パーキンソン病における神経ペプチドのMALDIイメージングマススペクトロメトリー

この手順の主な目的は、カビの生えたイメージング質量分析を使用して、神経ペプチド、特にオピオイドペプチドの空間分布を脳の薄い部分に直接解明することです。これは、最初にスナップ凍結ラットの脳の12マイクロメートルの薄い組織切片を収集し、それらを導電性ガラススライドに取り付けることによって達成されます。2番目のステップは、化学インクジェットプリンターを使用して、カビの生えたMatrixxをセクション全体に配列して適用し、各マトリックススポットから1つの質量スペクトルを取得することです。

次に、実験の全体的な成功を確実にするために、いくつかのペプチドピークを視覚化します。これに続いて、マススペクトルのエクスポートの検査と処理、ペプチドデータの後処理、および統計的評価が行われます。最後のステップは、カビの生えたイメージング質量分析によって得られたペプチドデータの分析と検証です。

最終的に、結果は、異なる治療グループ間で脳の異なる領域における相対的なオピオイドペプチドレベルに有意差があることを示しています。この手法は、ラジオ免疫SAOゲルベースのアプローチなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、マルチイメージングにより、高い分子特異性を維持しながら治療誘発性の変化を局在化できることです。これにより、翻訳後の変更の切り捨てを以前に検出できなかったように検出する可能性が得られます。

この方法を初めて使用する個人は、この手法に深いサンプル調製とデータ処理が必要なため、最初は苦労するでしょう。ここでは、組織の品質、マトリックス、アプリケーションプロトコル、データ評価、および次の検証実験に焦点を当てます。タンパク質分解を避けるために、組織解剖中に迅速かつ熱心に取り組むことが不可欠です。

承認されたプロトコルに従ってラットを犠牲にした後、すぐに脳を取り出し、粉末ドライアイスに移し、脳を比較的ゆっくりと凍結させ、脳をマイナス80°Cの冷凍庫に保管します。全脳は、MSシグナルの品質を損なうことなく、切片化する前に数年間保存できます。手順を開始する準備ができたら、ティッシュテックを使用してホルダーに脳を取り付け、メディアを埋め込み、埋め込みメディアがペプチドのイオン化と脱離を妨げるため、切断する脳の部分の汚染を避けます。

クライオスタットミクロトーム上の凍結組織を12ミクロンスライスにカットし、Thomは組織切片を導電性のマルディガラススライドにマウントします。この時点で組織切片の染色を行い、組織の品質を検査することができます。この図は、液体窒素で凍結した脳組織のクレスタルバイオレット染色を示しており、これにより組織に亀裂が生じ、裂けました。

この組織は、マトリックスが広がり、真空下で15分間切片を均一に結晶化せず、スライドをマイナス80°Cで保存するまで、高分解能のカビの生えたイメージング質量分析には適していません。まず、切片を乾燥剤で1時間解凍し、次にスライドを70%エタノールで室温で10秒間洗浄し、続いて95%エタノールで室温で10秒間2回洗浄します。洗浄後、スライドを乾燥剤で10分間乾燥させます。

顕微鏡で切片を検査して、組織の歪み、微小な裂け目、またはカビのEMS品質を損なう可能性のある小さな亀裂がなく、組織切片が高品質であることを確認します。次に、50ミリグラム/ミリリットル、DHBおよび50%メタノール、10%150ミリモル酢酸アンモニウム、および0.3%トリフルオロ酢酸を水中に含む新鮮なマトリックス溶液を調製します。ガラススライドホルダーをティッシュセクションと一緒にスキャンし、チップソフトウェアの画像解析機能を使用してホルダーをそれぞれの基準点に位置合わせします。

次に、脳領域と標的分析種の両方に適したマトリックスアプリケーションパラメータを選択します。次に、次に空間解像度を指定します。次に、最適化されたプロトコルを使用して、ケミカルリンクJettプリンターにマトリックスを適用します。

最終的なマトリックススポットセクションをスキャンし、マルチデータ要求の前に画像を保存します。これは、後でマトリックス堆積物をマルディステージのモーター座標と相互参照するために使用されます。すぐに使用しない場合は、マトリックスの斑点のあるセクションは、必要になるまで真空下で乾燥剤に保管することができます。

ほとんどの実験では、ここで見るように、いくつかのセクションが同時に分析されます。各スライドホルダーは2枚のスライドガラスを収めるため、すべてのホルダーについて2セットの複数のセットを分析する必要があります。モールドTOFの取得方法とパラメータは同じである必要がありますが、ペプチド質量のキャリブレーションはスライドごとに確認する必要があります。

次に、レーザーフォーカスやレーザー強度など、組織サンプルの取得パラメータを最適化します。次に、ベースラインを上げずに最適なMSシグナルを得るために必要なショット数を入力し、ピーク分解能を低下させます。検出器を飽和させるか、隣接するマトリックス堆積物からマトリックスをアブレーションし、レーザーの動きを選択します。

ここでノイズのみが検出されるまで、マトリックス スポットごとに撮影できる最大ショット数を見積もります。各マトリックス堆積から 600 ショットが 25 ショット ステップで蓄積され、ランダムな動きパターンを使用して合計 24 ステップになります。flexイメージングソフトウェアを使用して、スポットされたすべてのセクションのスキャンをMALDIステージのモーター座標と相互参照します。

次に、自動実行バッチランナーソフトウェアを使用して、バッチモードでデータ取得を実行します。Flex Imagingなどのデータ可視化ツールを使用して、Maori IMSの画像を視覚的に検査し、ピーク強度分布を評価し、ピーク強度分布が組織の特徴、スポッティング品質、または正規化効果に関連しているかどうかを判断します。この例では、9 種類の動物における 10 種類のペプチドピークの分布を示しています。

正規化に使用される鉄電流またはTICの合計は白で表示されます。TICは、質量スペクトル内のすべての強度値の合計です。動物3のTIC値は非常に低く、ペプチド画像は特定の情報よりも多くのノイズを示しています。

動物番号6の脳は、セクションの下部に非常に高いTIC値を持つ領域を示しています。これは、ペプチド画像のその領域、CおよびD.Thisがデータ解析に影響を与える可能性のあるオーバーノーマライゼーション効果で異常に高い強度として反映されます。過剰な正規化効果は、1つの治療群にのみ特異的に存在すると、不正確な結果につながる可能性があります。

この例では、TICはグループCで大幅に高く、個々のピーク強度に異常に影響を与える可能性があります。例えば、シトクロム C の平均ピーク強度は、生データではグループ C の方がグループ B よりも高くなっていますが、正規化後はピーク強度が低くなっています。グループCの場合、これは結果の重大な誤解につながる可能性があります。

広範なデータ検証を進める前に、常に各治療群の平均TICを計算することが重要です。次に、関心領域を定義するために、プロディノルフィンメッセンジャーRNAが14キロダルトンのプロノルフィンプロペプチドに翻訳されることを認識することが重要です。線条体またはニューロンでは、突起ノルフィンは小胞に詰め込まれ、樹状突起を介して他の線条体またはニューロンを標的とし、軸索を介して細胞体から数ミリメートル離れた実質的な黒体に輸送されます。

小胞は、プロペプチドをさらにアルファネオエンドルフィンジノルフィンAまたはDIノルフィンB.Eachなどのジノルフィンペプチドに処理する酵素を含み、ターゲット構造を解放すると異なるアヘン受容体を活性化することができます、実質的な黒色、ダイノルフィンはさらに処理され、エンドおよびエクソペプチダーゼによってクリアされます。これらのペプチドの一部は、既存の抗体がペプチドのC末端のみを標的とし、末端末端を標的としていないため、質量分析によってのみ検出できます。オピオイド受容体の活性化に関与するY-G-G-F-L配列であるジノルフィン産生細胞は、迷子のAUMに存在し、実質的な黒色に投射します。

そこで、以下の実験では、浮遊AUMとsubs nigraの両方をカビの生えたIMSで分析し、各関心領域からのスペクトルを解析した。背側内側および背側外側線条体と内側および外側黒斑は、フレックス解析ソフトウェアで定義され、データ分析のためにエクスポートされました。データ削減には、さまざまなソフトウェアに付属のピーク検出ツールを使用してピーク検出を実行します。

たとえば、原点のピーク解析や MATLAB の MS ピークを使用します。すべてのスペクトルからピークリストを1つのタブ区切りテキストファイルとしてエクスポートし、ピークの開始と停止の境界を決定します 高速道路のPビンなどのソフトウェアを使用して、ピーク境界間の曲線下の面積を計算し、これらを統計分析に使用します。さん。処理群間の再現性は、各質量値の平均 MS トレースと標準誤差を計算することで評価できます。

この例では、インタクトコントロールニグラの平均スペクトルを使用して、分析した質量範囲全体のばらつきを評価します。良好な再現性は、ピーク強度が両方のコントロール群で等しく、標準偏差が低いことからもわかります。これにより、有効な統計分析が保証されます。

データセットに高い変動が見られる場合は、ほとんどの場合、マオリIMSの実験を繰り返す必要があり、実験の変動源を可能な限り減らす必要があります。通常、1回のセッションでできるだけ多くのセクションと動物を処理し、時には複数の人が交代で作業することもあります。ただし、場合によっては、これではまだ不十分であり、他の戦略を採用できます。

たとえば、一部のスペクトルがノイズで構成されている場合、TICの周波数分布をプロットすることでノイズを作成し、カットオフしきい値を使用して最適でないデータを排除できます。データを評価する別の方法は、同じグループ内の2つの動物のすべてのピークを互いにプロットすることです。ピーク強度が両方の動物で等しい場合、強度強度プロットには細い直線が表示されます。

1 つの動物に低品質のスペクトル データが含まれている場合、プロットは通常、右側に示すように直線からの非対称シフトを表示します。ペプチド配列の同定には、高分解能質量分析にハイフンでつながれた多次元液体クロマトグラフィーを使用して、ラット脳組織抽出物のペプチドドミニク分析を実施します。簡単に言うと、神経ペプチドはラットの脳切片から抽出され、強陽イオンクロマトグラフィーによって事前に分画されます。

次に、異なる画分をナノフロー逆相HPLCを使用してさらに分離します。次に、ハイブリッドリニアイオントラップリア変換イオンサイクロトロン共鳴装置を使用したエレクトロスプレータンデム質量分析によって神経ペプチドを特徴付け、最終的にデータベースマッチングによるペプチド配列の同定を行い、特定の抗体が一部の神経ペプチドで利用可能であり、免疫組織化学実験はペプチドの同定だけでなく、実験結果も検証できます。分解能はマオリイメージング質量分析よりも高く、追加情報を得ることができます。

この例では、ディオールのミツバチの免疫反応性神経線維が海馬、左上のパネル、左下の大きな黒体に見られますが、右下のマオリIMSの画像は、さまざまな脳領域のレベルでの局在化を示しています。ピーク質量を特定のペプチドに明確に割り当てることができるという究極の証明は、プロニンノックアウトマウスのペプチドノックアウト動物に対してカビの生えたIMSを行うことです。矢印で示されているいくつかのピークは、ノックアウトでは欠落していますが、野生型コントロールでは欠落していません。

動物:サブスタンスPやPインクなどの無関係なペプチドピークは、ノックアウト動物と対照動物の間で差を示しません。ジノルフィンBおよびαネオエンドルフィンのピーク強度は、6つのヒドロキシドーパミン病変で有意に増加します。矢印で示されているように、低ジスキネジア動物のパーキンソン病線理AUMを、運動障害および病変対照群と比較しました。

統計解析により、末端チロシンが除去された切断されたαネオエンドルフィンに対応するペプチド質量の有意な増加も明らかになりました。実際、目視検査では、イメージング結果は、緑で示されている親ジノルフィンペプチドの高い共局在を示しており、赤黄色で示されているその関連DESチロシン代謝産物は、右側のオーバーレイパネルでの地域的な重複を示しています。この手法の大きな可能性は、他の方法では検出できないさまざまな脳構造における選択的ペプチドプロセシングに関する知見によって強調されています。

ここでは、赤で示されている特定のDESチロシン代謝産物は、緑で示されている親ペプチドと共局在し、線条体でのみ観察されましたが、運動障害ラットの実質的な黒色では観察されませんでした。.亜黒色画像解析では、赤色で示された分解生成物luとケリンアーチが、緑色で示されたジノルフィンBに反比例して局在していることが明らかになり、ジスキネジア時には、DIノルフィンBが側方サブである黒グラフに局所的に放出され、その後luに代謝され、AR Oneセットアップで慎重に行われたことが示された。モールドイメージングを用いた1回の実験を1日または2日で実施し、サンプル調製とデータ取得を行うことができます。

その後、データ評価のためにさらに1日か2日が続きます。サンプルサイズにもよりますが、検証実験を適切に実施した場合、ラボでさらに1日または2回の実践的な実験が必要になります。次の手順では、特に注意することが重要です。

組織の解剖と凍結は、ペップの劣化を避けるために迅速に行う必要があり、洗浄とマトリックスの適用プロトコルは、各実験に最適化する必要があります。データ評価と統計解析は、過剰な正規化効果やピーク検出不良による誤検出を避けるために、慎重に評価する必要があります。