Name: 新しい多層フラスコを用いて哺乳動物細胞培養のスケールアップ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学ぶ多層フラスコを用いた哺乳動物細胞培養のスケールアップ手法。BD Falcon Multiフラスコで均一な細胞増殖を実現し、従来のT175フラスコ比で3〜5倍の収量向上が可能です。

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1。細胞培養用マルチフラスコを使用するプロトコル<ol><li> 船の調製と細胞懸濁液を追加 <ol><li>必要に応じて細胞増殖培地を準備。 </li><li>マルチフラスコ垂直作業面（滅菌層流フード）に上向きにキャップとの側面にラインアップ。 <ol><li> これらのフラスコは3で利用可能で、5層のフォーマットとT - 175フラスコと同様の作業の流れのパターンを使用してください。 </li></ol></li><li>緩め、キャップを取り外します。 50または100 mLのピペットを用いてフラスコにまたは注入によって予め温めておいた培地の必要な量を追加します。 <ol><li> マルチフラスコはキャップが上を向いて垂直に配置された場合≤10 mlの容器の底に達することができるものを薦めます。ピペット≥10ミリリットル、それによって血管へのメディアの大きなボリュームを追加する便利なポータルを提供する、マルチフラスコのロゴを過ぎてすぐに容器に到達することができます 。 </li></ol></li><li>培地の泡立ちを防ぐために、フロリダ州への液体の流れを許可するマルチフラスコの蓋（ロゴ側）の内壁に沿ってOW。 </li><li> 10 mLのピペットやキャップのフラスコを使用してトップ層を介して増殖培地中に濃縮された細胞株からの細胞懸濁液を追加します。 ヒント： -トランスポートインキュベーターのサイトへカートのマルチフラスコと残りの手順を実行します。 -細胞の播種密度は細胞の種類、培地および培養期間の必要性によって異なります。標準T - 175フラスコに使用されるものと播種密度およびメディアのボリュームで始まり、形式が使用されるマルチフラスコに応じて、3または5を掛けます。 </li></ol></li><li> 細胞の混合 <ol><li> ミックスポジションでは：あなたが直面しているロゴが直立マルチフラスコを持ち、あなたが直面しているミックスのポートと45 °の角度に反時計回し。 </li><li>最上層の液体が完全にdownwar排水溝まで、前面から背面（あなたから離れて、首）にマルチフラスコ優しくチルト、同じ角度に保持し混合ポートを介してDS。混合ポート側でピボット。 </li><li>媒体が混合ポートを介して上部に向かって底層から完全に排水されるまで同様に、ゆっくりとバックからフロント（あなたに向かって首）にマルチフラスコを揺らし。ステップ1.2.2と適切な混合を保証するために1.2.3つのより多くの時間を繰り返します。 </li><li>バックミックスポジション（ステップ1.2.1）へのマルチフラスコをもたらすと1.3に進んでください</li><li>別の方法として、細胞懸濁液は、マルチフラスコから外部に製造することができると細胞懸濁液をピペットを用いて容器にまたは穏やか注ぐことによって追加することができます。 <ol><li> ミックスポートは、メディアと細胞の混合、容器に可能になり、外部から細胞懸濁液を大量に作る必要がなくなります 。 </li><li> また、マルチフラスコの層を介してメディア等化を可能に </li></ol></li></ol></li><li> 流体の平衡 <ol><li>ミキシング/細胞懸濁液を追加した後、場所マルチフラスコ垂直に平らな作業台の上に液体の体積方程式を均一化するインディアナ州インディアナポリスのすべての体に含まれています。 </li></ol></li><li> 各レイヤーに分割する液体 <ol><li>あなたが直面しているロゴがマルチフラスコを押しながらレイヤーのそれぞれに分配へ45 °の角度液体に時計回りに。 ヒント： -最良の結果を得るには、ステップ1.3から1.4のために平らな作業台を使用することが重要です </li></ol></li><li> 交通 <ol><li>一度細胞懸濁液を含むメディアがパーティション化され、離れてインキュベーターにミックスのポートからメディアとステップ1.4.1と同じ45 °の角度（時計回り）でマルチフラスコを運ぶ。顕微鏡での表示用にインキュベーターからフラスコを取り外すときは、この位置にも適しています。 </li></ol></li><li> インキュベーター棚の上にマルチフラスコの配置 <ol><li>でマルチフラスコを保持して45 °の角度（時計回り、離れて混合ポートから）、静かに混合ポートから離れてコーナーを使用して（インキュベータの表面に水平に、それを下に回転させピボット）。ロゴを上に向けてマルチフラスコを置く。 <ol><li> ファルコンマルチフラスコのデザインは、船を積層することができますし、頑丈なスタッキングリブによって所定の位置にそれらを保持しています 。 </li></ol></li></ol></li><li> 細胞と試薬の配布 <ol><li>作業面に平らにマルチフラスコを配置した後、軽く前後に揺すり、サイド、サイドにそれぞれの層から液体をこぼさないように注意しながら培養表面に均一に細胞を配布する。フラスコを積み重ねる。 <ol><li> このフラスコは、光学的に透明な材料で作られており、最後の層上の細胞は容易に顕微鏡で見ることができます 。 </li></ol></li></ol></li><li> メディア交換 <ol><li>あなたが直面しているロゴと左に傾けるマルチフラスコ（ミックスのポート側）しながら吸引する。 </li><li>その後、すべての残留培地を吸引除去するために継続、右側に、マルチフラスコを傾けて。 </li><li>メディアの適切な量を追加し、ステップ1.3から1.7に従ってください</li></ol></li></ol> 2。マルチフラスコから収穫細胞<ol><li>垂直マルチフラスコアップセル、行を解離し、 位置 （ステップ1.2.1）を混在させるそれぞれをもたらすこと。ゆっくりと首がそのようなメディアは、マルチフラスコの最上層にドレインできるようにする必要が直面しているとフラスコを反転させる。 </li><li>あなたがミックスのポートの近くに液体のレベルに達するまで首〜5または10 mLの吸引先端を挿入します。疲れ培地を吸引除去する。 </li><li>解離試薬/洗浄バッファーを追加し、ステップ1.2.1のように位置をミックスにもたらす、次に進み、ステップ1.3から1.7に従ってください。増殖培地/中和剤で中和し、受信側のチューブに細胞懸濁液を注ぐOR細胞がに排出するようなフラスコを反転容器の上部層と10 mLのピペットを用いて細胞を集める。 ヒント ：アルからのメディアの完全な排水を可能にするために、細胞や試薬の回収を強化する位置（ステップ1.2.1）を混在させるマルチフラスコを持って、演算子に向かって首を逆にするには最上層へlの層。マルチフラスコが反転したままその後、チルトマルチフラスコは45 °の角度（離れてミックスのポートから）を時計回りに回し。残りの試薬を収集するためのピペット（1〜10 mL）を使用してください。 </li></ol> 3。ファルコンマルチフラスコの推奨作業量成長メディア 3層：マルチフラスコ当たり75〜150 mLの 5層：マルチフラスコあたり125〜250 mLの解離剤 3層：マルチフラスコ当り≥15 mLの 5層：マルチフラスコ当り≥25 mLの ヒント：標準のT - 175フラスコで使用される培地量で開始し、単位表面積当たりその溶解が変わらないように評価されたマルチフラスコに形式に応じて3〜5倍を掛ける。 4。代表的な結果： ファルコンマルチフラスコ1。設計 files/ftp_upload/3418/3418fig1.jpg"/&gt; 図1：マルチフラスコ細胞培養容器は、3でご利用いただけます-とスケールアップをそれぞれ525と875センチメートル2成長表面積を提供する細胞のための5層積み重ね可能なフォーマット。ピペットのアクセスは、ほかとに - と外容器の細胞と試薬の除去を容易にする。混合ポートの存在は、マルチフラスコの全層にわたってメディアの急速な炉内ミキシングとイコライゼーションが可能になります。 2 セルを使用して収量マルチフラスコ ： これらの船舶は、3に対応し、T - 175フラスコの5倍の表面積の3層と5層の形式で提供されています。のそれに応じて、≥3と5回（それぞれ130 ± 6.8 × 10 6および218 ± 23.6 × 10 6個の細胞、）数BHK - 21（ベビーハムスター腎臓）細胞がT - 175に比べて成長し、マルチフラスコから回収したフラスコ（43.2 ± 3.5 × 10 6細胞; Fig.2A）。 U当たりの細胞収率NITの表面積が3に相当した - と5層マルチフラスコおよびBHK - 21用T - 175フラスコ、LNCaPの（ヒト前立腺癌細胞株）、HEP - G2（ヒト肝細胞株）、ECOPACK 2から293まで（人間の腎臓細胞株）などの細胞のベンダー（ATCC、シグマおよび/またはクロンテック）が推奨する増殖培地中、48 96時間の期間（図2b）（層あたり35 ml）を培養した。細胞は自動でViセルカウンター（2）に列挙された。 <img alt="図2A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2A.jpg"> 図2A：BHK - 21細胞の3と5倍の数を増殖させ、回復3からされた-と5層マルチフラスコT - 175フラスコに比べて。期待利回りは、コントロールからの平均細胞収率を用いて決定したT - 175 3の3と5倍を掛けたフラスコ - と5層マルチフラスコそれぞれ（n = 4のフラスコ/フォーマット）。 <img alt="図2B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig2B.jpg"> 図2B：1cm 2当たりのセルの収率は3で同等であった-と5層マルチフラスコおよびBHK - 21用T - 175フラスコ、LNCaP細胞、HepG2およびEcoPack2 - 293細胞。各バーは、4〜6フラスコの平均値を表します。 BHK - 21細胞（11,000 cells/cm2）72時間、LNCaP細胞（20,000 cells/cm2）とEcoPack2 - 293細胞（〜35,000 cells/cm2）培養した、96時間およびHepG2細胞（25,000細胞/ cm 2のために培養した）収穫前に48時間培養した。 マルチフラスコの層の間で 3 メディアの分布 細胞培養培地（DMEM、Invitrogen）を5層マルチフラスコ（250 mL/5-layerの容器）に追加され、上述のプロトコールにしたがって層に分配した。メディアの分布は個々のレイヤーから送り出さ各レイヤとメディアに穴をあけることによって測定した。それぞれの層から回収された液体の重量を図3に示すように、層から層への比較的均一であることが判明した。それらは次の通りです：510.8 ± 0.73、50.3 ± 0.58、50.21 ± 0.13、49.88 ± 0.35、49.45 ± 0.37（GM）。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig3.jpg"> 図3。5層マルチフラスコの5層のそれぞれに一様メディア配信。細胞培養培地は、個々のレイヤーに平衡化＆パーテ​​ィション、マルチフラスコ（250 ml/5-layerの容器）に登録されました。メディアは、個々の層と流体の重量に開けた穴を通って圧送され、各層（n = 6フラスコ）から記録された。 マルチフラスコの層の間に 4 セルの分布 細胞は、マルチフラスコ内に添加して混合することができます。我々ビーズ（10μm以下、PolySciences社）を使用してマルチフラスコの層の間の細胞のシミュレートされた分布のセルのサイズに似て。ビーズの懸濁液を上部層を介して10 mLのピペットを使用してマルチフラスコ容器中に添加し、DESCなどの容器内のメディアと混合し、上記のプロトコルにribed。ビーズの分布は、ビーズ懸濁液を含む各レイヤーと流体の穴をあけることにより測定した個々の層から汲み上げられた。それぞれの層から回収したビーズ濃度はコールターカウンターで読み取られ、記録された。 3層マルチフラスコ（Fig.4A）に相当する層間ビーズのディストリビューションを以下に示します。混合ポートは、マルチフラスコの層の間の細胞や試薬の均一な分布を可能にします。 <img alt="図4A" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4A.jpg"> 図4A：3層マルチフラスコの三層のそれぞれのビーズの分布。記述されたプロトコルを用いて平衡化し、パーティションのステップが続く、との混合ビーズの懸濁液（3.6 × 10 6 / ml）をマルチフラスコ（巻：：メディアのボリュームが1:10である、巻ビーズ懸濁液）に分注した培地に添加した。それぞれの層（培地各レイヤーに開けた穴を通してポンプ）から回収されたビーズ濃度はコールターカウントに読まれましたERと記録。層マルチフラスコ（n = 5のフラスコ） - 3の等価な層間ビーズのディストリビューションは以下の通り以下のように補足した増殖培地で3層のマルチフラスコで&gt; 80％コンフルエントに培養した細胞のECOPACK 2から293染色パターンの代表的なイメージです。細胞単層を固定し、染色し、クリスタルバイオレットで、マルチフラスコの層は、その後切断され、画像は（2）スキャンした。 （注）、細胞のパターニングには、マルチフラスコ（Fig.4B）のすべての層で均質であった。同様の結果が複数の細胞型（データは示さず）評価が得られた。 <img alt="図4B" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig4B.jpg"> 図4Bは、次の図は、マルチフラスコの層の間に均一な細胞の成長を示しています。 3層マルチフラスコおよびT - 175で&gt; 80％コンフルエントまで増殖さECOPACK - 2 - 293細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色した。マルチフラスコの船が切断し、各染色された層がスキャンされた。 5 マルチフラスコ内の空気の供給。 96時間培養EcoPack2 - 293細胞からBioProfile FLEXアナライザ（3,4）（ノヴァバイオメディカル）使用済のメディアの分析では5層マルチフラスコ対T - 175フラスコ（81.03で培養した細胞の空気飽和に差は見られなかった± 1.9対83.4 ± 5.8パーセント、周囲O 2）。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3418/3418fig5.jpg"> 図5：費やしたメディアの空気飽和（％周囲のO 2）対T - 175フラスコ5層マルチフラスコからのプレミックスメディアで同等であった。 EcoPack2 - 293細胞を35000個/ cm 2の密度で播種し、前のメディア分析（n = 3のフラスコ）に96時間培養した。

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すべての著者は、ベクトンディッキンソン、バイオサイエンス事業、ディスカバリー実験器具ユニットの従業員です。

現在の研究では、マルチフラスコのデザインは、研究者を提供する生産性の増加を示しています。マルチフラスコを使用するときにパフォーマンスを最適化するために上記の手順に従うことが重要です、一方、最も不可欠とみなされるこのプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。これらは、に分割マルチフラスコフラットのポストを敷設層のそれぞれの（ⅲ）に流体をパーティショニング後に時計回りに45 °の角度でマルチフラスコを輸送容器（II）内で混合ポートを使用して、細胞や試薬の混合（i）は含まれていますインキュベーター。 マルチフラスコの適切な使用は、T - 175フラスコ（5）と合同な環境で培養されている各容器内に均一な細胞集団の生産につながる。これらの船舶は、T - 175フラスコと同様のフットプリントで3と5倍以上のセルを提供しています。 3と5層構造の容器にはそれぞれ、成長のエリアの525および875センチメートル2を提供し、スペースと労働の両方を提供ユーザーへのマイ。組織培養表面処理は、このようにスケールアップ、既存の培養条件を再最適化または細胞（6,7）の品質、均一性やパフォーマンスを犠牲にすることなく可能にする標準のフラスコに匹敵するものです。これはまた、以前に収集されたデータとの比較のために用意されています。これらの船舶は、肝8、kertainocytes 9、無血清培地で増殖させた幹細胞などの特定の細胞型の付着、増殖および分化のための専門的な基層を提供するために、また、ポリ- D -リジンなどコラーゲン、フィブロネクチンなどの試薬 ​​で被覆することができる製剤。コー​​ティング溶液は、前の細胞を培養するために貴重な試薬の浪費だけでなく、コーティング液の効果的な除去を低減するように最小限の残液の保持と削除することができます。層ごとに25〜50ミリリットルに変換0.142〜0.287ミリリットル/ cm 2とからマルチフラスコ範囲内の培養細胞への推奨される最適なメディアのボリューム。別の多層フラスコ、Tとは異なり、彼の製品はだけでなく、内と各容器の層の間の細胞や試薬の均一な分布を混合、容器の急速なことができる容器にミックスポートを提供しています。多様な細胞株、初代培養や幹細胞は、マルチフラスコを用いて効率的にスケールアップされています。これらの船舶は、ハイスループットスクリーニング、ワクチンの生産、ウイルスベクターのトランスフェクションと細胞治療のような多数のセルを要求するアプリケーションに特に有利である。 時間の節約は、スペース、労働力の減少、廃棄物発生量は、単層容器の従来の文化に対するマルチフラスコの主要な賞金です。我々は、文化5から収穫された細胞の約3倍の数、T - 175 3を使用して、同じ空間でフラスコ、5層マルチフラスコをすることができます。省スペースのこの利点は、T - 175にのみ限定されるものではなく、他の船舶に拡張することができます：一般的な実験室のインキュベーターハウスに収まる標準ローラーボトル装置〜4 ROL850センチメートル2表面の面積を提供するそれぞれのLERのボトル（2200ミリリットル）。同じエリアでは、〜20、5層マルチフラスコは、このように培養細胞に5倍の成長表面を提供する収納することができる。さらに、&quot;ゴーグリーン&quot;意識の高まりとともに、廃棄物の発生を削減するためのオプションは非常に望ましいことです。その点で、38％がT - 175フラスコ及びこれらの利点に比べてマルチフラスコを用いて廃棄物発生量の減少は、リード（5、T - 175フラスコ一、5層マルチフラスコは〜400グラムの重さに対し、〜640グラムの重さ）がある廃棄物の保管と廃棄のコストやユーザーへの経済的な節約の結果では減少する。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/装置の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ＃ </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 3層の組織培養処理した525センチメートル2 </td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 353143 </td><td rowspan="21"> <a href="http://www.bdbiosciences.com/cellculture/multiflasks/index.jsp">BDバイオサイエンス細胞培養- BDファルコンマルチフラスコ</a> </td></tr><tr><td> 5層の組織培養処理した875センチメートル2 </td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 353144 </td></tr><tr><td> 100ミリリットルピペット</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 357600 </td></tr><tr><td> 10ミリリットルピペット</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 357551 </td></tr><tr><td> 5ミリリットル吸引ピペット</td><td> BDバイオサイエンス</td><td&gt; 357501 </td></tr><tr><td> 50 mlのポリプロピレン製コニカルチューブ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352070 </td></tr><tr><td> T - 175フラスコの組織培養処理した</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 353028 </td></tr><tr><td>グラムクリスタルバイオレット</td><td> BD </td><td> 212525 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11885 </td></tr><tr><td> GMEM </td><td>シグマ</td><td> G5154 </td></tr><tr><td> RPMI - 1640 </td><td> ATCC </td><td> 30から2001 </td></tr><tr><td> MEM </td><td> ATCC </td><td> 30から2003 </td></tr><tr><td>トリプシン- EDTA </td><td>ロンザ</td><td> CC - 5012 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td>トリプトースリン酸塩ブロス</td><td>シグマ</td><td> T8159 </td&gt; </tr><tr><td> BHK - 21細胞</td><td>シグマ</td><td> 85011433 </td></tr><tr><td> HEP - G2、LNCaPの</td><td> ATCC </td><td></td></tr><tr><td> ECOPACK 2から293 </td><td>クロンテック</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 15710 </td></tr><tr><td>ポリスチレンビーズ</td><td> PolySciences株式会社</td><td> 24628〜20 </td></tr><tr><td>バイオプロファイルフレックスアナライザー</td><td>ノババイオメディカル</td><td></td></tr></tbody></table>

新しい多層フラスコを用いて哺乳動物細胞培養のスケールアップ

Scale-Up of Mammalian Cell Culture using a New Multilayered Flask

セルベースの​​アプリケーションの増加は、多数の細胞を必要とする。多数の細胞が必要な場合、小規模な拡張中に適切な単層のT -フラスコ、の用法は、、面倒な手間と時間がかかる場合があります。このニーズに対応するため、新しい多層細胞培養容器の性能はT -フラスコの単層からの細胞の容易なスケールアップ容易にするためには、議論される。 T - 175フラスコに比べて、と5層の形式とそれぞれの文化と完全な3の回収と細胞の5倍の数を有効にする - テストフラスコは3で利用可能です。 BDマルチフラスコの重要な特徴は、容器内の混合だけでなく、各容器の層内との間に細胞や試薬の一様分布として、一貫して環境という点で培養することができる細胞を生成急速なことができるミックス/平衡ポートです。 T - 175フラスコと合同です。 これらのマルチフラスコのデザインは、cが可能onvenientピペットで直接フラスコに試薬と細胞を加えるだけでなく、貴重な細胞や試薬の効率的な回収のためのアクセスとは注ぐによる汚染の危険性を低減します。注ぐがピよりも好まれているアプリケーションの場合、デザインは貴重な細胞と試薬の無駄を減らすように最小限の残液の保持が可能になります。

細胞は、研究に尽力し、さらなる役割を果たす、と発見と新しい治療法の開発。我々は添付ファイル依存性細胞の成長と収穫のためのより効率的かつ効果的な方法を必要とする細胞の数が多いためにこのニーズが高まっている。右側の機能を持つ多層フラスコは、この目的を果たすことができる。

細胞ベースのアプリケーションが増加しており、大量の細胞を必要とするケースが多くなっています。小規模な段階では十分である単層Tフラスコの使用は、...

この手順の目的は、3層または5層のBD Falcon Multiフラスコを用いて、生産性の高い均質な細胞を培養する方法を実証することです。まず、フラスコに培地を加え、細胞懸濁液を接種します。次に、内容物を混合および平衡化させ、均一に分散させます。3番目のステップは、輸送用パーティションに入れ、容器をインキュベーターに水平に設置することです。最後のステップは、マルチフラスコで培養した細胞を回収することです。新しい細胞培養デバイスを使用しているため、マルチフラスコのすべての層で均一に細胞が成長し、最終的にT 175フラスコと比較して3倍から5倍の細胞収量を回収することが可能です。操作手順を概念的に理解することが困難なため、本手法のビデオデモンストレーションを強く推奨します。マルチフラスコ細胞培養容器には、細胞のスケールアップ用に3層または5層のスタック可能な形式があり、それぞれ525および875平方センチメートルの増殖表面積を提供します。ピペットによるアクセスが可能なため、容器への細胞や試薬の添加および回収が容易になります。また、混合ポートを備えているため、マルチフラスコの全層にわたって培地を迅速に容器内で混合し、均一化することが可能です。細胞培養にマルチフラスコを使用するには、まず滅菌済みのラミナーフローフード内で、容器を横向きに垂直に置きます。キャップ側を上に向け、中身を入れる前にこの状態でマルチフラスコにラベルを貼り、キャップを緩めて取り外します。50から100 mLのピペットを挿入します。直ちにロゴに沿って、あらかじめ加温した細胞増殖培地を1層あたり35 millilitersずつマルチフラスコに直接加えます。培地の気泡混入を防ぐため、液流がマルチフラスコの内壁（ロゴ側）に沿って導入されるようにしてください。最後に、10 milliliter以下のピペットを用いて操作します。濃縮細胞ストックから実験用細胞懸濁液を成長培地の最上層に添加し、フラスコのキャップを締めます。これにより、細胞と培地の反転混合を容易にし、外部で大量の細胞懸濁液を調製する必要をなくします。マルチフラスコを持ち上げて、ロゴが自分の方を向くように直立させ、容器を反時計方向に45度の角度まで回します。その後、容器を同じ角度に保持します。マルチフラスコを、ネックを遠ざけるように前方から後方へゆっくりと傾け、上層の液体がミックスポートを通って完全に下方に流れ落ちるようにします。ミックスポートを軸にしてフラスコを回転させ、この動作を繰り返して、細胞と培地を十分に混合させます。その後、マルチフラスコを混合時の位置に戻します。細胞懸濁液を混合した後、マルチフラスコを平らな作業台の上に垂直に置き、すべての層で液量が均一になるようにします。最後に、液体を各層に分注します。前と同様に、ロゴが自分の方を向くようにマルチフラスコを持ち、容器を時計回りに45度の角度に傾けます。混合ポートに液体が入らないように注意します。細胞懸濁液の分注が完了したら、マルチフラスコを時計回りに45度の角度に保ち、培地が混合ポートから離れた状態のままインキュベーターまで運搬します。容器をこの角度に保持したまま、混合ポートとは反対側の角を支点にして、ロゴが上を向くようにマルチフラスコを水平にゆっくりとインキュベーターの表面に下ろします。その後、容器を前後左右にゆっくりと揺らし、細胞を培養面に均等に分散させます。各層から液体がこぼれないように注意しながら、容器を積み重ねます。インキュベーターに入れた後、容器をもう一方の容器の上に水平に置く際、培地が分離したままであり、混合ポートから離れていることを確認してください。まず、ロゴが内側を向くようにマルチフラスコを垂直に持ちます。次に、5 mLのアスパイレーティングチップを挿入し、使い切った培地を排出して吸引を完了させます。マルチフラスコを反時計回りに45度傾けた状態で容器を内側に反転させ、最大限に回収できるよう吸引を続けます。容器を内側に反転させたまま時計回りに傾け、解離前にミックスポートとは反対側の隅にある残液を吸引してください。必要に応じて、細胞単層をPBSで洗浄し、廃棄容器に吸引します。次に、トリプシンEDTA解離試薬を加え、容器を混合位置に戻します。先ほど示したように、試薬を各層に均等に分配・平衡化した後、フラスコを37 °Cで所定の時間インキュベートします。不活化試薬内で溶液を中和し、混合・平衡化および分画の手順を繰り返した後、細胞懸濁液を回収チューブに注ぎます。最後に、マルチフラスコを混合ポートとは反対方向に、時計回りに45度の角度に傾けます。このとき、容器を逆さまの状態に保持してください。ピペットを使用して、残っている試薬をすべて回収します。細胞濃度を決定するため、細胞数カウント用の分注液を採取します。3層マルチフラスコで増殖培地を使用する場合、細胞培養培地の推奨量は75から150 milliliterです。5層マルチフラスコを使用する場合、1容器あたり最大125～250 mLまで培養することが可能です。解離剤については、3層マルチフラスコでは15 mL以上、5層マルチフラスコでは25 mL以上の添加が可能です。この棒グラフに示されているように、3層および5層マルチフラスコを用いて培養および回収したベビーハムスター腎細胞数は、T 175フラスコと比較して3～5倍となりました。この図から、ベビーハムスター腎細胞において、単位表面積あたりの細胞収量は、3層および5層のマルチフラスコとT 1 75フラスコで同等であることがわかります。また、ヒト前立腺腺がん細胞株、ヒト肝がん細胞株、およびヒト腎細胞株eco pack 2 2 9 3についても、これらのデータのために適切な増殖培地で培養しました。5層マルチフラスコに培地を加え、各層に分注した。前述のプロトコルに従い、個々の層に穴を開け、各層から培地をポンプで吸い出して測定した。各層から回収された液体の重量は層間でほぼ均一であり、容器全体に培地が均等に分布していることが確認された。この図における分画後、細胞と同程度のサイズのビーズを用いて、マルチフラスコ内の各層間における細胞の模擬分布が行われ、各層で計測されたビーズ数としてデータに示されています。混合ポートにより、マルチフラスコの各層間でビーズと試薬の均質な分布が可能となりました。ここでは、3層マルチフラスコ内でコンフルエンスが80%以上に達するまで培養した細胞の染色パターンの代表的な画像を示します。補完された増殖培地において、クリスタルバイオレットで固定および染色された細胞単層が示されています。マルチフラスコの各層を切り出し、画像をスキャンしました。マルチフラスコのすべての層において、均質な細胞パターニングが形成されていることに注目してください。この最終図は、Bio Profile FLEXアナライザーを用いて、ヒト胚性腎細胞培養から96時間後に回収した消費培地の分析データをしたものです。5層マルチフラスコとT 175フラスコの各層から回収した培地の間で、空気飽和度に差は認められませんでした。このビデオを視聴することで、生産性を向上させるためのマルチフラスコの使用方法について十分に理解できたはずです。

scale-up-of-mammalian-cell-culture-using-a-new-multilayered-flask

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Biology

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新しい多層フラスコを用いて哺乳動物細胞培養のスケールアップ

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