生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

この実験手法は、蛍光法を用いて、がん細胞および骨格筋細胞におけるストア作動性カルシウム流入（SOCE）の特性を明らかにするために用いられます。これは、細胞内カルシウム濃度に感度を持つURA2の蛍光を生存細胞で記録することによって達成されます。さらに、カルシウム濃度に非感度な波長においてマンガンを添加した際の蛍光消光速度を測定し、SOCEの活性化を直接的に反映させることでSOCEを解析します。

構造的に特殊化した骨格筋細胞において、筋肉を解剖し、皮膜を除去します。筋線維を調製します。次いで、これらの線維を低親和性カルシウムインジケーターで処理し、内部の蛍光をモニターします。

これらの手法により、SOCEが非興奮性細胞と骨格筋の両方に存在し、細胞内カルシウムストア量に密接に連動した段階的な活性化を示すことが実証されました。電気生理学やパッチクランプなどの他の手法と比較したこのフルオレセインベースの手法の主な利点は、使用が簡便であり、細胞集団の研究やハイスループットスクリーニングに適用できることです。正確な定量環境とマグニウム測定アッセイのために、適切な試薬を使用することが重要です。

個々の装置はそれぞれ異なるため、装置ごとの校正が極めて重要です。単一筋線維の機械的な剥離プロセスは、特別な実技トレーニング、微小解剖技術への深い理解と習得、注意深い観察、そして多大な忍耐を必要とするため、この手法を視覚的に提示することは不可欠です。開始前に、URA2蛍光測定用に顕微鏡セットアップを校正してください。カルシウム結合型およびカルシウムフリーURA2の励起波長は340 nmおよび380 nmですが、特定の顕微鏡システムにおいて、カルシウム測定のためのURA2の最適なレシオダイナミックレンジは、他の波長で得られる場合があります。

このような波長のシフトは、さまざまな光学部品が追加されることによる光路の変化に起因します。同様に、各システムのISO spastic pointも異なります。したがって、スペクトルスキャンによってこれらの波長を決定することが重要です。

あるいは、最終的な値がカルシウム濃度に依存しないように、任意の2つの波長で蛍光を記録することでMingスクリーニングを行うことができます。まず、RFPを発現するプラスミドと、特定のHRNAまたはスクランブル配列のいずれかを含むプラスミドを、培養したK Ys SE 50細胞に48時間トランスフェクションします。トランスフェクションした細胞をガラス底ディッシュで培養します。

次に、培地を除去し、平衡塩溶液（BSS）で細胞を洗浄します。洗浄後、2 µM の RA を含む BSS を 1 mL 加え、37 °C で 40 分間保持します。その後、細胞を室温で 15 分間置き、細胞内の URA 2:00 AM 型が URA two に変換されるようにします。

その後、顕微鏡下でプレートをBSSで2回洗浄します。視覚化モードで、RFPを発現している細胞を選択します。エミッション波長を510 nanometersに設定し、エキサイテーション波長を350および390 nanometersに設定したエキサイテーション比モードを選択してください。

比率は3番目のウィンドウに表示されます。次に、記録を行います。4種類の異なる溶液で細胞を灌流しながら、あらかじめ設定した波長での選択した細胞の蛍光を記録します。

同様に、KYSE 150細胞にferra 2を導入し、記録を行います。励起比モードでは、前の手順とは異なり、等吸収点である360 nmを励起波長として選択します。次に、5種類の異なるBSS溶液で細胞を灌流しながら、360 nmと390 nmでの蛍光を同時に記録します。

本プロトコルでは、マウス筋原細胞株であるC2C12細胞をガラスボトムディッシュでコンフルエントになるまで培養し、2.5%馬血清を含む分化誘導培地を用いて筋管細胞へと分化させる必要があります。C2C12筋管細胞に、BSS溶液で調製した最終濃度5 µMのRA 2:00 AMを添加し、40分間インキュベートします。その後、筋肉の収縮およびそれに伴うモーションアーチファクトを抑制するため、最終濃度20 µMのベンゾトリアルフリン（BTS）を添加します。

細胞を室温で15分間インキュベートします。なお、すべての溶液はBTS含有とします。次に、4つのバランス塩溶液を灌流システムにロードします。

既述の通りに行う。各灌流中に、選択した細胞の蛍光を360および390ナノメートルで記録する。本シリーズでは、マグネシウムイオンによるクエンチングをモニタリングするため、マグネシウムとthap argenを同時に投与する。

小胞体カルシウムストアが枯渇している間。長趾伸筋（EDL筋）を摘出するには、安楽死させたマウスの脚を外側に向け、足首から膝にかけて皮膚を除去します。表層の筋肉層を切開してEDLを露出させ、上下の腱を両方とも切断して、無傷のEDL筋を遊離させます。

腱の長さを可能な限り維持することが重要です。次に、収縮を防ぐため、実体顕微鏡下でEDLを0.1 millimolar EGTAを含みカルシウムを含まないT road溶液に移します。膝への挿入腱を2つに分け、EDL筋を2つの束に分離します。

この工程を繰り返し、8束の束を採取します。腱が脱落した束がある場合は、その束を廃棄してください。次に、EDL束ストリップの両端の腱を掴み、ストリップを慎重に伸ばして、両側に腱組織が付着した状態で3〜4本の単一筋線維が分離して残るようにします。

ガラス底ディッシュにカルシウムフリーTyro緩衝液を1滴滴下します。EDLストリップをディッシュ上に真っ直ぐに置き、速やかに溶液をできるだけ多く除去します。次に、耐水性のスコッチテープを用いて両方の腱をしっかりと固定します。

まず、カルシウム不含溶液で繊維を洗浄し、次に2.5 mMのカルシウム溶液で2回洗浄します。繊維に過収縮が見られ、損傷が認められる場合はその繊維を廃棄し、選別した健全な筋繊維を洗浄溶液1で3回洗浄した後、修飾細胞内類似スキニング溶液に5分間浸漬させます。ピンホルダーに取り付けたタングステン針を用いて、実体顕微鏡下で機械的に繊維をスキニングします。これにより繊維が再封鎖され、横系管内にカルシウムと接合したRhod-5Nが捕捉されます。

健全で単一の完全な筋線維、あるいは少なくとも腱の一部が付着したままの同種の線維束を得ることは、私の考えでは、その後の非常に困難な最終実験チャンバーへの線維転送と並んで、最も困難なステップの一つです。この過程で、線維が過収縮したり、あるいは断裂したりすることがあります。したがって、健全な線維が得られていれば、機械的なスキンニング自体はより容易になり、SRへの負荷もスムーズになります。20 µM の fluoxetine を含むスキンニング溶液中で線維をインキュベートしてください。

インキュベーション後、洗浄液2を用いて十分に洗浄し、さらに30分間インキュベートして色素の脱エステル化を完全に進行させます。その後、関心領域において、60倍の対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を用いて繊維を可視化します。繊維をSR loading溶液およびSR Depletion溶液で灌流させながら、各色素の蛍光を同時に記録します。

KYS-SE 50細胞におけるSOCE活性を、細胞内カルシウム測定を用いて検討しました。細胞にはRFPおよびASOC1チャネルをコードするOR I 1遺伝子に対するショートヘアピンRNAを共導入し、コントロール（黒線で表示）と比較しました。OR I 1の発現をノックダウンした結果、SOCE活性の低下が認められました。KYS-SE 50細胞におけるSOCEは、マンガン消光法によっても確認されました。TGで小胞体カルシウムストアを完全に枯渇させた後、マンガンを添加したところ、蛍光強度が有意に減少しました。

URA 2の信号消失の傾きがより急であることは、SOCEがより活性であることを示しています。したがって、2 A PB処理細胞における緩やかな蛍光減少は、この化合物によってSOCE活性が阻害されたことを示しています。マンガンによる消光速度は、消光が飽和せず線形範囲内にある最初の10秒間から決定されました。同様のマンガン消光アッセイを、培養筋細胞においても実施しました。

本ケースでは、マンガンをTGと同時に投与しました。TGがSRのカルシウムストアを枯渇させるにつれて、蛍光消光の勾配が徐々に変化し、最大速度に達しました。このシグモイド曲線は、これらの実験条件下でSOCEが段階的に活性化されたことを示しています。

共焦点イメージング下において、skinned fiberのT管（TT）コンパートメントにおけるrhodamine 5Nおよびdyneinのトラッピングは、レッドチャンネルで見られるように、哺乳類に特徴的なダブレットパターンを示しました。SRにrhodamine 5Nをロードした後、skinned fiberをTTSRロード溶液で灌流すると、グリーンチャンネルに典型的な点状のSRパターンが観察されました。SR枯渇溶液で灌流すると、rhodamine 5Nおよびfluo 5Nの両方の蛍光強度が上昇し、その後、SRコンパートメントおよびTTコンパートメントの蛍光レベルが低下し始めました。これは、SRカルシウムストアの枯渇とSOCEの活性化との間にそれぞれカップリングが存在することを示しています。

このビデオを視聴することで、生存した極めて健康で完全な筋細胞を採取する方法について、十分に理解できるはずです。効果的な剥離プロセスを行うためには、筋線維の両端に十分な腱が残っている必要があり、これにより、実験者は生理学的に妥当で非常に利点の多い標本を得ることができます。本研究で使用されるすべての蛍光染料は通常、光に敏感であるため、暗所での負荷や暗室での洗浄などの予防策を、本手順の実施時に常に徹底してください。

この手法を習得すれば、数時間で完了させることができます。推奨される方法は、まず複数の無傷の線維を得ることで、機械的な操作ステップの成功率を高めることです。また、分画後にこれらの線維を一夜培養したい場合にもこの方法が有効です。この手法は、カルシウムシグナリング分野の研究者が、がん細胞の増殖と死におけるストア作動性カルシウム流入の役割を探索する道を切り拓きました。

筋肉における生理学的および病理学的機能。