Name: スキンと四肢骨の神経支配マウス感覚神経線維の組織の調製と免疫染色 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶ末梢感覚神経線維の組織調製と免疫染色法。マウスの皮膚と四肢骨を用いて、神経支配パターンとタンパク質発現を可視化する手法を解説。神経科学と免疫細胞化学の基盤技術として活用可能。

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彼女の継続的なヘルプと、この作業で建設的な批判のために博士とドナL.ハモンド、我々は、マウス足底パンチ生検の免疫染色の共焦点顕微鏡/イメージングの初期の標準化で彼の助けのための博士ユーリーM. Usachevに感謝。この作品は、NINDS / NIH（NS069898）からの補助金、およびDPMへの防衛前立腺がんの研究プログラムの国防総省（DoD - PCRP - 101096）からのアイデアの開発グラント賞によって資金を供給された

<ol><li>Hoffman, E. M., Schechter, R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixative+Composition+Alters+Distributions+of+Immunoreactivity+for+Glutaminase+and+Two+Markers+of+Nociceptive+Neurons%2C+Nav+1.8+and+TRPV1%2C+in+the+Rat+Dorsal+Root+Ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Fixative Composition Alters Distributions of Immunoreactivity for Glutaminase and Two Markers of Nociceptive Neurons, Nav 1.8 and TRPV1, in the Rat Dorsal Root Ganglion.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58, 329-344 (2010).</li>
<li>Neves, J. D. S., Omar, N. F., Narvaes, E. A. O., Gomes, J. R., Novaes, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+different+decalcifying+agents+on+EGF+and+EGFR+immunostaining%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica%22%5BJournal%5D)">Influence of different decalcifying agents on EGF and EGFR immunostaining.</a> Acta Histochemica. 113, 484-488 (2011).</li>
<li>Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cryoprotectant+to+maintain+long-term+peptide+immunoreactivity+and+tissue+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology.</a> Peptides. 7, 155-159 (1986).</li>
<li>Yen, L. D., Bennett, G. J., Ribeiro-da-Silva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympathetic+sprouting+and+changes+in+nociceptive+sensory+innervation+in+the+glabrous+skin+of+the+rat+hind+paw+following+partial+peripheral+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sympathetic sprouting and changes in nociceptive sensory innervation in the glabrous skin of the rat hind paw following partial peripheral nerve injury.</a> The Journal of Comparative Neurology. 495, 679-690 (2006).</li>
<li>Boyette-Davis, J., Xin, W., Zhang, H., Dougherty, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraepidermal+nerve+fiber+loss+corresponds+to+the+development+of+Taxol-induced+hyperalgesia+and+can+be+prevented+by+treatment+with+minocycline%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Intraepidermal nerve fiber loss corresponds to the development of Taxol-induced hyperalgesia and can be prevented by treatment with minocycline.</a> Pain. 152, 308-313 (2011).</li>
<li>Bloom, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Cancer-Induced+Bone+Remodeling%2C+Skeletal+Pain%2C+and+Sprouting+of+Sensory+Nerve+Fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Breast Cancer-Induced Bone Remodeling, Skeletal Pain, and Sprouting of Sensory Nerve Fibers.</a> The Journal of Pain. 12, 698-711 (2011).</li>
<li>Constantin, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+Tumor+Necrosis+Factor+%CE%B1+%28TNF%CE%B1%29+Requires+TNF+Receptor+Type+2+to+Generate+Heat+Hyperalgesia+in+a+Mouse+Cancer+Model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Endogenous Tumor Necrosis Factor α (TNFα) Requires TNF Receptor Type 2 to Generate Heat Hyperalgesia in a Mouse Cancer Model.</a> J. Neurosci. 28, 5072-5081 (2008).</li>
<li>Jankowski, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitization+of+Cutaneous+Nociceptors+after+Nerve+Transection+and+Regeneration%3A+Possible+Role+of+Target-Derived+Neurotrophic+Factor+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sensitization of Cutaneous Nociceptors after Nerve Transection and Regeneration: Possible Role of Target-Derived Neurotrophic Factor Signaling.</a> The Journal of Neuroscience. 29, 1636-1647 (2009).</li>
<li>Jimenez-Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+Sprouting+of+Adult+Nociceptors+in+Chronic+Prostate+Cancer-Induced+Bone+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pathological Sprouting of Adult Nociceptors in Chronic Prostate Cancer-Induced Bone Pain.</a> J. Neurosci. 30, 14649-14656 (2010).</li>
<li>Persson, A. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium-calcium+exchanger+and+multiple+sodium+channel+isoforms+in+intra-epidermal+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pain%22%5BJournal%5D)">Sodium-calcium exchanger and multiple sodium channel isoforms in intra-epidermal nerve terminals.</a> Molecular Pain. 6, 84-84 (2010).</li>
<li>Ohshima, M., Miyake, M., Takeda, M., Kamijima, M., Sakamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+Enterotoxin+B+Causes+Proliferation+of+Sensory+C-Fibers+and+Subsequent+Enhancement+of+Neurogenic+Inflammation+in+Rat+Skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal Enterotoxin B Causes Proliferation of Sensory C-Fibers and Subsequent Enhancement of Neurogenic Inflammation in Rat Skin.</a> Journal of Infectious Diseases. 203, 862-869 (2011).</li>
<li>Johnson, M. S., Ryals, J. M., Wright, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+loss+of+peptidergic+intraepidermal+nerve+fibers+in+an+STZ-induced+mouse+model+of+insensate+diabetic+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Early loss of peptidergic intraepidermal nerve fibers in an STZ-induced mouse model of insensate diabetic neuropathy.</a> Pain. 140, 35-47 (2008).</li>
</ol>

利害の競合が宣言されない。

ここでは、末梢感覚神経線維の免疫染色と検出のためのマウスの皮膚と骨の組織切片の調製のための方法を紹介しています。足底パンチ生検から生成セクションは、両方の無毛と有毛皮膚を含む、これはプロトコルがどんな肌タイプに使用できることを意味します。これらの技術はまた、これらの組織内の他の細胞型（例えば、白血球、血管内皮、特に平滑筋）を染色するために用いることができる。これらのメソッドは、優れた最適な微細構造の保全との間の妥協（グルタルアルデヒド固定することによって達成されていますが、頻繁にエピトープと減少免疫染色の染色質の混乱の結果）と免疫細胞化学的検出能、厳密な方法で、手順に従っていれば、このステップバイステップを提供しています。 これらの組織における知覚神経線維の検出は、末梢神経突起伸長の調節の我々の理解を助けると4を発芽することができますよく別の病理学的条件下での末梢感覚求心性神経の解剖学的変化としての。さらに、正常な発達や病理学的状態における神経伝達物質、受容体、イオンチャネルや他の表現型マーカーの発現の変化はまた3,5-10を研究すること...

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> 3ミリメートルハリスマイクロパンチ</td><td>材</td><td>テッドペラ</td><td> 15094 </td><td></td></tr><tr><td>注入ポンプ</td><td>材</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 23609-170 </td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>試薬</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> T353 </td><td></td></tr><tr><td>ピクリン酸</td><td>試薬</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 239801 </td><td></td></tr><tr><td> OCTの埋め込み化合物</td><td>試薬</td><td>組織- Tek社</td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> CYTO凍結低温エアゾールスプレー</td><td>材</td><td>制御カンパニー</td><td> 3118 </td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>試薬</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G9023 </td><td></td></tr><tr><td>免疫染色のためのインキュベーショントレイと蓋（大） </td><td>材</td><td> RPI社</td><td> 248270（トレイ） 248270 -（蓋） </td><td></td></tr><tr><td> ImmEdge疎水性障壁のペン</td><td>材</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> H - 4000 </td><td></td></tr><tr><td>ラクダの毛のブラシ（＃1厚さ） </td><td>材</td><td>テッドペラ</td><td> 11859 </td><td></td></tr><tr><td>メディアをマウントするプロロングゴールド</td><td>試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> P36930 </td><td></td></tr></tbody></table>

スキンと四肢骨の神経支配マウス感覚神経線維の組織の調製と免疫染色

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Sensory Nerve Fibers Innervating Skin and Limb Bones

末梢感覚神経線維によって検出し、物理的、化学的および熱的感覚刺激の主な処理は、動物とヒトの知覚に重要です。これらの末梢感覚神経線維は、特定の感覚刺激を検出し、開始する受容体やイオンチャネルタンパク質の茄多を表現する。方法はまた、これらの繊維の特定のイオンチャネルタンパク質の機能発現を同定するために利用することができる、皮膚を支配する末梢感覚神経線維の電気的特性を、特徴付けるために使用可能です。しかしながら、類似の電気生理学的手法は、骨などの最も挑戦的な組織を含む他の内臓器官を、支配する末梢感覚神経線維の受容体とイオンチャネルタンパク質の機能発現の検出のために（そしてまた、開発するのが難しい）は使用できません。さらに、そのような電気生理学的手法は、非興奮性タンパク質の発現を決定するために利用することはできない末梢感覚神経線維内のS。したがって、感覚神経のfivers用周辺/内臓の組織サンプルの免疫染色では、これらの神経線維に関心のある特定のタンパク質の発現を決定する最良の方法を提供します。これまでのところ、感覚ニューロンにおける蛋白質発現の研究​​のほとんどは、情報が特定のタイプまたは感覚ニューロンのサブセットの細胞体における特定のタンパク質の発現に限定されている知覚神経節、の手順を免疫染色に利用している。ここでは、末梢感覚神経線維の免疫染色のための周辺機器/内臓の組織サンプルの調製のための詳細な方法/プロトコルを報告する。我々は末梢感覚神経線維の免疫染色のためのマウスからの皮膚や足底のパンチ生検と骨（大腿骨）のセクションの準備のための具体的詳細の方法。これらのメソッドは、唯一の末梢感覚神経細胞におけるタンパク質発現の定性測定に重要なものではありませんが、またのための定量的なアッセイ方法を提供する感覚線維の特定のタイプまたはサブセットのタンパク質発現レベルの変化を決定するだけでなく、様々な病態時の感覚線維の数と密度の形態学的および/または解剖学的変化を決定するための。さらに、これらのメソッドは、感覚神経線維の染色に限定されないが、皮膚、骨や他の内臓組織における神経線維のいずれかのタイプの染色にも使用できます。

末梢感覚神経線維のサブタイプの免疫細胞化学的同定（とそこにタンパク質発現の検出）が末梢感覚の分子メカニズムの理解の鍵となります。ここでは、末梢感覚神経線維の特異的免疫染色のための皮膚や四肢骨などの周辺/内臓の組織サンプル、、の調製のための方法を説明します。

末梢感覚神経線維による物理的、化学的、および熱的な感覚刺激の検出と一次処理は、...における感覚知覚の鍵となります。

この手順の全体的な目的は、皮膚や骨などの組織に分布する末梢神経線維における解剖学的構成、および特定のタンパク質の発現および局在プロファイルを明らかにすることです。これは、まず固定液を用いて動物全体の灌流を行い、次に対象となる組織を解剖または摘出することで達成されます。次に、単離した組織を後固定し、骨を脱灰させます。その後、クライオスタットを用いて皮膚および骨組織の薄切切片を作成し、スライドガラスにマウントします。手順の最終ステップは、末梢神経線維に特異的に発現し局在するタンパク質に対する抗体を用いて、これらの組織切片の単一または多重ラベル免疫染色を行うことです。最終的に、エピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いた免疫蛍光顕微鏡観察により、特定の種類の末梢神経線維の分布パターン、および末梢神経線維における特定タンパク質の発現または局在パターンを示す結果を得ることができます。このアプローチは、皮膚や骨などの組織における神経支配のパターンはどのようなものであるかなど、末梢神経系に関する重要な疑問を解決するために利用可能です。また、このアプローチは内臓器官やその他の組織にも拡張可能です。これにより、これらの感覚神経線維のサブセット内におけるタンパク質発現の変化や、それらのタンパク質の発現に起こりうる変化について知ることができます。病理学的または発生学的プロセスの間、4%PFAで灌流させた動物をカッティングマットまたはその他の丈夫な表面の上に置き、後足から組織サンプルを採取します。足の底面を上にして保持し、足の中央に配置した3 mmのパンチ生検ツールでしっかりと押し込みます。生検ツールを180度前後に回転させ、足の全層が確実に切除されたことを確認します。生検ツールを足からゆっくりと取り出し、組織を1 mLの4% PFAまたは5% PA溶液が入った滅菌済みの2 mLチューブに排出します。なお、本ケースでは大腿骨から肢骨サンプルを採取します。骨盤の高さで動物の背面に側切開を加え、そのまま両後肢に沿って下方へ切開します。骨盤と周囲の筋肉を切開し、大腿骨近位端の骨頭を温存しながら、大腿骨を骨盤から分離します。次に、脛骨または腓骨を切開し、遠位端を温存した状態で、骨幹から周囲の筋肉と骨膜を除去します。大腿骨を1 mLの4% PFAまたは5% PA溶液を含む2 mLチューブに入れ、ロッカースタンドを用いて緩やかに混合しながら、4 °Cで16〜18時間後固定します。後固定後、両サンプルを1.5 mLの脱灰溶液が入った滅菌済み2 mLチューブに移し、脱灰を行います。足底パンチサンプルは4 °Cで16〜18時間、大腿骨は6〜7日間、緩やかに揺らして処理します。24時間ごとに溶液を交換し、脱灰後にピンセットを用いて骨組織の剛性の低下を確認します。組織サンプルを1.5 mLの凍結保護剤（Cr

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このビデオは、マウス脳切片のMeynert領域の基底核におけるコリン作動性線維の免疫組織化学的染色を示しています。切片をブロックし、一次対コリンアセチルトランスフェラーゼで処理し、続いてビオチン化二次抗体で治療します。アビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体が添加され、これが二次抗体に結合し、続いて発色基質が添加されます。その後、切片を脱水してマウントし、顕微鏡で視覚化します。...

マウス脳のMeyner基底核における神経線維の免疫組織化学的染色

出典:Boyer, N. P. et.al., 切除マウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと分析. J. Vis. Exp. (2020)...

有髄マウス軸索におけるニューロフィラメント輸送の蛍光光活性化イメージング

動的な縦イメージングレポータートランスジェニックマウスにおける神経終末の選択的レーザ病変のためのプロトコルが提供される。...

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

筋肉感覚ニューロンは自己受容体シグナル伝達に関与し、また代謝状態やけが関連するイベントについて報告している。私たちは、ストレッチ活性化筋求心性神経の研究のためのin vitroでの筋肉の神経に備えて成体マウスについて説明します。...

アン体外成体マウス筋肉神経の準備

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の毛包披針形語尾に神経末端標識リビングの光監視<em&gt; ex vivoで</em&gt;マウスの耳皮膚

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トルイジン ブルー染色樹脂埋め込まれたセクションの末梢神経形態の評価

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学ぶ末梢感覚神経線維の組織調製と免疫染色法。マウスの皮膚と四肢骨を用いて、神経支配パターンとタンパク質発現を可視化する手法を解説。神経科学と免疫細胞化学の基盤技術として活用可能。

スキンと四肢骨の神経支配マウス感覚神経線維の組織の調製と免疫染色

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