分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析
2012年1月23日
分裂酵母、シゾサッカロマイセスポンベ、基本的な細胞プロセスを研究する良いモデルシステムです。ここでは、分裂酵母の定量的な生細胞の解析を実行する方法を説明します。この特定の実験では細胞核内でゲノムの組織に焦点を当てるが、この方法はまた、細胞質因子を研究するために使用することができます。
本実験の全般的な目的は、酵母細胞における核内構造を定量的に測定し、それが増殖条件の変化や変異によってどのように影響を受けるかを明らかにすることです。これは、自家蛍光を最小限に抑える条件で酵母細胞を対数増殖期まで培養することで達成されます。次に、細胞を増殖チャンバーに入れ、顕微鏡下で観察します。
その後、細胞内の異なる蛍光標識構造間の距離を測定するために画像を撮影します。その結果、酵母培養中の栄養条件の変化に依存した、核外組織の相違が示されます。この手法は、サブ核組織またはクロマチンと遺伝子調節との相互作用に関する、エピゲノム分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。
魚類および酵母の培養を開始するために、エディンバラ最小培地（EMM）、およびオートクレーブによる自家蛍光を抑制するために塩化アンモニウムを添加したEMMを調製します。0.2 µmのフィルターを用いてグルコース溶液を滅菌し、オートクレーブ済みの培地に添加します。30 mLチューブに入れた3 mLのEMMに、魚類および酵母細胞を接種します。
リッチ培地であるYEAを用いた寒天プレート上で新鮮に培養した後、試験管のキャップを軽く締め、シェーカーを用いて225 RPM、30 degrees Celsiusで細胞を培養します。毎朝夕にビルカーチャンバーで細胞数を計測し、適切な密度に希釈することで、2日間にわたり細胞を対数増殖期に維持してください。実験当日、
細胞は、窒素飢餓状態の対数増殖早期にある必要があります。書面によるプロトコルに記載された手順に従い、チューブ遠心機を用いて細胞をチューブ底部の1つのペレットに回収します。1.5 mLの細胞が入ったエッペンドルフチューブを、まず2分間遠心し、次にチューブを180度回転させてさらに2分間遠心することで、最大1.5 RCFで回収します。上澄みを10～15 µL残してすべて除去し、残った培地の中で細胞を再懸濁させ、1 mg/mLのフィルター滅菌済みレクチン分注液を加えます。
レクチン溶液5 µLをカバーグラスの端に加え、そのレクチンの液滴に培養液5 µLを加えます。S pom 基底細胞の育成チャンバーを作成するため、清潔なスライドガラス上にEMM 5 µLをピペッティングし、培養液を含むカバーグラスを培地に対して70度の角度で反転させ、そのままEMMの上に落としてシリコングリスで端を密封します。200 µLチップの先端の広い方を切り取り、細い方を2 mLシリンジに取り付けます。
シリンジにシリコングリスを約1 mL充填します。シリンジのピストンをゆっくりと押し、カバーガラスの端にシリコンを細い線状に塗布して、培養チャンバーを形成します。まず、明視野イメージングを用いて細胞の位置を確認し、掘削を開始します。
共焦点顕微鏡で鮮明な画像を取得します。本手法では、Plan Apochromat 63倍オイル浸浸 objectivesレンズを搭載したZeiss LSM 700レーザースキャニング顕微鏡を使用し、16ライン平均の平面スキャン設定を用います。0.8 µmの光学切片を得るために、エリアユニットを1から1.1に設定してください。
Alexa 488およびmCherryまたはGFPを検出するレーザーを用いて細胞をスキャンします。各ドレインにつき60個の細胞で測定を行うのに十分な枚数の画像を記録してください。その後、新鮮な細胞が入った新しい培養チャンバーに切り替えます。
60分間のイメージング後、Zeen Light Editionプログラムで画像を開き、同一焦点平面内にある異なる蛍光色素のシグナル間の距離を測定します。測定ツールを開き、光強度とコントラストを調整して、例えば紡錘体極体と核膜など、各蛍光シグナルの中心を特定し、それらの間の距離を測定します。得られたデータをメモ帳に転記します。
統計ソフトやT検定、マン・ホイットニーのU検定などの統計検定を用いて、異なる菌株間および処理間での細胞内距離の平均値または中央値を比較します。この例では、菌株 PJ 1 18 5 を EMM で培養し、そのサンプルをイメージング用の成長チャンバーに配置しました。その後、PJ 1 18 5 の分注液を...
培養物をEMMNに移し、15分間インキュベートした後、サンプルをイメージング用の成長チャンバーに設置した。測定ツールを用いて、遺伝子座と紡錘体極体の間の距離、および遺伝子座と核膜の間の距離を測定した。ここに示すように、窒素源が存在する条件下で増殖させた細胞と比較して、窒素飢餓状態の細胞では、遺伝子クラスターが核膜から離れて紡錘体極体に向かって移動する距離に統計的に有意な差が認められた。
GFPとSBP間の距離を測定したデータは正規分布を示したため、T検定を用いて平均距離を比較した。その結果、2つの平均値の間には有意な差が認められた。GFPとNM間の距離を測定したデータは正規分布を示さなかったため、マン・ホイットニーの順位和検定を用いて距離の中央値を比較した。
この手順に従った結果、2つの中央値の間には有意な差が認められました。遺伝子発現レベルが核内組織の変化とどのように相関しているかという追加の疑問を解決するために、リアルタイムPCRなどの他の手法を実施することができます。
概要
本研究では、分裂酵母であるSchizosaccharomyces pombeを用い、細胞核内におけるゲノムの組織化に焦点を当てた定量的な生細胞解析手法を提示します。この手法により、核内組織の構成が成長条件や変異によってどのように影響を受けるかを調査することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 遺伝学
- 微生物学
背景
- Schizosaccharomyces pombeは、細胞内プロセスを研究するためのモデル生物として利用されています。
- ゲノム構成を理解することは、遺伝子調節に関する知見を得るために極めて重要です。
- ライブセルイメージング技術を用いることで、動的な細胞構造を明らかにすることができます。
- 増殖条件の変化は、細胞の構成に影響を及ぼす可能性があります。
研究目的
- 酵母細胞における核内組織を定量的に測定すること。
- 栄養条件および変異がゲノム組織に及ぼす影響を評価すること。
- クロマチンダイナミクスおよび遺伝子調節を研究するための手法を提供すること。
使用した手法
- 酵母細胞を最小培地で対数増殖期まで培養します。
- 培養チャンバーと共焦点顕微鏡を用いて、イメージング用の細胞を調製します。
- 蛍光標識された構造体をイメージングし、それらの間の距離を測定します。
- 統計解析を行い、異なる条件下での距離を比較します。
主な結果
- 異なる増殖条件下で、核内構造に有意な差が観察された。
- 蛍光シグナル間の距離測定により、クロマチンの配置の変化が示された。
- 統計検定により、観察された差の有意性が確認された。
- 本手法は、核内構造と遺伝子発現との関係についての知見を提供する。
結論
- 開発された手法は、分裂酵母におけるゲノム構造の研究に有効である。
- 結果から、環境因子がクロマチンダイナミクスに及ぼす影響が浮き彫りになった。
- このアプローチは、遺伝子調節機構をさらに詳しく調査するために応用できる。
よくある質問
業界における重要性
分裂酵母を用いた定量的生細胞蛍光顕微鏡観察により、核内構造の精密な測定と、環境変化に対するその動的な応答の解析が可能になります。この能力は、クロマチン構造や遺伝子調節に関する初期の探索段階の仮説におけるリスクを低減させるために極めて重要です。本手法は、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させ、細胞生物学と機能ゲノミクスの接点におけるポートフォリオ決定に重要な知見を提供します。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 規定の条件下におけるクロマチンの構造およびそれが遺伝子調節に及ぼす影響の解析を可能にする。
- 摂動に対する空間的なゲノムダイナミクスを定量化することで、機能的なターゲットバリデーションをサポートする。
- 核構造と遺伝子発現の変化を関連付ける仮説に対し、メカニズム的なリスク低減（de-risking）を提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- サブセルラー距離の再現可能な測定のために、検証済みのライブセルイメージングシステムを構築します。
- 定量的に統計解析可能な出力により、アッセイの標準化を促進します。
- 核組織に影響を与える遺伝学的または環境的修飾因子のスクリーニングを可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患モデルに関連する遺伝子誘導イベントと、核内局在の変化を関連付ける。
- クロマチンダイナミクスを機能的リードアウトに結びつけることで、探索から前臨床検証までの連続性をサポートする。
- クロマチンポジショニングが関与する場合、トランスレーショナルバイオマーカー開発における予測的なリスク低減を可能にする。
パイプラインおよびワークフローの統合
この定量的イメージング手法は、初期の仮説検証から前臨床モデルの妥当性確認に至るまで、発見の連続的なプロセスに統合されており、機序研究とトランスレーショナルリサーチの両方を支援します。
- 探索生物学：クロマチンの構成と遺伝子調節の関係に関する仮説検証を可能にします。
- スクリーニング：遺伝的または環境的条件を比較するための、再現性のある定量的なリードアウトを提供します。
- 分析：条件間解析のために、統計的に堅牢な測定値（平均距離、中央値距離）を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：核構造の変化を、疾患モデリングに関連する遺伝子誘導へと結びつけます。
- 組織的再利用：複数のプロジェクトにわたる生細胞イメージングと定量分析のための、再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： ターゲットバリデーションにおける予測信頼性を向上させ、遺伝子調節研究におけるメカニズムの曖昧さを低減します。
- 運用的価値： 生細胞イメージングのワークフローを標準化し、定量的なアウトプットの再現性を確保します。
- 戦略的価値： クロマチンダイナミクスと遺伝子発現の関係に関する強固なデータを提供することで、go/no-go判断に根拠を与えます。
- ポートフォリオへの影響： 定量的な核組織データに基づき、リスクを調整したターゲットおよび経路の優先順位付けをサポートします。
実施上の検討事項
- 生細胞イメージング、蛍光顕微鏡法、および定量的画像解析の専門知識が必要です。
- 共焦点顕微鏡および距離測定用の互換性のある解析ソフトウェアへのアクセスが必要です。
- イメージングプロトコルおよび統計解析手法のチーム間での標準化が必要です。
- 遺伝的背景が異なる異なる酵母株やモデルシステムへの適応が必要になる場合があります。
- 実用上の制限として、自家蛍光の管理および統計的検定力を確保するための十分なサンプルサイズの確保が挙げられます。
