殊な骨格筋でSOCEの時空間特性は、同時に二つの低親和性Ca 2 +の蛍光を監視することによって、肌の筋線維で達成することができるSRと、このようなにみたFluo-5Nとして筋線維の特定のコンパートメントを対象とした+の指標rhodo-の異形横細管9,11,12で5N。

ストア作動性Caの範囲<sup&gt; 2 +</sup&gt;エントリ（SOCE）は、蛍光Caを使用して監視することができます<sup&gt; 2 +</sup&gt;指標。 Mnは<sup&gt; 2 +</sup培養細胞や骨格筋線維のような指標アッセイSOCEの&gt;消光。機械的に皮筋線維の共焦点イメージングによるSOCEの空間分解能と時間分解能を可能にする技術も記載されています。

ストア作動性Ca2+流入（SOCE）は、かつて容量性Ca2+流入と呼ばれていたものであり、細胞内への細胞外Ca2+の流入を厳密に制御するメカニズムであり、...

この実験手法は、蛍光法を用いて、がん細胞および骨格筋細胞におけるストア作動性カルシウム流入（SOCE）の特性を明らかにするために用いられます。これは、細胞内カルシウム濃度に感度を持つURA2の蛍光を生存細胞で記録することによって達成されます。さらに、カルシウム濃度に非感度な波長においてマンガンを添加した際の蛍光消光速度を測定し、SOCEの活性化を直接的に反映させることでSOCEを解析します。構造的に特殊化した骨格筋細胞において、筋肉を解剖し、皮膜を除去します。筋線維を調製します。次いで、これらの線維を低親和性カルシウムインジケーターで処理し、内部の蛍光をモニターします。これらの手法により、SOCEが非興奮性細胞と骨格筋の両方に存在し、細胞内カルシウムストア量に密接に連動した段階的な活性化を示すことが実証されました。電気生理学やパッチクランプなどの他の手法と比較したこのフルオレセインベースの手法の主な利点は、使用が簡便であり、細胞集団の研究やハイスループットスクリーニングに適用できることです。正確な定量環境とマグニウム測定アッセイのために、適切な試薬を使用することが重要です。個々の装置はそれぞれ異なるため、装置ごとの校正が極めて重要です。単一筋線維の機械的な剥離プロセスは、特別な実技トレーニング、微小解剖技術への深い理解と習得、注意深い観察、そして多大な忍耐を必要とするため、この手法を視覚的に提示することは不可欠です。開始前に、URA2蛍光測定用に顕微鏡セットアップを校正してください。カルシウム結合型およびカルシウムフリーURA2の励起波長は340 nmおよび380 nmですが、特定の顕微鏡システムにおいて、カルシウム測定のためのURA2の最適なレシオダイナミックレンジは、他の波長で得られる場合があります。このような波長のシフトは、さまざまな光学部品が追加されることによる光路の変化に起因します。同様に、各システムのISO spastic pointも異なります。したがって、スペクトルスキャンによってこれらの波長を決定することが重要です。あるいは、最終的な値がカルシウム濃度に依存しないように、任意の2つの波長で蛍光を記録することでMingスクリーニングを行うことができます。まず、RFPを発現するプラスミドと、特定のHRNAまたはスクランブル配列のいずれかを含むプラスミドを、培養したK Ys SE 50細胞に48時間トランスフェクションします。トランスフェクションした細胞をガラス底ディッシュで培養します。次に、培地を除去し、平衡塩溶液（BSS）で細胞を洗浄します。洗浄後、2 µM の RA を含む BSS を 1 mL 加え、37 °C で 40 分間保持します。その後、細胞を室温で 15 分間置き、細胞内の URA 2:00 AM 型が URA two に変換されるようにします。その後、顕微鏡下でプレートをBSSで2回洗浄します。視覚化モードで、RFPを発現している細胞を選択します。エミッション波長を510 nanometersに設定し、エキサイテーション波長を350および390 nanometersに設定したエキサイテーション比モードを選択してください。比率は3番目のウィンドウに表示されます。次に、記録を行います。4種類の異なる溶液で細胞を灌流しながら、あらかじめ設定した波長での選択した細胞の蛍光を記録します。同様に、KYSE 150細胞にferra 2を導入し、記録を行います。励起比モードでは、前の手順とは異なり、等吸収点である360 nmを励起波長として選択します。次に、5種類の異なるBSS溶液で細胞を灌流しながら、360 nmと390 nmでの蛍光を同時に記録します。本プロトコルでは、マウス筋原細胞株であるC2C12細胞をガラスボトムディッシュでコンフルエントになるまで培養し、2.5%馬血清を含む分化誘導培地を用いて筋管細胞へと分化させる必要があります。C2C12筋管細胞に、BSS溶液で調製した最終濃度5 µMのRA 2:00 AMを添加し、40分間インキュベートします。その後、筋肉の収縮およびそれに伴うモーションアーチファクトを抑制するため、最終濃度20 µMのベンゾトリアルフリン（BTS）を添加します。細胞を室温で15分間インキュベートします。なお、すべての溶液はBTS含有とします。次に、4つのバランス塩溶液を灌流システムにロードします。既述の通りに行う。各灌流中に、選択した細胞の蛍光を360および390ナノメートルで記録する。本シリーズでは、マグネシウムイオンによるクエンチングをモニタリングするため、マグネシウムとthap argenを同時に投与する。小胞体カルシウムストアが枯渇している間。長趾伸筋（EDL筋）を摘出するには、安楽死させたマウスの脚を外側に向け、足首から膝にかけて皮膚を除去します。表層の筋肉層を切開してEDLを露出させ、上下の腱を両方とも切断して、無傷のEDL筋を遊離させます。腱の長さを可能な限り維持することが重要です。次に、収縮を防ぐため、実体顕微鏡下でEDLを0.1 millimolar EGTAを含みカルシウムを含まないT road溶液に移します。膝への挿入腱を2つに分け、EDL筋を2つの束に分離します。この工程を繰り返し、8束の束を採取します。腱が脱落した束がある場合は、その束を廃棄してください。次に、EDL束ストリップの両端の腱を掴み、ストリップを慎重に伸ばして、両側に腱組織が付着した状態で3〜4本の単一筋線維が分離して残るようにします。ガラス底ディッシュにカルシウムフリーTyro緩衝液を1滴滴下します。EDLストリップをディッシュ上に真っ直ぐに置き、速やかに溶液をできるだけ多く除去します。次に、耐水性のスコッチテープを用いて両方の腱をしっかりと固定します。まず、カルシウム不含溶液で繊維を洗浄し、次に2.5 mMのカルシウム溶液で2回洗浄します。繊維に過収縮が見られ、損傷が認められる場合はその繊維を廃棄し、選別した健全な筋繊維を洗浄溶液1で3回洗浄した後、修飾細胞内類似スキニング溶液に5分間浸漬させます。ピンホルダーに取り付けたタングステン針を用いて、実体顕微鏡下で機械的に繊維をスキニングします。これにより繊維が再封鎖され、横系管内にカルシウムと接合したRhod-5Nが捕捉されます。健全で単一の完全な筋線維、あるいは少なくとも腱の一部が付着したままの同種の線維束を得ることは、私の考えでは、その後の非常に困難な最終実験チャンバーへの線維転送と並んで、最も困難なステップの一つです。この過程で、線維が過収縮したり、あるいは断裂したりすることがあります。したがって、健全な線維が得られていれば、機械的なスキンニング自体はより容易になり、SRへの負荷もスムーズになります。20 µM の fluoxetine を含むスキンニング溶液中で線維をインキュベートしてください。インキュベーション後、洗浄液2を用いて十分に洗浄し、さらに30分間インキュベートして色素の脱エステル化を完全に進行させます。その後、関心領域において、60倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を用いて繊維を可視化します。繊維をSR loading溶液およびSR Depletion溶液で灌流させながら、各色素の蛍光を同時に記録します。KYS-SE 50細胞におけるSOCE活性を、細胞内カルシウム測定を用いて検討しました。細胞にはRFPおよびASOC1チャネルをコードするOR I 1遺伝子に対するショートヘアピンRNAを共導入し、コントロール（黒線で表示）と比較しました。OR I 1の発現をノックダウンした結果、SOCE活性の低下が認められました。KYS-SE 50細胞におけるSOCEは、マンガン消光法によっても確認されました。TGで小胞体カルシウムストアを完全に枯渇させた後、マンガンを添加したところ、蛍光強度が有意に減少しました。URA 2の信号消失の傾きがより急であることは、SOCEがより活性であることを示しています。したがって、2 A PB処理細胞における緩やかな蛍光減少は、この化合物によってSOCE活性が阻害されたことを示しています。マンガンによる消光速度は、消光が飽和せず線形範囲内にある最初の10秒間から決定されました。同様のマンガン消光アッセイを、培養筋細胞においても実施しました。本ケースでは、マンガンをTGと同時に投与しました。TGがSRのカルシウムストアを枯渇させるにつれて、蛍光消光の勾配が徐々に変化し、最大速度に達しました。このシグモイド曲線は、これらの実験条件下でSOCEが段階的に活性化されたことを示しています。共焦点イメージング下において、skinned fiberのT管（TT）コンパートメントにおけるrhodamine 5Nおよびdyneinのトラッピングは、レッドチャンネルで見られるように、哺乳類に特徴的なダブレットパターンを示しました。SRにrhodamine 5Nをロードした後、skinned fiberをTTSRロード溶液で灌流すると、グリーンチャンネルに典型的な点状のSRパターンが観察されました。SR枯渇溶液で灌流すると、rhodamine 5Nおよびfluo 5Nの両方の蛍光強度が上昇し、その後、SRコンパートメントおよびTTコンパートメントの蛍光レベルが低下し始めました。これは、SRカルシウムストアの枯渇とSOCEの活性化との間にそれぞれカップリングが存在することを示しています。このビデオを視聴することで、生存した極めて健康で完全な筋細胞を採取する方法について、十分に理解できるはずです。効果的な剥離プロセスを行うためには、筋線維の両端に十分な腱が残っている必要があり、これにより、実験者は生理学的に妥当で非常に利点の多い標本を得ることができます。本研究で使用されるすべての蛍光染料は通常、光に敏感であるため、暗所での負荷や暗室での洗浄などの予防策を、本手順の実施時に常に徹底してください。この手法を習得すれば、数時間で完了させることができます。推奨される方法は、まず複数の無傷の線維を得ることで、機械的な操作ステップの成功率を高めることです。また、分画後にこれらの線維を一夜培養したい場合にもこの方法が有効です。この手法は、カルシウムシグナリング分野の研究者が、がん細胞の増殖と死におけるストア作動性カルシウム流入の役割を探索する道を切り拓きました。筋肉における生理学的および病理学的機能。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、レーザー走査型共焦点顕微鏡を用いた生細胞における遅いフラックスから（マイクロ秒）急激なカルシウムのイベントを分離する方法を提示する。方法は、細胞に数百画素のラインスキャンを記録することによって、カルシウムの指標の蛍光強度の変動を測定する。ヒストグラム解析により、異なるカルシウムフラックスの時間スケールを分離することができます。...

心筋細胞における高速カルシウムフラックスの測定

出典: Heredia, D. J., et.al. マウスダイアフラムの三者シナプスにおける細胞特異的カルシウムシグナル伝達のex vivoイメージング. J. Vis. Exp. (2018)...

トランスジェニックマウスの横隔膜の神経筋接合部におけるカルシウム動態の蛍光イメージング

直接カルシウム火花を測定する方法は、ここにある説明のCa 2 +の基本単位は、無傷の骨格筋線維の筋小胞体からの放出。この方法では、孤立した筋線維におけるリアノジン受容体からのCa 2 +放出の浸透圧ストレス媒介トリガを利用しています。ダイナミクスおよび細胞内Ca 2 +シグナル伝達の恒常性能力は、健康および疾患における筋肉機能を評価するために使用することができる。...

無傷骨格筋線維内のカルシウムスパークスの評価

現在、ほとんどの利用可能なカルシウム指標は、培養平滑筋細胞の筋小胞体から放出されるカルシウムの間接的な測定値として、細胞質のカルシウム過渡現象を定量化するために使用されています。このプロトコルは、筋小胞体内腔内のカルシウムシグナルの直接測定を可能にする特定のFRETベースのインジケーターの使用を説明しています。...

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

ミトコンドリアは、それらが細胞内の細胞質ゾルのCa 2+シグナル伝達を形成することができ、カルシウム（Ca 2+）隔離する彼らの内膜（ΔΨm）を横切って電気化学ポテンシャルを利用することができます。我々は、同時に、蛍光色素、共焦点顕微鏡を使用して、生細胞中のミトコンドリアの Ca 2+取り込みおよびΔΨmを測定するための方法を記載します。...

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

ここでは、成人の筋肉組織からのヒト筋芽細胞の純粋な集団を得るための方法を説明する。これらの細胞は、in vitro骨格筋分化を研究するため、特にCa 2+シグナル伝達に関与するタンパク質を研究するために使用される。...

ヒト筋芽細胞の単離、筋分化の評価、および貯蔵操作カルシウムエントリー測定

この方法は、光遺伝学と遺伝的にコード化されたカルシウムセンサーを画像ベースラインサイトソリックカルシウムレベルおよびモデル生物C.エレガンスの体壁筋肉における誘発カルシウム過渡の変化に組み合わせる方法を提供する。...

C.エレガンス体壁筋肉における生体内カルシウムイメージング

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

本稿では、マウス第3中足骨の組織レベルの機械的負荷に応答して、 in vivo...

マウス骨細胞における負荷誘発カルシウムシグナル伝達ダイナミクスを研究するための蛍光生体内イメージングアプローチ

機能部位特異的蛍光法は、タンパク質ドメインの動きをリアルタイムで研究する方法です。天然細胞への適用のためのこの技術の修正は、マウス単離された骨格筋線維における電位依存性Ca2+...

骨格筋興奮性を研究するための天然細胞における機能部位特異的蛍光測定

この記事では、Fura-2/AM色素を用いたシングルセルCa2+イメージングを使用して、細胞内のカルシウムイオン(Ca2+)濃度をリアルタイムで定量的にモニタリングする方法を紹介します。この技術により、効率的な色素ローディングと、蛍光強度比によるCa2+レベルの正確な計算が可能になり、研究アプリケーションのためのシンプルで迅速なアプローチが可能になります。...

カルシウムイオンチャネルの活性化を研究するためのシングルセルカルシウムイメージング

学ぶストア作動性カルシウムエントリーの蛍光測定法。培養癌細胞と骨格筋線維を用いた生細胞イメージング技術で、細胞内カルシウム動態をリアルタイムに解析し、高スループットスクリーニングに応用可能です。

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

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