Name: マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 16 s
Description: 学ぶマイクロ流体液滴プラットフォームの蛍光検出法。フローフォーカシングとT字接合による液滴生成、共焦点顕微鏡を用いた高感度検出、単細胞封入と混合プロセスマッピングの手法を解説します。

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EPSRC、HFSP、韓国の国立研究財団（助成番号R11 - 2009 - 044 - 1002 - 0K20904000004 - 09A050000410）：著者は、以下の研究会と助成金の支援を感謝したい。

<ol><li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-368 (2006).</li>
<li>Zheng, B., Angew, I. smagilov, F, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Approach+for+Screening+Submicroliter+Volumes+against+Multiple+Reagents+by+Using+Preformed+Arrays+of+Nanoliter+Plugs+in+a+Three-Phase+Liquid%2FLiquid%2FGas+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Approach for Screening Submicroliter Volumes against Multiple Reagents by Using Preformed Arrays of Nanoliter Plugs in a Three-Phase Liquid/Liquid/Gas Flow.</a> Chem. Int. Ed. 44, 2520-2520 (2005).</li>
<li>Huebner, A., Sharma, S., Srisa-Art, M., Hollfelder, F., Edel, J. B., Demello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdroplets%3A+A+sea+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microdroplets: A sea of applications.</a> Lab on a Chip. 8, 1244-1244 (2008).</li>
<li>deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+detection+of+chemical+reactions+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control and detection of chemical reactions in microfluidic systems.</a> Nature. 442, 394-394 (2006).</li>
<li>Thorsen, T., Roberts, R. W., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+pattern+formation+in+a+vesicle-generating+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device.</a> Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4163 (2001).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dispersions+using+%22flow+focusing%22+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Appl. Phys. Lett. 82, 364-364 (2003).</li>
<li>Casadevall i Solvas, X., Srisa-Art, M., deMello, A. J., Edel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+Fluidic+Mixing+in+Microdroplets+with+1+%CE%BCs+Time+Resolution+Using+Fluorescence+Lifetime+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mapping of Fluidic Mixing in Microdroplets with 1 μs Time Resolution Using Fluorescence Lifetime Imaging.</a> Anal. Chem. 82, 3950-3950 (2010).</li>
<li>Robinson, T. A., Schaerli, Y., Wootton, R., Hollfelder, F., Dunsby, C., Baldwin, G., Neil, M., French, P., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+background+signals+from+fluorescence+thermometry+measurements+in+PDMS+microchannels+using+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Removal of background signals from fluorescence thermometry measurements in PDMS microchannels using fluorescence lifetime imaging.</a> Lab. Chip. 9, 3437-3441 (2009).</li>
<li>Huebner, A., Srisa-Art, M., Holt, D., Abell, C., Hollfelder, F., deMello, A. J., Edel, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chem. Commun. 1218, (2007).</li>
<li>Edel, J. B., Eid, J. S., Meller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+single+molecule+FRET+efficiency+determination+for+surface+immobilized+DNA+using+maximum+likelihood+calculated+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Accurate single molecule FRET efficiency determination for surface immobilized DNA using maximum likelihood calculated lifetimes.</a> J. Phys. Chem. B. 73, 2986-2990 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、マイクロ流体デバイスの製造、液滴の形成と試薬のカプセル化と、処理液滴の光学的に検出するための実験のセットアップと関連プロトコルを記述している。 （液滴内の単一細胞の検出と流れる滴内部の混合プロセスのマッピング）を選択した二つの例は、現在、液滴のマイクロフルイディクスを検討されている一般的なアプリケーションを表します。 提示の実験が示すように、液滴マイクロ流体プラットフォームの使用は、しかし、そのような高スループット、準最適な閉じ込め、高い再現性...生産、大量の情報およびこの情報が作成されている時に高速などの特定の魅力的な特性を、提示完全な利点は、これらの小型のプラットフォームから得られるかどうか、高時空間分解能を持つ高速な検出方法を使用する必要があります。このケースではこれがであることを示している高精度の蛍光分光技術を使用して可能。特に、FLIMの検出技術は、（数nsと短い繰り返し周期とパルスレーザーを利用する）急速に流れる滴（1秒間に200前後の）から、非常に高速な情報を取得する能力を明らかにする。この場合、検出されたイベントの時間分解能は1μsと低かった。液滴の大きさと濃度の限界の面では、より大きな開口数のレンズと大きな出力レーザーの使用が容易に5μmの（液滴の大きさの制限は、フォトリソグラフィの解像度によって課されているような小さな液滴内nMの濃度の検出を可能にするでしょうサブミクロンの位置決めステージの製造プロセスと）。 マイクロ流体の液滴は下に単一のターゲット/イベントに、試薬の少量を含む大規模な実験を実施するために理想的な候補です。この技術の現在の制限は、DRを生成するために困難を伴うハイスループットな方法でさまざまなソースの大規模な様々な（数十または数百）からoplets。さらに、生成された各単一液滴をターゲットにして操作する難しさは、これらの技術の実用性には厳しい制限を課している。したがって、これらの問題は、マイクロ流体液滴のプラットフォームは、高スループットのアプリケーションの研究と分析の標準的な参照方法になることを可能にする必要な技術的ソリューションの開発を目指した重要な研究努力の中心になります。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>フルオレセイン5 - イソチオシアネート（FITC） </td><td>試薬</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F3651 </td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-のAlexa Fluor ® 488 </td><td>試薬</td><td>分子プローブ</td><td> S11223 </td></tr><tr><td> Perfluorodecalin </td><td>試薬</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P9900 </td></tr><tr><td> 1H、1H、2H、2H - perfluorooctanol </td><td>試薬</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 370533 </td></tr><tr><td> Sylgard 184シリコーンエラストマーキット</td><td>試薬</td><td>プレミアファーネル英国LTD </td><td> 1673921 </td></tr><tr><td>オーラミン- O </td><td>試薬</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 861030 </td></tr><tr><td> 485 nmのパルスダイオードレーザー</td><td>機器の</td><td> PicoQuant </td><td> LDH - PC - 485 </td></tr><tr><td> TCSPCカード</td><td>機器の</td><td> PicoQuant </td><td> TimeHarp 100 </td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー</td><td>機器の</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td> z488rdc、 </td></tr><tr><td>顕微鏡の目的</td><td>機器の</td><td>オリンポス</td><td> UPLSAPO 60XW </td></tr><tr><td>アバランシェフォトダイオード</td><td>機器の</td><td> AQR - 141、EG＆G、パーキンエルマー社製）。 </td><td> AQR - 141 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> ABCD1234 </td></tr><tr><td> SYTO9 </td><td>試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> S34854 </td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> P3566 </td></tr><tr><td>大腸菌上位10菌株</td><td>細胞</td><td>インビトロジェン</td><td> C4040 - 10 </td></tr></tbody></table>

マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

化学と生物学を行うためのマイクロ流体プラットフォームの開発は、大部分のシステムの小型化に伴う潜在的な利益の範囲によって駆動されています。利点は、効率的にサンプルのfemotoリットルのボリューム、機能コンポーネントの容易な統合、大規模な多重化、強化された分析のスループット、改良されたコントロールと減少楽器の足跡に向けた本質的な素因ナノに処理する能力が含まれています1。 近年では多くの関心は、液滴ベース（またはセグメント化されたフロー）マイクロ流体システムとハイスループット実験のプラットフォームとしての可能性の開発に焦点を当てている。ここでは2-4、油中水型のエマルジ ​​ョンが自発的にマイクロ流体チャネルで形成するように作られて2つの不混和相の間のキャピラリー不安定の結果として。重要なのは、正確に定義されたボリュームや組成の微小液滴は、周波数で発生させることができます数kHzの。さらに、連続的な不混和相、サンプルのクロストークの両方と分散（拡散およびテイラーベース）で区切られた、分離区画内で関心の試薬をカプセル化することによって除去することができる、これは最小限のクロスコンタミネーションと時間分析プロセスをする能力につながる偉大な精度で。さらに、液滴の内容とチャネル壁（連続相によって湿潤されている）の間には接点がないので、チャネル壁上に試薬の吸収と損失が防止される。 この種の液滴が生成され、処理された後は、必要な分析情報を抽出することが必要です。この点では選択肢の検出方法、検出の高感度と低制限を提供する、迅速でなければならない、分子種の範囲に適用可能である、非破壊的であると安易な方法で、マイクロ流体デバイスと統合することができるようになります。このニーズに応えるために、我々はとして開発しました。実験的なツールと小音量の環境からの光物理大量の情報の抽出を可能にし、物理的、化学的、生物学的パラメータの広い範囲の分析に適用可能なプロトコルのuite。ここにこれらのメソッドの二つの例を提示し、単一細胞とピコリットル容量の液滴内部の混合プロセスのマッピングの検出に適用されます。我々は、マイクロ流体チップ製造、光学セットアップおよび液滴の生成と検出のプロセスを含む全体の実験的なプロセスを報告する。

彼らはkHzのレートで安価にピコリットル、自己区分血管を生成することができるので、液滴ベースのマイクロ流体プラットフォームは、ハイスループットの実験のための有望な候補である。 、高速で高感度かつ高分解能蛍光分光学的手法との統合により、これらのシステム内で発生する大量の情報を効率的に、抽出活かされ、利用することができます。

化学および生物学を実施するためのマイクロフルイディクス・プラットフォームの開発は、主に以下のような一連の潜在的な利点によって推進されてきました。

こんにちは、ジャージーです。こんにちは、シャビです。私たちはロンドン・インペリアル・カレッジのポストドクトラル研究員で、アンドリュー・ディ・メロ教授とジョシュ・デル博士のもとでマイクロ流体ドロップレットプラットフォームの研究に取り組んでいます。ドロップレットベースのマイクロ流体プラットフォームは、非常に高精度に定義された容量で液滴を生成でき、その生成頻度は毎秒数キロヘルツに達することもあるため、より高スループットな実験を実現するための有望な候補となっています。さらに、関心領域をわずか数リットルほどのコンパートメントに封入できるため、クロストークと分散の両方を排除でき、分析プロセスのタイミングをより正確に制御することが可能です。当研究グループでは、ポリメラーゼ連鎖反応、ナノ粒子合成、単一分子細胞アッセイなど、多くのアプリケーションにマイクロドロップレットプラットフォームを導入し、すでに成果を上げています。これらのシステム内で生成される大量の情報は、効率的に抽出、活用、および利用される必要があります。この点において、最適な検出方法は、適切であること、高感度で低い検出限界を提供すること、幅広い分子種に適用可能であること、非破壊的であること、そしてマイクロ流体デバイスに容易に統合できることが求められます。このニーズに応えるため、我々は、小容量の環境から大量の物理情報を抽出することを可能にし、広範囲の物理的、化学的、および生物学的因子の分析に適用可能な、一連の実験ツールとプロトコルを開発しました。本プロトコルでは、液滴（Dropbox）内での単一細胞の検出および混合プロセスのマッピングに適用される2つの手法を提示します。マイクロ流体チップは、通常、フォトリソグラフィ法を用いてポリジメチルシロキサン（PDMS）で製作されます。このプロセスは、クリーンルーム施設で実施する必要があります。まず、シリコンウェハー上にSU-8 50をスピンコートし、ホットプレートを用いて65 °Cおよび95 °Cでソフトベークして、溶媒を蒸発させ膜を緻密化させます。冷却後、適切なマスクを用いてSU-8レジストにUV照射を行い、その後、冷却してウェハーを65 °Cおよび95 °Cでベークします。適切な現像液を用い、攪拌しながら未露光領域を現像します。新鮮なEC溶媒でウェハを洗浄し、その後ガスで乾燥させて清潔な表面を作成します。ヘキサンおよびメタノールを用いてウェハを洗浄します。また、エステートマスターの作製工程を完了させるために、デシケーター内で表面に固定剤を40分間蒸着させます。構造化されたマイクロ流体基板を形成するには、樹脂架橋剤とS guard 1 8 4を10:1の比率で混合し、これをマスターの上に流し込みます。これをデシケーター内で脱泡し、デバイスを65 °Cで硬化させます。硬化したPDMSを切り出し、マスターから剥がします。バイオプシーパンチを用いて、流体チューブ用のアクセスホールを作成します。さらにPDMSの層を重ね、65度で20分間硬化させます。準備した上層を下層の上に重ね、65℃で一晩キュアします。ペトリ皿からチップを剥がし、細かく切断します。チップの作製が完了したら、目的の溶液を注入して使用できます。必要な溶液をシリンジに充填し、チューブのどの部分にも気泡が残っていないことを確認します。液滴生成には2つの相を使用します。水溶性分散相には、目的の試薬が含まれています。油相を連続相として機能させます。シリンジ針先の先端と同じ内径のチューブを針に装着し、シリンジをシリンジポンプにセットして、目的の注入流速を設定します。各相について、水相によるPDMSの濡れを防ぎ、液滴形成の不安定化を回避するため、油相と水相の流速比は最低でも1以上であることが推奨されます。チューブの反対側の端を、PDMS基板に開けられた穴に直接接続します。より複雑な溶液を用いる場合は、シリカ、キャピラリーポート、またはコネクタを導入することも可能です。チップの出口ポートをチューブに接続し、廃棄物回収用またはさらなる分析処理用のコレクターに導きます。このセットアップが完了すると、液滴を生成するためのマイクロチャネルの主な構成として、フローフォーカシング形式またはT字ジャンクション形式の2種類が利用可能です。これは、これらの形状を用いて2つの許容流体を合流させることで生じるせん断力と、それに続いて界面に形成される毛管不安定性によるものです。数フェムトリットルほどの微小な単分散液滴が自発的に生成されます。液滴が生成されると、光学系を用いてそれらをプローブすることができます。光学系のセットアップは以下のプロトコルに従って行います。自動サブミクロンポジショニング機能を備えた共焦点顕微鏡と、使用する蛍光色素の吸収波長に適合した波長のレーザーを使用します。蛍光寿命イメージングでこれらを励起させるには、数MHzの繰り返し周波数で動作するパルスレーザーを使用します。痰の実験では、ビームステアリングミラーと光学系を用いて、ビームの方向だけでなくビームの高さも制御します。ダイクロイックミラーを使用して、レーザービームを対物レンズに反射させます。2本のレーザーを同時に使用する場合は、デュアルバンドダイクロイックミラーを設置できます。2本のレーザービームを反射させ、マイクロ流路内でレーザー光を鋭く集光させるために、無限遠補正の高開口数NA顕微鏡対物レンズを使用してください。同一の高NA対物レンズを用いて、マイクロ流路チャネル内の試料から放出される蛍光を収集し、同一のダイクロイックミラーを透過させます。シングルバンドまたはデュアルバンドの放出フィルターを用いて、残留している励起光を除去します。蛍光放出を75 µmのピンホールに集光させます。平凸レンズを使用します。ピンホールを顕微鏡対物レンズの共焦点平面に配置してください。別のダイクロイックミラーを使用して、蛍光信号を2つの検出器に分割します。ダイクロイックミラーで反射された蛍光をエミッションフィルターでフィルタリングし、平凸レンズを用いて第1検出器に集光させます。2つ目の赤色蛍光色素を用いる実験では、ダイクロイックミラーを透過した蛍光を別のエミッションフィルターでフィルタリングし、さらに別の平凸レンズを用いて第2検出器に集光させます。蛍光光子の検出にはアバランシェフォトダイオードを使用してください。蛍光データの収集には、アバランシェフォトダイオード検出器からの電子信号を、パーソナルコンピュータで動作するデータロギング用の多機能DAQデバイスに接続します。痰を用いた実験では、パルスレーザーを使用し、検出器を別のPCに搭載された時間相関単一光子計数（TCS）PCカードに接続します。このカードを用いることで、蛍光寿命データの取得が可能になります。TCS PC法を用います。検出された個々の蛍光フォトンの入射レーザーパルスとの相関をとることで、放出された各蛍光フォトンの遅延時間が割り当てられます。このデータを単一または多重指数関数的な減衰曲線にフィッティングさせることで、蛍光分子の放射速度の推定値を得ることができます。細胞は生物学的、物理的、および化学的な視点から非常に不均一であることが分かっています。したがって、理想的には、個々の細胞を一つずつ解析すべきです。しかし、信頼性と意義のある結論を導き出すために十分な定量的情報を収集するには、アッセイを高スループットで実施する必要があります。ここでは、単一の水滴内にE. coli細胞を封入する例を示し、その実施方法を説明します。一晩培養したE. coli Top 10株を使用してください。細胞の生存率を検出するために、Cyto 9およびプロピジウムヨードを使用します。どちらの染料もDNAインターカレーション染料であり、その蛍光強度は20倍以上に増加します。DNAに結合すると、SYTO 9は膜透過性を持つ緑色蛍光染料として機能し、プロピジウムヨードは膜不透過性の赤色蛍光染料として機能します。したがって、生存細胞は緑色の蛍光を発し、死細胞は緑色と赤色の両方の発光を示します。ここでは、Tジャンクションによる液滴の生成と単一細胞の封入を確認できます。このビデオは高速カメラで撮影されましたが、液滴は1秒間に数千個の速度で生成することが可能です。細胞を封入する際は、生成される液滴よりも細胞数が少なくなるように細胞培養液を希釈し、シリンジやチューブ内で起こりうる細胞の沈降を防ぐ必要があります。シリンジ内にマグネチックスターラーバーを使用し、細胞が溶液中に均一に分散した状態を維持してください。シリンジとマイクロチップの接続には、50 µmという非常に細いチューブを使用してください。これにより、チューブ内の流速が速くなり、細胞の沈降を防ぐことができます。以下は、細胞を用いた実験における時間関数としての光子計数の代表的な例です。液滴内の混合プロセスのマッピングに使用します。寿命の異なる2種類のフルオロフォアを用いて液滴を生成することができます。流動する液滴内では流れ場が形成され、最終的に、元々分離していた2つの溶液が混合されることで混合プロセスが促進されます。曲がりくねったチャネルを使用することで、流れ場の対称性を変化させることが可能です。液滴をプローブするため、液滴が流れているマイクロチャネルの高さ半分に光学プローブ体積を合わせ、チャネルの一端から開始して、チャネル幅全体にわたり1 µm間隔で各実験を行います。液滴に由来する単一のバーストをオイル相のノイズ背景から区別し、各バーストの持続時間を決定するためのアルゴリズムを実装してください。次に、実験が行われた特定の幅において、各液滴の長さに沿った遅延時間と強度の値を抽出するための2つ目のアルゴリズムを実装します。その後、最大尤度推定（MLE）アルゴリズムを用いて、実験における各液滴の蛍光寿命を評価します。実験に使用したすべての液滴の寿命値を平均化することで、MLE計算による最終的な誤差を低減させることができます。より多くの液滴をプローブするほど、寿命の軌跡が得られた後の誤差は小さくなります。各幅について、すべての軌跡を2Dマップに統合します。各寿命値は2つの蛍光色素の特定の混合比に関連しているため、これにより濃度マップまたは混合マップを得ることができます。本稿では、マイクロデバイスの作製方法、実験装置、およびそれに付随するマイクロドロップレットの生成、領域のカプセル化、およびそのプロセスであるドロップレットの光学検出に関するプロトコルについて説明しました。具体例として、ドロップレット内における単一細胞の検出と、ドロップレット内部での混合プロセスのマッピングの2点を選択しました。これらは、現在ドロップレットマイクロフルイディクスを用いて研究されている一般的なアプリケーションを代表するものです。提示した実験が示すように、液滴マイクロ流体プラットフォームの使用には、完全な封じ込めによるハイスループットや再現性の向上といった魅力的な特性があります。また、生成される情報量が膨大であり、その生成速度も極めて速いため、これらの小型化プラットフォームの利点を最大限に活用するには、極めて高い時空間分解能を持つ高速検出法の利用が必要となります。本事例では、高精度なフルオラス分光技術を用いることで、これが可能であることを実証します。

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