伝播と緑色蛍光タンパク質を発現Maedi -ビスナウイルスの感染分子クローンの検出

本手順の総合的な目的は、緑色蛍光タンパク質を発現する Mildy virus と No virus の感染性クローンの増殖および検出を行うことです。この緑色蛍光タンパク質は、Myy Ner ウイルスゲノムの D utp Ace をコードする遺伝子にクローニングされています。

感染性クローンは2つのプラスミドに含まれています。まず、myy Ner配列を担う2つのプラスミドをxpa one制限酵素で切断し、ライゲーションします。次に、この構築物をヒツジ脈絡叢細胞にトランスフェクションします。

最後に、myy vino virusに感染した細胞を蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーで検出します。こんにちは。私はアイスランド大学TER実験病理学研究所のStefano Neronです。本日は、緑色蛍光タンパク質を発現するmy vascular virusの感染性分子クローンの増殖および検出の手順をご紹介します。

分子クローンは、それぞれ12 kbおよび4.5 kbのプラスミドP8XSP5-EGFPおよびP67-orに含まれています。等モル量の2つのプラスミド、すなわち4.4 µgのP8XSP5-EGFPと1.6 µgのP67-orをXPA1で切断し、トランスフェクション前にライゲーションします。ライゲーション完了後、ライゲーション混合物を65 °Cで15分間インキュベートします。トランスフェクションの2日前に、10⁶個のSCP細胞をT25組織培養フラスコに播種し、抗生物質を含まない5 mLの10% λ-serumおよび2 mMグルタミン添加DMEM中で、コンフルエンシーが90%の単層になるまで2日間培養します。

2日経過しても細胞のコンフルエンスが90%に達していない場合は、さらに1日培養してください。ラム血清は、胎児牛血清（FBS）で代用可能です。MVVの一部の株はFBSによって増殖が抑制されるため、通常はラム血清を使用しています。

しかし、このMVV株はFBSによって抑制されません。細胞がトランスフェクション可能な状態になったら、培地を抗生物質を含まない1%ラム血清またはFBS添加DMEMに変更します。トランスフェクションにはLipofectamine 2000を使用し、DNAを500 µLのOpti-MEM培地で希釈します。また、20 µLのLipofectamine 2000を500 µLのOpti-MEM培地で希釈し、室温で5分間静置します。

5分間のインキュベーション後、希釈したDNAと希釈したLipofectamine 2000を合わせ、全量を1000 µLにします。穏やかに混ぜて20～30分間インキュベートします。室温で、トランスフェクション混合液をSCP細胞と培地混合液が入ったT 25フラスコに加え、穏やかに揺らして混ぜ合わせます。

37°C、5%二酸化炭素のインキュベーターで一晩培養します。翌日、培地を1%血清、2mMグルタミンのDMEM、100 IU/mLペニシリン、および100 IU/mLストレプトマイシンに交換します。倒立蛍光顕微鏡を用いて、SCP細胞によるGFPの産生をモニタリングします。

これらの初代細胞では、通常5%から15%という低い導入効率が予想されます。ウイルスをフラスコ内で十分に拡散させるため、37°C、5% CO₂条件下でさらに数日間インキュベートします。完全な感染までには通常7日から14日かかります。上清をエッペンドルフチューブに分注し、ウイルスを回収します。

細胞のデブリを除去するため、マイクロ遠心機を用いて3000 rpmで5分間遠心分離します。ウイルスを含む上清を新しいチューブに移します。

-80 °Cで保存したSCP細胞を、1ウェルあたり 3×10⁴ 個、10% serum、2 mM glutamine、100 IU/mL penicillin、および 100 IU/mL streptomycinを添加した 100 µL のDMEM培地で播種します。

96ウェルプレートを用い、37 °C、5% 二酸化炭素条件下でインキュベートします。翌日に細胞がコンフルエントになった場合は、培地を1% serum含有DMEMに交換します。各ウェルに100 µLずつ加え、以下の方法でウイルスを希釈します。

96ウェル round bottomまたはV bottomプレートの10ウェル×4列に、1%血清含有DMEMを1ウェルあたり180 µLずつ加え、4連の10倍段階希釈を準備します。プレートの1列目の4つのウェルに、ウイルスを20 µLずつ加えます。そして、4チャンネルピペットを用いてピぺッティングし、サンプルが十分に混合されるようにします。

ピペットチップを交換し、次の4つのウェルに20 µLずつ移し、同様に繰り返します。陰性対照として、最後のウェルにはウイルスを加えないでください。ウイルス希釈液 100 µLをSEP細胞および培地に加え、インキュベーターに入れます。

37 °C、5% 二酸化炭素条件下に置く。2週間、GFP蛍光および細胞変性効果（CPE）を観察する。細胞変性効果は、細胞が円形化し、突起を持つ通常の細胞よりも透明度が低下することから始まり、最終的に多核細胞の出現と細胞死に至る。

ウイルスの複製を迅速にモニタリングするため、Reid Munch法を用いてウイルス力価を算出します。感染細胞は、トリプシン処理後、フローサイトメトリーによって解析可能です。10⁵個程度の感染細胞を確認します。

PBSで1回洗浄し、500 µLのPBSに再懸濁します。最終濃度が2%になるように4%パラホルムアルデヒド溶液を500 µL加え、室温で30分間インキュベートします。3000 ×gで5分間遠心分離して細胞をペレットにします。

PBSで5分間ずつ2回洗浄し、FACScanアナライザーで分析します。10,000イベントをカウントします。本手法で提示したウイルスのGFP発現分子クローンは、in vivoおよびin vitroの両方において、ニューロウイルスのウイルス・宿主相互作用および病原性を分析するのに有用です。

私のニューロウイルスがヒト細胞に影響を及ぼすことは示されていませんが、細胞とプラスミドの両方を当研究室から入手できるため、すべてのバイオセーフティーレベルの予防措置を遵守することが重要です。実験の成功をお祈りします。