分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析
January 23rd, 2012
分裂酵母、シゾサッカロマイセスポンベ、基本的な細胞プロセスを研究する良いモデルシステムです。ここでは、分裂酵母の定量的な生細胞の解析を実行する方法を説明します。この特定の実験では細胞核内でゲノムの組織に焦点を当てるが、この方法はまた、細胞質因子を研究するために使用することができます。
次の実験の全体的な目標は、酵母細胞の核内組織と、それが成長条件や突然変異の変化によってどのように影響を受けるかを定量的に測定することです。これは、自家蛍光を最小限に抑える条件で酵母細胞を増殖させて対数相にすることによって達成されます。次に、細胞を成長チャンバーに入れ、顕微鏡で観察します。
次に、細胞内の異なる蛍光標識構造間の距離を測定するために画像を撮影します。酵母培養の成長中の栄養条件の変化に依存する非核組織に違いを示す結果が得られます。この方法は、subar組織またはクロマチンと遺伝子調節との間の相互作用に関するエピエ分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。
トゥールの魚と酵母は、オートクレーブではなく自家蛍光を減らすために、エジンバラの最小培地またはEMMとEMMと塩化アンモニウムを準備することから始まります。0.2ミクロンのフィルターを使用してグルコース溶液を滅菌し、オートクレーブ培地に加えます。30ミリリットルのチューブに3ミリリットルのEMMを魚と酵母の細胞で接種します。
濃厚培地の寒天プレートで新たに培養したYEAは、チューブを軽くキャップし、225 RPMおよび摂氏30度のシェーカーで細胞をインキュベートします。毎朝と夕方にビルカチャンバーで細胞を数え、適切な密度に希釈することにより、細胞を2日間対数期に保ちます。実験当日。
細胞は、窒素スタッフにとって初期の対数期である必要があります。細胞は、チューブ遠心分離機の底部にある1つのペレットに細胞を収集するための文書化されたプロトコルに概説されている手順を参照し、最初にチューブを2分間回転させ、次に180度回転させてさらに2分間回転させることにより、最大1.5RCFのeendオーフチューブ内の細胞を1.5ミリリットルに集めます。上清の10〜15マイクロリットルを除くすべての上清を取り除き、残りの培地に細胞を再懸濁し、フィルター滅菌レクチン1ミリリットルあたり1ミリグラムのアリコートを使用します。
カバーガラスの角に5マイクロリットルのレクチン溶液を加え、レクチンドロップに5マイクロリットルの培養液を加えます。S pomベースセルの成長チャンバーを作成するには、清潔なスライド上に5マイクロリットルのEMMをピペットで移し、培養物を入れたカバーガラスを培地上で70度の角度で反転させ、EMMの上に上に落下させて、エッジをシリコングリースでシールします。200マイクロリットルの先端の広い端をカットし、狭い端を2ミリリットルの注射器に取り付けます。
シリンジに約1ミリリットルのシリコングリースを入れます。シリンジのピストンをそっと押して成長チャンバーをイメージすることにより、カバーガラスの端にシリコンの細い線を塗ります。まず、Brightfield Imagingを使用して細胞を特定し、掘ります。
共焦点顕微鏡の鮮明な画像を取得します。Zeiss LSM 700レーザー走査型顕微鏡を使用し、プランアポッククロマト63倍の油対物レンズと16ラインの平均平面スキャン設定を使用しています。面積単位を 1 から 1.1 に設定すると、0.8 ミクロンの光学スライスが得られます。
Alexa 4、88、mCherry、またはGFPを検出するレーザーで細胞をスキャンします。各ドレーンの60セルで測定を行うのに十分な画像を記録します。新鮮な細胞を備えた新しい成長チャンバーに切り替えます。
60分間のイメージング後、Zeen Light Editionプログラムで画像を開き、同じ焦点面内の異なる蛍光色素のシグナル間の距離を測定します。測定ツールを開き、光の強度とコントラストを調整して、各蛍光シグナルの中心(スピンドルポール本体や核膜など)を特定し、それらの間の距離を測定します。データをメモ帳シートに転送します。
統計ソフトウェアやT検定やマンホイットニーランク和検定などの検定を使用して、異なる株と処理間の細胞内距離の平均または中央値を比較します。この例の株では、PJ 1 18 5をEMMで成長させ、サンプルをイメージングのために成長チャンバーに入れました。次に、PJ 1 18 5のアリコート。
培養物をEMMNに移し、15分間インキュベートした後、サンプルをイメージングのために成長チャンバーに入れました。測定ツールは、軌跡とスピンドルポール本体との間の距離、および軌跡と核膜との間の距離を測定するために使用されました。ここに示すように、窒素飢餓細胞では、核膜から紡錘極体に向かって移動する遺伝子クラスターの距離には、窒素中で増殖した細胞と比較して統計的に有意な差がありました。
GFPとSBPの間の距離を測定するデータは正規分布を持っていたため、平均距離はT検定を使用して比較できました。2つの平均値の間には有意差がありました。GFPとNMの間の距離を測定するデータは正規分布を持っていなかったため、マンホイットニーランクの合計検定を使用して中央値距離を比較しました。
この手順の後、2つの中央値の間には有意差がありました。リアルタイムPCRなどの他の方法を実行して、遺伝子発現レベルが核内組織の変化とどのように相関するかについての追加の質問に答えることができます。
概要
この研究は、分裂酵母であるSchizosaccharomyces pombeの定量的生細胞分析方法を提示し、細胞核内のゲノムの組織化に焦点を当てています。この方法により、研究者は成長条件や変異によって細胞核内の組織化がどのように影響を受けるかを調査することができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 遺伝学
- 微生物学
背景
- Schizosaccharomyces pombeは細胞プロセスを研究するためのモデル生物として機能します。
- ゲノムの組織化の理解は遺伝子制御への洞察に不可欠です。
- 生細胞イメージング技術は動的な細胞構造を明らかにすることができます。
- 成長条件の変化は細胞組織化に影響を与える可能性があります。
研究目的
- 酵母細胞内の細胞核内組織化を定量的に測定すること。
- 栄養条件と変異がゲノムの組織化に与える影響を評価すること。
- クロマチンのダイナミクスと遺伝子制御を研究するための方法を提供すること。
使用した方法
- 酵母細胞は最小培地で対数期まで培養されます。
- 細胞は成長チャンバーと共焦点顕微鏡を使用してイメージングのために準備されます。
- 蛍光標識された構造をイメージングして、それらの間の距離を測定します。
- 統計解析により、異なる条件間での距離を比較します。
主な結果
- 異なる成長条件下で、細胞核内の組織化に有意な違いが観察されました。
- 蛍光信号間の距離測定はクロマチンの位置の変化を示しました。
- 統計テストにより、観察された違いの有意性が確認されました。
- この方法は細胞核内の組織化と遺伝子発現の関係についての洞察を提供します。
結論
- 開発された方法は分裂酵母のゲノム組織化を研究するのに効果的です。
- 結果はクロマチンのダイナミクスに対する環境要因の影響を強調しています。
- このアプローチは遺伝子制御メカニズムをさらに調査するために適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantitative live cell fluorescence microscopy in fission yeast enables precise measurement of subnuclear organization and its dynamic response to environmental changes. This capability is critical for de-risking early discovery hypotheses about chromatin architecture and gene regulation. The method supports predictive confidence in target validation and informs portfolio decisions at the intersection of cell biology and functional genomics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin organization and its impact on gene regulation under defined conditions.
- Supports functional target validation by quantifying spatial genome dynamics in response to perturbations.
- Provides mechanistic de-risking for hypotheses linking nuclear architecture to gene expression changes.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live cell imaging systems for reproducible measurement of subcellular distances.
- Facilitates assay standardization through quantitative, statistically analyzable outputs.
- Enables screening of genetic or environmental modifiers affecting nuclear organization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns subnuclear localization changes with gene induction events relevant to disease models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by linking chromatin dynamics to functional readouts.
- Provides predictive de-risking for translational biomarker development when chromatin positioning is implicated.
Pipeline & Workflow Integration
This quantitative imaging method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model validation, supporting both mechanistic studies and translational research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on chromatin organization and gene regulation relationships.
- Screening: Provides reproducible, quantitative readouts for comparing genetic or environmental conditions.
- Analytics: Delivers statistically robust measurements (mean, median distances) for cross-condition analysis.
- Translational Research: Connects nuclear architecture changes to gene induction relevant for disease modeling.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for live cell imaging and quantitative analysis across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies.
- Operational Value: Standardizes live cell imaging workflows and ensures reproducibility of quantitative outputs.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing robust data on chromatin dynamics and gene expression relationships.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets and pathways based on quantitative nuclear organization data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, fluorescence microscopy, and quantitative image analysis.
- Demands access to confocal microscopy and compatible analytical software for distance measurements.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and statistical analysis methods.
- Adaptation may be needed for different yeast strains or model systems with varying genetic backgrounds.
- Practical limitations include autofluorescence management and ensuring sufficient sample size for statistical power.
