Name: 伝播と緑色蛍光タンパク質を発現Maedi -ビスナウイルスの感染分子クローンの検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶMaedi-Visnaウイルスの感染性分子クローンの増殖と検出法。GFP発現を用いて羊脈絡叢細胞でウイルス複製を蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーで可視化・定量分析する技術を解説。

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この作品は、アイスランドの研究基金とアイスランド研究基金の大学によって資金を供給された。

1。トランスフェクション分子クローンは、それぞれ12 kbと4.5kbの二つのプラスミド、p8XSp5 - EGFPとp67r、に含まれています。9,10 <ol><li>二つのプラスミド、すなわちp8XSp5 - EGFPの4.4μgのとトランスフェクションの前にXbaIおよびライゲーションとp67rの1.6μgの等モル量をカット。 </li><li>ライゲーションの場合は、16℃で一晩50μlの反応とインキュベートでリガーゼの1ワイスのユニットを使用してください。 </li><li>ライゲーションが完了すると、° Cリガーゼの活性化のための15分間65℃ライゲーションミックスをインキュベートする。このステップを省略してもよい。 </li><li>二日前にトランスフェクション、シード10 6 SCPのT25組織培養フラスコ中の細胞、およびコンフルエント90％の単層に抗生物質なしで5ミリリットルDMEM + 10％子羊血清および2mMのグルタミンで2日間細胞を育てる。細胞が二日後にコンフルエント90％に達していない場合は、1つの追加の日成長する細胞を残す。 </li></ol>注：子羊の血清はウシ胎児血清（FBS）で置換することができます。 MVVの一部の菌株は、FBSにより阻害されるので、我々は日常的に、子羊血清を使用して、このMVV株は、しかし、FBSによって阻害されていません。 <ol start="5"><li>細胞はトランスフェクションのための準備ができたら、抗生物質なしで1％の血清（子羊血清またはFBS）を含むDMEMに培地を変更してください。 我々は、トランスフェクションのためにLipofectamin 2000（Invitrogen）を使用してください。 </li><li> 500μLのOpti - MEM培地中でDNAを希釈する。 </li><li> 500μLのOpti - MEM培地で20μlのLipofectamin 2000を希釈し、5分間室温（RT）で残す。 </li><li> 5分のインキュベーション後、希釈したリポフェクタミン2000（合計量= 1000μL）で希釈したDNAを組み合わせる。穏やかに混合し、室温で20〜30分間インキュベートする。 </li><li> SCPの細胞と培地（5 ml）を含むT25フラスコにトランスフェクション混合物（1ml）を追加します。静かに揺らして混合します。 </li><li> 37 ° C、5％CO一夜2（18 - 24時間）。 </li><li> 1％の血清、2mMグルタミン、100IUペニシリンと100IUストレプトマイシンを含むDMEMに培地は、次の日を変更します。 </li><li>倒立蛍光顕微鏡によるSCPの細胞でGFPの生産を監視します。 15％ - 低いトランスフェクション効率は、通常5これらの初代培養細胞、と期待できる。 </li><li> 37さらにインキュベート℃、5％フラスコ中でウイルスの拡散を可能にするために数日間のためのCO 2。それは通常、完全な感染の7〜14日かかります。 </li><li>エッペンドルフチュー​​ブに上清を小分けしてウイルスを回収する。細胞破片を除去するために5分間3000rpmで遠心でスピン。新しいチューブにウイルスを含む上清を移す。 -80℃で保存する</li></ol> 2。ウイルスの滴定<ol><li> 96ウェルプレートにウェルあたり、10％血清、2mMグルタミン、100IU/mlペニシリンおよび100IU/mlのストレプトマイシンを添加した100μlのDMEM培地中でのシード3 × 10 4 SCPの細胞を。 37℃、5％CO 2。 </li><li>細胞が次の日にコンフルエントな場合は、1％血清、2mMグルタミン、100IU/mlペニシリンおよび100IU/mlのストレプトマイシン、各ウェルに100μlのDMEMに培地を変更してください。 </li><li>次の方法でウイルスを希釈する。 <ol><li> 96ウェル丸底またはV底プレートに1％の血清、2mMグルタミン、100IU/mlペニシリンおよび100IU/mlストレプトマイシンウェルあたりに4 × 10ウェルを180μlのDMEMを追加。 </li><li> 4部倍希釈系列の場合は、プレートの最初の列に4wellsのそれぞれにウイルス20μlを追加し、4チャンネルのピペットを使用して、サンプルが十分に混合されることを保証するために上下にピペッティング。ピペットチップを変更し、というように、次の4ウェルに20μlずつ移す。ネガティブコントロール用ウイルスなしで最後の井戸にしておきます。 </li></ol></li><li> SCPの細胞と培地にウイルス希釈液100μLを加える。 </li><li> 37℃および5％CO 2をインキュベートする。二週間のためにGFP蛍光と細胞変性効果を観察する。 細胞変性効果が丸いと多核出現細胞と細胞死で終わる、伸ばしプロセスとの正常な細胞よりも透明化細胞で構成されています。 </li><li>リードMuench法11を用いてウイルス力価（TCID50）を計算する。 </li></ol> 3。感染した細胞のFACS分析注：ウイルスの複製の急速な監視は、感染した細胞をフローサイトメトリーで調べることができます。 <ol><li>感染細胞を（約10 5）トリプシン、500μLPBSでPBSに懸濁すると1Xを洗う。 </li><li>室温で30分間インキュベート500μlの4％パラホルムアルデヒド溶液（最終濃度2％）を、追加。 </li><li> 5分間3000rpmで遠心で細胞をペレット化する。 </li><li> PBS 2X5分で洗い、FACスキャン分析装置で分析する。 10,000のイベントを数える。 </li></ol> 4。代表的な結果： 10 7 TCID 50 / mlの-このウイルスは完全に感染し、10 6の力価に複製する必要があります。感染細胞は蛍光性であるとDETすることができますフローサイトメトリーや蛍光顕微鏡法によるected。一般的に、GFPは、フローサイトメトリー（図1）を用いて感染細胞培養中の細胞の60％以上で検出することができます。同様に、蛍光顕微鏡で観察したとき、細胞の大多数は（図2AおよびB）蛍光灯です。 <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 感染の7日後にKV1772 - EGFPウイルスに感染したSCPの細胞の図1。FACスキャン分析。 <img src="/files/ftp_upload/3483/3483fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> インキュベーションの7日間（）の後にKV1772 - EGFPを感染させたSCPの細胞の図2。位相差顕微鏡。同じ細胞は蛍光顕微鏡（B）により可視化。

<ol><li>Sigurdsson, B., Palsson, P. A., Grimsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna%2C+a+demyelinating+transmissable+disease+of+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Visna, a demyelinating transmissable disease of sheep.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 14, 389-403 (1957).</li>
<li>Gorrell, M. D., Brandon, M. R., Sheffer, D., Adams, R. J., Narayan, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovine+lentivirus+is+macrophagetropic+and+does+not+replicate+productively+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Ovine lentivirus is macrophagetropic and does not replicate productively in T lymphocytes.</a> J. Virol. 66, 2679-2688 (1992).</li>
<li>Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+genetic+differences+between+lung-+and+brain-derived+isolates+of+maedi-visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Biological and genetic differences between lung- and brain-derived isolates of maedi-visna virus.</a> Virus Genes. 16, 281-293 (1998).</li>
<li>Georgsson, G., Houwers, D. J., Palsson, P. A., Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+viral+antigens+in+the+central+nervous+system+of+visna-infected+sheep%3A+an+immunohistochemical+study+on+experimental+visna+induced+by+virus+strains+of+increased+neurovirulence%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Expression of viral antigens in the central nervous system of visna-infected sheep: an immunohistochemical study on experimental visna induced by virus strains of increased neurovirulence.</a> Acta Neuropathol. 77, 299-306 (1989).</li>
<li>Turelli, P., Guiguen, F., Mornex, J. F., Vigne, R., Querat, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dUTPase-minus+caprine+arthritis-encephalitis+virus+is+attenuated+for+pathogenesis+and+accumulates+G-to-A+substitutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions.</a> J. Virol. 71, 4522-4530 (1997).</li>
<li>Petursson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visna+virus+dUTPase+is+dispensable+for+neuropathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Visna virus dUTPase is dispensable for neuropathogenicity.</a> J. Virol. 72, 1657-1661 (1998).</li>
<li>Sigurdsson, B., Thormar, H., Palsson, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+visna+virus+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Gesamte+Virusforsch%22%5BJournal%5D)">Cultivation of visna virus in tissue culture.</a> Arch Gesamte Virusforsch. 10, 368-380 (1960).</li>
<li>Gudmundsdottir, H. S., Olafsdottir, K., Franzdottir, S. R., Andresdottir, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+an+infectious+molecular+clone+of+maedi-visna+virus+that+expresses+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of an infectious molecular clone of maedi-visna virus that expresses green fluorescent protein.</a> J. Virol. Methods. 168, 98-102 (2010).</li>
<li>Andresson, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+and+biological+properties+of+a+pathogenic+proviral+molecular+clone+of+neurovirulent+visna+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence and biological properties of a pathogenic proviral molecular clone of neurovirulent visna virus.</a> Virology. 193, 89-105 (1993).</li>
<li>Skraban, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mutations+within+39+amino+acids+in+the+envelope+glycoprotein+of+maedi-visna+virus+alter+the+neutralization+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mutations within 39 amino acids in the envelope glycoprotein of maedi-visna virus alter the neutralization phenotype.</a> J. Virol. 73, 8064-8072 (1999).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+percent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty percent endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).</li>
<li>Berkowitz, R. D., Ilves, H., Plavec, I., Veres, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+systems+derived+from+Visna+virus%3A+analysis+of+virus+production+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer systems derived from Visna virus: analysis of virus production and infectivity.</a> Virology. 279, 116-129 (2001).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

ここで提示MVVの分子クローンを表現するGFPは、宿主細胞の相互作用とin vitroおよびin vivoの両方MVVの病原性を解析するための有用なはずです。複製の7〜14日後に得られたウイルスは間違いなく、逆転写酵素の不正確さに起因するいくつかの変異を取得しています。しかし、単一サイクルのベクトルとしてこのクローンの使用に制限があります。一つは、クローンの使用は羊とヤギ由来の細胞に限定されていることです。私たちのコンストラクトを使用してこれらの細胞のトランスフェクション効率は5〜15パーセントであり、pEGFPを- N3ベクターを用いたトランスフェクション効率は293 - T細胞を用いて90％に比べて15から20パーセントです。 293 - T細胞は、MVVのベクトルのためのパッケージング細胞としてテストが、結果として得られるウイルス粒子は、羊の細胞と未確認の制約要因が原因と考えられます293 - T細胞の12の両方に非感染性が証明されている。感染性クローンは、別の欠点である二つのプラスミドに含まれています。これは、完全長クローンは大腸菌内で不安定であるという事実によるものです。しかし、それはプラスミド低コピーの...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO </td><td> 10938025 </td></tr><tr><td>のOpti - MEM </td><td> GIBCO </td><td> 51985018 </td></tr><tr><td>リポフェクタミン2000 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11668019 </td></tr></tbody></table>

伝播と緑色蛍光タンパク質を発現maedi -ビスナウイルスの感染分子クローンの検出

Propagating and Detecting an Infectious Molecular Clone of Maedi-visna Virus that Expresses Green Fluorescent Protein

Maedi -ビスナウイルス（MVV）は徐々に進行性間質性肺炎や脳炎1を引き起こして、羊のレンチです。 in vivoでのMVVの主要な標的細胞は単球系2のものであると考えています。 MVVの特定の菌株は、しかし、3,4、他の細胞型で複製することができます。緑色蛍光タンパク質は、生きた細胞内でレンチウイルスを研究するための一般的に使用されるマーカーです。我々は、MVVのdUTPaseのための遺伝子にEGFP遺伝子を挿入した。 dUTPaseの遺伝子はよく羊とヤギの大部分のレンチウイルス株で保存されておりCAEV 5の複製に重要であることが示されている。しかし、dUTPaseは、in vitroおよびin vivo 6の両方本研究で使用したMVVの分子クローンの複製のためのなくても済むことが示されている。 MVVの複製は、厳密に羊やヤギ由来の細胞に限られている。我々は、トランスフェクションとウイルス7の増殖のための羊の脈絡叢（SCPの細胞）からの主な細胞株を使用してください。蛍光MVVは、完全に感染性であり、EGFPの発現は、少なくとも6通路8上安定しています。 TCID 50とEGFPの測定値の間に良好な相関関係がある。このウイルスは、従って、in vitroおよびin vivo 8の細胞指向性や病原性の研究における感染細胞の迅速な検出に有用でなければなりません。

我々はGFPを発現し、完全に伝染性であるmaedi -ビスナウイルスの分子クローンを説明します。このウイルスの複製は、蛍光顕微鏡やフローサイトメトリーを用いて検出することができます。

伝播と緑色蛍光タンパク質を発現Maedi -ビスナウイルスの感染分子クローンの検出

メディ・ビスナウイルス（MVV）は羊のレンチウイルスであり、緩徐に進行する間質性肺炎および脳炎を引き起こします1。MVVの主な標的細胞は...

本手順の総合的な目的は、緑色蛍光タンパク質を発現する Mildy virus と No virus の感染性クローンの増殖および検出を行うことです。この緑色蛍光タンパク質は、Myy Ner ウイルスゲノムの D utp Ace をコードする遺伝子にクローニングされています。感染性クローンは2つのプラスミドに含まれています。まず、myy Ner配列を担う2つのプラスミドをxpa one制限酵素で切断し、ライゲーションします。次に、この構築物をヒツジ脈絡叢細胞にトランスフェクションします。最後に、myy vino virusに感染した細胞を蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーで検出します。こんにちは。私はアイスランド大学TER実験病理学研究所のStefano Neronです。本日は、緑色蛍光タンパク質を発現するmy vascular virusの感染性分子クローンの増殖および検出の手順をご紹介します。分子クローンは、それぞれ12 kbおよび4.5 kbのプラスミドP8XSP5-EGFPおよびP67-orに含まれています。等モル量の2つのプラスミド、すなわち4.4 µgのP8XSP5-EGFPと1.6 µgのP67-orをXPA1で切断し、トランスフェクション前にライゲーションします。ライゲーション完了後、ライゲーション混合物を65 °Cで15分間インキュベートします。トランスフェクションの2日前に、10⁶個のSCP細胞をT25組織培養フラスコに播種し、抗生物質を含まない5 mLの10% λ-serumおよび2 mMグルタミン添加DMEM中で、コンフルエンシーが90%の単層になるまで2日間培養します。2日経過しても細胞のコンフルエンスが90%に達していない場合は、さらに1日培養してください。ラム血清は、胎児牛血清（FBS）で代用可能です。MVVの一部の株はFBSによって増殖が抑制されるため、通常はラム血清を使用しています。しかし、このMVV株はFBSによって抑制されません。細胞がトランスフェクション可能な状態になったら、培地を抗生物質を含まない1%ラム血清またはFBS添加DMEMに変更します。トランスフェクションにはLipofectamine 2000を使用し、DNAを500 µLのOpti-MEM培地で希釈します。また、20 µLのLipofectamine 2000を500 µLのOpti-MEM培地で希釈し、室温で5分間静置します。5分間のインキュベーション後、希釈したDNAと希釈したLipofectamine 2000を合わせ、全量を1000 µLにします。穏やかに混ぜて20～30分間インキュベートします。室温で、トランスフェクション混合液をSCP細胞と培地混合液が入ったT 25フラスコに加え、穏やかに揺らして混ぜ合わせます。37°C、5%二酸化炭素のインキュベーターで一晩培養します。翌日、培地を1%血清、2mMグルタミンのDMEM、100 IU/mLペニシリン、および100 IU/mLストレプトマイシンに交換します。倒立蛍光顕微鏡を用いて、SCP細胞によるGFPの産生をモニタリングします。これらの初代細胞では、通常5%から15%という低い導入効率が予想されます。ウイルスをフラスコ内で十分に拡散させるため、37°C、5% CO₂条件下でさらに数日間インキュベートします。完全な感染までには通常7日から14日かかります。上清をエッペンドルフチューブに分注し、ウイルスを回収します。細胞のデブリを除去するため、マイクロ遠心機を用いて3000 rpmで5分間遠心分離します。ウイルスを含む上清を新しいチューブに移します。-80 °Cで保存したSCP細胞を、1ウェルあたり 3×10⁴ 個、10% serum、2 mM glutamine、100 IU/mL penicillin、および 100 IU/mL streptomycinを添加した 100 µL のDMEM培地で播種します。96ウェルプレートを用い、37 °C、5% 二酸化炭素条件下でインキュベートします。翌日に細胞がコンフルエントになった場合は、培地を1% serum含有DMEMに交換します。各ウェルに100 µLずつ加え、以下の方法でウイルスを希釈します。96ウェル round bottomまたはV bottomプレートの10ウェル×4列に、1%血清含有DMEMを1ウェルあたり180 µLずつ加え、4連の10倍段階希釈を準備します。プレートの1列目の4つのウェルに、ウイルスを20 µLずつ加えます。そして、4チャンネルピペットを用いてピぺッティングし、サンプルが十分に混合されるようにします。ピペットチップを交換し、次の4つのウェルに20 µLずつ移し、同様に繰り返します。陰性対照として、最後のウェルにはウイルスを加えないでください。ウイルス希釈液 100 µLをSEP細胞および培地に加え、インキュベーターに入れます。37 °C、5% 二酸化炭素条件下に置く。2週間、GFP蛍光および細胞変性効果（CPE）を観察する。細胞変性効果は、細胞が円形化し、突起を持つ通常の細胞よりも透明度が低下することから始まり、最終的に多核細胞の出現と細胞死に至る。ウイルスの複製を迅速にモニタリングするため、Reid Munch法を用いてウイルス力価を算出します。感染細胞は、トリプシン処理後、フローサイトメトリーによって解析可能です。10⁵個程度の感染細胞を確認します。PBSで1回洗浄し、500 µLのPBSに再懸濁します。最終濃度が2%になるように4%パラホルムアルデヒド溶液を500 µL加え、室温で30分間インキュベートします。3000 ×gで5分間遠心分離して細胞をペレットにします。PBSで5分間ずつ2回洗浄し、FACScanアナライザーで分析します。10,000イベントをカウントします。本手法で提示したウイルスのGFP発現分子クローンは、in vivoおよびin vitroの両方において、ニューロウイルスのウイルス・宿主相互作用および病原性を分析するのに有用です。私のニューロウイルスがヒト細胞に影響を及ぼすことは示されていませんが、細胞とプラスミドの両方を当研究室から入手できるため、すべてのバイオセーフティーレベルの予防措置を遵守することが重要です。実験の成功をお祈りします。

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