マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

こんにちは、ジャージーです。こんにちは、私の名前はシャビで、私たちは両方ともインペリアルカレッジオブロンドンのポスドク研究員であり、アンドリュー・ディメロ教授とジョシュ・デル博士とともにマイクロ流体液滴プラットフォームに取り組んでいます。液滴ベースのマイクロ流体プラットフォームは、非常に正確に定義されたボリュームで生成でき、その競合により、生成頻度が数キロパースにもなるため、より高いスループット実験の候補として有望です。

さらに、関心領域を数リットルからコンパートメントに封入できるため、クロストークと分散の両方を排除でき、分析プロセスのタイミングをより正確に行うことができます。私たちのグループでは、すでにマイクロ液滴プラットフォームを多くのアプリケーションに実装することに成功しています。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ナノ粒子合成、および単一分子細胞アッセイ。

これらのシステム内で生成される大量の情報は、効率的に抽出、活用、および活用する必要があります。この点で、選択する検出方法は正しく、高感度で検出限界が低く、さまざまな分子種に適用でき、非破壊的であり、マイクロ流体デバイスと簡単に統合できる必要があります。このニーズに対応するため、私たちは、少量の環境から大量の物理情報を抽出でき、さまざまな物理的、化学的、生物学的なトールの分析に適用できる一連の実験ツールとプロトコルを開発しました。

このプロトコルでは、Dropboxでの単一細胞の検出と混合プロセスのマッピングに適用される方法を紹介します。マイクロ流体チップは、従来、フォトリソグラフィー法を使用してポリジメチルスローンPGMSで製造されていました。このプロセスは、マイクロ流体チャネルSpinco、シリコンウェーハ上のSU 8 50を65度と95度のホットプレートでホットプレート上でソフトベークして溶媒を蒸発させ、冷却後にフィルムを緻密化するためにクリーンルーム施設で実施する必要があります。 次に、冷却後にウェーハを65度と95度で焼きます。

攪拌しながら、適切な現像液を使用して露出していない領域を開発します。新しいEC溶剤を使用してウェーハをすすぎ、ガスで乾燥させて表面をきれいにします。ウェーハをヘキサンとメタノール洗浄で処理します。

また、エセートマスターの製造プロセスを完了するには、焼き付き剤を乾燥させて表面に40分間蒸発させます。構造化されたマイクロ流体基板を形成するために、Sガード1 8 4を樹脂架橋剤の比率10対1で混合し、これをマスター上に引っ張ります。これを乾燥させて脱気し、デバイスを65度で硬化させます。

硬化したPDMSをカットし、マスターから剥がします。生検パンチを使用して流体チューブ用のアクセスホールを作成します。PDMSの別の層を65度で20分間硬化させます。

準備した最上層を最下層に置き、65度で一晩硬化させます。ペトリ皿とさいの目に切ってチップをはがします。チップが製造されると、目的の溶液を注入して使用する準備が整います。

シリンジに必要な溶液を充填し、チューブのどの部分にも気泡が残らないようにします。液滴生成には、2つのフェーズが使用されます。水性分散相には、目的の試薬が含まれています。

油相は、シリンジの針先と同じ内径の連続相適合チューブとして機能し、針の一端にシリンジを取り付け、シリンジポンプにシリンジを取り付け、所望の注入流量を定義します。各相について、水相によるPDMSの濡れを防ぎ、不安定な液滴形成につながる油水性流量の最小比を1にすることをお勧めします。チューブのもう一方の端を、PDMS基板に開けられた穴に直接接続します。

より複雑なソリューションの場合、シリカ、キャピラリーポート、またはコネクタも実装できます。チップの出口ポートをチューブに接続し、廃棄物の収集またはさらなる分析処理のためにコレクターに直接接続します。これを設定すると、液滴フローフォーカシングを生成するためのマイクロチャネルの2つの主要な構成またはT接合形式があります。これは、これらの形状を使用して2つの許容可能な流体を一緒にすることから生じる純粋な力と、界面で発生する後続の毛細管内

数フェムトリットルほどの小さな液滴が自然発生的に発生します。液滴が生成されたら、光学セットアップを使用してプローブできます。光学系は、次のプロトコルで設定されます。

サブミクロンの自動位置決め能力を備えた共焦点顕微鏡と、関与する蛍光落下の吸収に一致する波長で動作するレーザーを使用します。それらを励起するには、数メガヘルツの繰り返し速度で動作するパルスレーザーを使用して、蛍光寿命イメージングを行います。PHLEGM実験では、ビームステアリングミラーと光学系を使用して、ビームの高さとビーム方向を制御します。

ダイクロイックミラーを使用して、レーザービームを対物レンズに反射させます。2つのレーザーを同時に使用する場合は、デュアルバンドDIICミラーを取り付けることができます。2つのレーザービームの反射を可能にするには、無限遠補正された高開口NA顕微鏡対物レンズを使用して、レーザー光をマイクロ流体チャネル内の焦点に密集させます。

マイクロ流体チャネル内のサンプルから放出される蛍光を、同じ高NA対物レンズを使用し、同じダイクロイックミラーを介して透過して収集します。シングルバンドまたはデュアルバンドの発光フィルターを使用して、残留励起光を除去します。蛍光発光を75μmのピンホールに集束させます。

平凸レンズを使用。ピンホールを顕微鏡対物レンズの共焦点面に配置します。別のダイクロイックミラーを使用して、蛍光シグナルを2つの検出器に分割します。

ダイクロイックミラーで反射した蛍光を蛍光フィルターでフィルタリングし、プレーンな凸レンズで最初の検出器に集束します。二次赤色蛍光を含む実験では、DIICミラーによって透過された蛍光を別の発光フィルターでろ過し、次に別の平面凸レンズで2番目の検出器に焦点を合わせます。アバランシェフォトダイオードは、蛍光光子の検出に使用します。

蛍光データ集録では、アバランシェフォトダイオード検出器からの電子信号を多機能DAQデバイスに結合し、パーソナルコンピュータ上で動作するデータロギングを行います。痰の実験には、パルスレーザーを使用し、検出器を別のPC上で動作する時間相関のある単一光子計数TCS PCカードに接続します。蛍光寿命のデータを取得することができるカードです。

TCS PC方法論を使用する。検出された各蛍光光子は入射レーザーパルスと相関しているため、放出された各蛍光光子には遅延時間が割り当てられます。このデータを単一または複数の指数関数的減衰曲線に当てはめて、蛍光色素の放射速度を推定できます。

現在、細胞は生物学的、物理的、化学的の両方の観点から非常に不均一であることがわかっています。したがって、理想的には、一度に各セルを分析する必要があります。ただし、アッセイは、信頼性が高く意味のある結論を出すのに十分な定量情報を収集できるように、より高いスループットで実行する必要があります。

ここでは、大腸菌細胞を単一の液滴にカプセル化する例があり、そのまま実行できます。一晩培養した大腸菌トップ10株を使用してください。細胞の生存率を検出するために、サイトナインとヨウ化プロピジウムを使用します。

どちらの色素もDNA間照合色素であり、その蛍光強度は20倍以上増加します。DNAに結合すると、cyto nineは膜透過性でヨウ化プロピジウムである緑色蛍光色素です。これは赤色の蛍光染料で、膜を通さないものです。

したがって、生細胞は緑色に蛍光を発し、死細胞は緑色と赤色の両方の発光を示します。ここでは、液滴の生成とT接合による単一細胞のカプセル化を見ることができます。この動画はハイスピードカメラで撮影したものですが、液滴は毎秒数千個の割合で発生することがあります。

細胞をカプセル化する場合、細胞の培養物が希釈され、生成される細胞滴よりも細胞が少なくなるように、細胞が沈殿するのを防ぐ必要があります(シリンジまたはチューブで発生する可能性があります)。シリンジ内の磁気攪拌子を使用して、細胞を溶液中に均一に分布させます。50マイクロメートルの非常に細いチューブを使用して、シリンジをマイクロチップに接続します。

これにより、チューブ内の高速流量が確保され、セルの沈降が防止されます。ここでは、細胞ベースの実験における時間の関数としての写真カウントの典型的な例を示します。液滴内の混合プロセスをマッピングします。

液滴は、寿命の異なる2つの異なるフルオロフォーを使用して生成できます。流れる液滴内では、流れ場が生成され、最終的に最初に分離された2つの溶液を混合して、混合プロセスを強化します。流れ場の対称性は、巻線チャネルを使用して変更できます。

液滴をプローブするためには、液滴が流れているマイクロチャネルの半分の高さに光学プローブボリュームを焦点を合わせ、チャネルの片側から始めて、チャネルの全幅に沿って各実験を行います。1マイクロメートル間隔で。液滴に関連する単一のバーストを油相のノイズバックグラウンドから区別し、各バーストの持続時間を確立するアルゴリズムを実装します。

2 つ目のアルゴリズムを実装して、実験が実施された特定の幅で各液滴の長さに沿って遅延時間と強度の値を抽出します。次に、最尤推定器MLEアルゴリズムを使用して、実験中の各液滴の蛍光寿命を評価します。実験内のすべての液滴の寿命値を平均化すると、MLE計算の最終的な誤差が減少します。

プローブされる液滴が多いほど、生涯の軌跡が得られた後の誤差は小さくなります。幅ごとに、すべての軌跡を 2D マップに結合します。各生涯値は2つの植物相4の特定の混合物に関連付けられているため、濃度または混合マップを取得できます。

私たちは、マイクロデバイスの作製と実験のセットアップ、およびマイクロ液滴形成と領域カプセル化、およびプロセスである液滴の光学的検出のための関連プロトコルについて説明しました。この 2 つの例では、液滴中の単一細胞の検出と混合プロセスのマッピングを選択しました。流れる液滴の内部は、液滴マイクロ流体工学で現在調査されている一般的なアプリケーションを表しています。

提示された実験が示すように、液滴マイクロ流体プラットフォームの使用は、高スループット、完全な閉じ込め、より高い再現性など、特定の魅力的な特性を示します。生成される大量の情報と、この情報が生成される最高速度。劣化ウランは、この小型化されたプラットフォームから最大限の利点を得るためには、最高の空間時間分解能を備えた高速検出方法の使用を必要とした。

この場合、高精度のフルオラス分光法を使用してこれが可能であることを実証します。