Name: 器官培養のための無傷牛テール椎間板の準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 37 s
Description: 学ぶ、無傷の牛尾椎間板を器官培養用に準備する方法。消毒、筋肉除去、カスタムカッティングツールによる椎間板の切り出し、ジェットラバージシステムによる骨表面の洗浄を含む。生細胞を維持し、バイオリアクターでの機械的負荷研究や組織工学への応用が可能となる。

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このプロジェクトは、スイス国立科学財団（SNF＃310030-127586/1）によってサポートされていました。

1。椎間板の収穫<ol><li>皮膚の存在は、汚染の可能性（図2）を増加させるので、全体の長さのウシの尾は皮なしで可能であれば、地元の食肉処理場から得られる。 </li><li>大きなまな板を準備して、カッティングボード（図2）の上に滅菌ワークステーションと楽器を準備。 </li><li>滅菌ガーゼは、55mmのクエン酸ナトリウムを含む0.9％塩化ナトリウムで湿らせ、6ウェルプレートの各ウェルに入れ、無菌層流フードの下準備。 </li><li>流域を準備し、水道水で1:100 Betadineソリューションを希釈する。 </li><li> 5分間、1％Betadine溶液を含む流域の全体の牛の尾を浸し。 </li><li>簡潔に乾いた滅菌ガーゼで尾と無菌ワークステーション上に置きます。 </li><li>慎重に手術用メスの刃＃22とテール周りの筋肉を取り除く。 </li><li>比較的大きいと非常に小さいが含まれて通常必要とされていないテールの部分、尾の両端を、離れてチョップIVDs（図3）。 </li><li>さらに手術用メスの刃＃10を使用してIVD周囲の筋肉や腱をトリミング。ディスクの外側の環を切らないように注意してください。 </li><li>外科皮膚マーカとIVDの前にマークを付ける（このステップはオプションです、それは私たちのバイオリアクターでの軸回転の中心を決定するのに役立ちます）。 </li><li>静かに尾を移動することによって、IVDと脊椎の接続ポイントを見つけます。手術用メスの刃の鈍い側でIVDと骨の間に境界線を感じる。切断部位は、脊椎骨に向かってIVDの離れて1〜2ミリメートルでなければなりません。場所のカスタムは、切断部位（図4）産業のブレードホルダーを作った。 </li><li>カスタムメイドの工業用ブレードホルダー（図3）の上にハンマーで開裂するIVDと椎。 </li><li> IVD -椎接続の反対側に繰り返します。 </li><li>ラップは、55mmのクエン酸ナトリウムを含む0.9％塩化ナトリウムで湿らせた滅菌ガーゼでIVD分離。 </li><li>希望のサンプル番号（通常は約6缶にIVDsの分離を継続する10〜20ミリメートル）との間の直径で収穫される。 </li><li>滅菌乳酸リンゲル液でジェット洗浄システムを（ジマー、税込）に接続、5L袋は便利なサイズ（代わりに滅菌PBSまたは0.9％生理食塩水）です。 </li><li>鉗子とジンマーPulsavacジェット洗浄システム（図1C）を使用して、エンドプレートの表面のジェット洗浄両面でIVDを保持する。ジェットガンは、30の間の角度で終板の表面に撮影してください - 60 °各側面に30秒程度のために。 （図1及び図7） </li><li>ジェットは別のディスクのサンプルを洗浄しながら、湿らせたガーゼで6ウェルプレートとラップにIVDsを元に戻します。 </li><li> IVDsは、器官培養とダウンストリームのアプリケーション（例えば、細胞の生存率、機械的荷重、器官培養）（図1D）のための準備が整いました。 </li></ol> 2。代表的な結果成功した椎間板の準備を判断するアウトカムの測定値は、小さな分子量の蛍光色素（例えばprocion赤）拡散実験することができますPBS 2の1％溶液として調製される。 IVDは、色素溶液と色素の少なくとも100 mLをして自由膨張の下で24時間のためのIVDに受動的に拡散することを許可されて保持されます。 IVDは、° Cと、最終的に室温に液体窒素で瞬間凍結し、室温に戻し、アセトン転送（最初-80にプリ℃まで冷却し、C、-20 °次にC、4シリーズで脱水です）。ディスクは、ポリメチルアクリレート（PMMA）に埋め込まれ、厚さ100μmのセクションを生成するために鋭利な刃でカットすることができます。これらのセクションは、任意の標準的な明視野顕微鏡ではなく優先的にprocion赤は赤色蛍光（図5-6）を発するので、蛍光顕微鏡の使用によって見ることができます。骨表面のtrabeculiはジェットlavagingのステップ（図7）の後に非常にきれいに表示されます。 成功した器官培養のためのパラメータは、汚染のすべての不在の最初の維持、細胞生存率（図8-9）、ディスクの高さとです。組織切片およびサフラニンO /ファストグリーン染色やマイヤーのヘマトキシリン​​3で測定された全体的な"ディスクの整合性"、。我々は、ライブディスクの組織を染色し、共焦点レーザー走査型顕微鏡とLIVE / DEAD染色キット（Molecular Probes社、Invitrogen社、バーゼル、スイス）を使用して3Dで細胞の生存性をスキャンするために別の場所で4,5公開プロトコルとマクロを開発した。我々は、さらにNIH ImageJのプラットフォーム4-6を用いて三次元組織または3Dのキャリアで、細胞生存率を推定するために計数自動化されたセルを実行するマクロ、ルーチンを開発した。代替プロトコルはプロナーゼとコラゲナーゼの種類を使用して細胞外マトリックスの連続消化を使用して初期消化によってディスクの細胞の細胞生存率を決定するために2とし、細胞懸濁液7を染色するために提案されている。十倍を含むPBSでのインキュベーションステップを関連するプロトコルの以前のバージョンのディスク前に臓器Cuの収穫後の10分のためのより高濃度のペニシリン/ストレプトマイシン濃度lture。このステップは、培養の目的のために有益と思われるので、ジェットの洗浄ステップでは、このステップは不要になります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1方法論の手順の概要は、そのままエンドプレートと骨の薄層（1 - 2mm）をウシ尾骨椎間板を準備する。椎間板（IVD）とその栄養経路のA）の模式図。 B）カスタマイズしたブレードホルダーと産業鋭い刃とIVDをカットする手順。 C）ジェット洗浄ステップでは、高い細胞生存率を確保し、エンドプレートと両側に接続されている骨の1〜2 mmを維持する栄養交換を可能にする。 D）最後に、IVDは、バイオリアクターの試料室で培養することができますまたは任意のダウンストリームアプリケーションに使用される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2トップ：全長新鮮な牛テール（理想的にobta高い細胞の生存を確保するために事後の2〜3時間以内にined。底部：骨の終板（EP）と椎体（VB）との間で、成長板（GP）、骨化の二次中心の存在を示す6ヶ月歳前後牛テールのX線画像。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 図3。）ツールは、無菌条件下でウシの尾を解剖する。椎間板を削減しながらB）カスタマイズされたブレードホルダーは、アクションの牛テールから運動のセグメントを切り出しする。標準的な工業用ブレード（ルッツ、ドイツ）とカスタマイズされたブレードホルダーのC）サイドビュー。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図4"> 図4。運動セグメントをカットする切断部位を示す周囲の筋肉と靭帯を除去した後、牛テールの描画と画像。部分的な椎骨はwiを"クラック"する必要がある離れて軟骨終板からカスタムメイドのブレードホルダー番理想的に1〜2ミリメートルの完全な骨の表面を確実にする。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図5"> 図5。の前に（）と（B）の後、ジェット洗浄ステップの効果的な洗浄のデモンストレーション。噴霧手順の後に椎間板セグメントのクリーンな骨の表面に注目してください。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig6.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図6"> 図6。作りたての成長板によって閉塞効果を発揮、1％procion赤色の溶液に24時間放置牛テール椎間板（IVDs）を切り出したの自由膨潤拡散実験。のデジタルX線矢状画面に2つの後も軟骨や骨端板と尾骨ウシ椎間板の外植片を介して成長板と矢状カットの骨蛍光顕微鏡画像の第二層を含むIVD4時間自由拡散。 GP：成長板、2ndry CO：骨化の二次中心。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig7.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図7"> 図7。1％procion赤色の溶液に24時間放置、新たに調製した摘出したウシの尾部椎間板（IVDsが）、ジェット洗浄療法の洗浄効果を示すの自由膨潤実験。治療（右）ジェットlavaged処理なしジェット洗浄療法（左）制御側を受けた〜1.5 mmthick骨端板と摘出したウシIVDsの矢状厚いセクション（〜100mm）に。入口は1％procionの赤のウシ椎間板の外植片のジンマーの傷デブリドマンシステム24時間無料の拡散実験から使用されたスプレーパターンを示しています。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig8.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図8"> 図8。共焦点イメージングスタックの投影のデッド/ライブ画像（250μm）bovinから撮影電子椎間板セグメントは髄核（NP）、内側の線維輪（IA）と外側の線維輪（OA）のためそれぞれ0と14日間無料の膨潤性の下に置かこのジェット洗浄法を用いて調製。緑色のセルは=生きている細胞は、カルセインAM（アセチルメチルエステル）、赤血球エチジウムホモダイマー-1で染色=死んだ細胞の核で染色。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/3490/3490fig9.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図9"> 図9。生きている組織や3Dスタックのスキャンの共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて椎間板の細胞バイアビリティ。自由膨潤性条件下で21日間の培養上髄核（NP）およびアニュラス線維症（AF）の細胞の生存。 （± SEM、N = 6の平均）統計的な違いは、ノンパラメトリッククラスカルワリスのグループ間での順位和検定を署名した使用してテストされました。有意な差は21日目とNPの他のすべての時間の点の間に発見された。 AFに有意な差で7日目までの間に発見されたが0日目。 （* P &lt;0.05、** P &lt;0.01）。

<ol><li>Lee, C. R., Iatridis, J. C., Poveda, L., Alini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc%3A+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa++1976%29%22%5BJournal%5D)">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine (Phila Pa 1976). 31, 515-522 (1976).</li>
<li>Chan, S. C. W., Gantenbein-Ritter, B., Leung, V. Y., Chan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+intervertebral+disc+with+injected+bone+marrow-derived+stromal+cells%3A+a+feasibility+study+using+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Spine.+J%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved intervertebral disc with injected bone marrow-derived stromal cells: a feasibility study using organ culture.</a> Spine. J. 10 (6), 486-496 (2010).</li>
<li>Chan, S. C., Ferguson, S. J., Wuertz, K., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+Response+of+the+Intervertebral+Disc+to+Repetitive+Short+Term+Cyclic+Torsion%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Biological Response of the Intervertebral Disc to Repetitive Short Term Cyclic Torsion.</a> Spine (Phila Pa 1976). , (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Sprecher, C. M., Chan, S., Illien-Jünger, S., Grad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+imaging+protocols+for+live%2Fdead+staining+in+three-dimensional+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers.</a> Methods Mol. Biol. 740, 127-140 (2011).</li>
<li>Gantenbein-Ritter, B., Potier, E., Zeiter, S., van der Werf, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+three+techniques+to+determine+cell+viability+in+3D+tissues+or+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C+Methods%22%5BJournal%5D)">Accuracy of three techniques to determine cell viability in 3D tissues or scaffolds.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 14, 353-358 (2008).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Haschtmann, D., Stoyanov, J. V., Ettinger, L., Nolte, L. P., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+novel+intervertebral+disc%2Fendplate+culture+model%3A+analysis+of+an+ex+vivo+in+vitro+whole-organ+rabbit+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Establishment of a novel intervertebral disc/endplate culture model: analysis of an ex vivo in vitro whole-organ rabbit culture system.</a> Spine. 31, 2918-2925 (2006).</li>
<li>Gantenbein, B., Grünhagen, T., Lee, C. R., van Donkelaar, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+organ+culturing+system+for+intervertebral+disc+explants+with+vertebral+endplates%3A+a+feasibility+study+with+ovine+caudal+discs%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">An in vitro organ culturing system for intervertebral disc explants with vertebral endplates: a feasibility study with ovine caudal discs.</a> Spine. 31, 2665-2673 (2006).</li>
<li>Korecki, C. L., Kuo, C. K., Tuan, R. S., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervertebral+disc+cell+response+to+dynamic+compression+is+age+and+frequency+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">Intervertebral disc cell response to dynamic compression is age and frequency dependent.</a> J. Orthop. Res. 27, 800-806 (2009).</li>
<li>Korecki, C. L., MacLean, J. J., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+effects+on+intervertebral+disc+mechanics+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Spine+%28Phila+Pa+1976%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression effects on intervertebral disc mechanics and biology.</a> Spine (Phila Pa 1976). 33, 1403-1409 (1976).</li>
<li>Jim, B., Steffen, T., Moir, J., Roughley, P., Haglund, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+intact+intervertebral+disc+organ+culture+system+in+which+degeneration+can+be+induced+as+a+prelude+to+studying+repair+potential%5BTitle%5D)+AND+%22European+Spine+Journal%22%5BJournal%5D)">Development of an intact intervertebral disc organ culture system in which degeneration can be induced as a prelude to studying repair potential.</a> European Spine Journal. , 1-11 (2011).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

成功した器官培養のための最初のステップは、外植片が汚染されるべきではないことを確認することです。この手順を始める前に尾にはスキンは適用されるべきである。無菌室に持ち込むあらゆる動物の毛は、汚染の点で問題である可能性があります。牛テールは、理想的に（これは初期の細胞の生存に影響を与える）可能な限り新鮮なはずです。さらに、betadineの洗浄工程は、さらなる汚染のリスクを軽減することをお勧めします。代わりに、カスタムメイドのブレードホルダーと椎体からのIVDを分離するためにハンマーを使用する代わり、これは組織学的バンドソーを（切削中のダイヤモンドブレードは、PBSまたはリンガー溶液を冷却する必要がある）を使用して実行することができます。バンドソー、試料ホルダーと切刃は無菌でなければならないことに注意してください。ここで示した手法は、牛テールIVD分離に限定されるものではなく、そのようなブタ、ヒツジ及びウサギの尾側、あるいは腰椎IVD分離など他の動物種に拡張することができます。 IVD時間脊髄のプロセスが存在する地域でarvest、それは最初にすべてのプロセスを削除することが重要です。 <p class="jove_content"...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td colspan="4">ローカル虐殺家（理想的に時間の事後内および皮なし）から牛テールから新鮮なウシ椎間板組織、。 </td></tr><tr><td> PulsavacプラスACシステム</td><td>ジンマー株式会社、スイス</td><td> 00-5150-486-01 </td><td>ヒップスプレーヘッド付きやAC電源で最高のパフォーマンス（8つのAA電池パックを持つものがも動作しますが、あまり便利ではありません） </td></tr><tr><td>大容量ファンスプレーのw /スプラッシュシールド、12.7センチメートル長さ</td><td>ジンマー株式会社、スイス</td><td> 00-5150-175-00 </td><td>利用可能ないくつかのスプレーヘッドが存在する、我々が正常にこれをテスト</td></tr><tr><td>メスの刃＃22と＃10 </td><td>スワン-モートイングランド、上</td><td> ＃10：0201 ＃22：0208 </td><td></td></tr><tr><td>手術用メスの刃ホルダー＃3と＃4 </td><td>ハウスマン、ドイツ</td><td> ＃3：06.103.00 ＃4：06.104.00 </td><td></td></tr><tr><td>ルッツ工業用ブレード</td><td>ルッツ、ドイツ</td><td> 1022.0884 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水（PBS） </td><td>インビトロジェン、スイス</td><td> 10010-023 </td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM） </td><td> Gibco社、スイス</td><td> 11960-044 </td><td></td></tr><tr><td>乳酸リンゲル液（ブドウ糖なし） </td><td>ビクセル、スイス</td><td> 133 0002 </td><td></td></tr><tr><td> 6ウェルマルチウェルプレート</td><td> TPP、スイス</td><td> 92006 </td><td></td></tr><tr><td> Betadineソリューション</td><td>ムンディファーマ、スイス</tD&gt; <td> 10055025 </td><td></td></tr><tr><td>外科皮膚マーカー</td><td> Pore​​x外科、スイス</td><td> 9560 </td><td></td></tr><tr><td>大きなまな板</td><td></td><td></td><td>どんなブランドが可能です。 </td></tr></tbody></table>

器官培養のための無傷牛テール椎間板の準備

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

椎間板（IVD）は椎骨に椎を接続する脊椎の関節です。それは、背骨の荷重を伝達し、背骨に柔軟性を与えるために機能します。線維輪（AF）で取り囲む最も内側の髄核（NP）、および両側の椎体にNPとAFを接続する2つの軟骨終板：それは3つの区画から構成している。おそらく変性椎間板疾患（DDD）と椎間板ヘルニアが原因で椎間板の痛みは私達の現代社会における主要な問題として同定されている。 IVD変性の機序を調べるために、ライブディスクの細胞を用いたin vitro器官培養系で非常に魅力的です。そのままウシ尾骨IVDsのin vitro培養十分に制御生理学的および機械的な環境におけるメカノ生物学的側面 ​​の研究を可能にする、関連するモデルシステム、に進んでいる。牛テールIVDsは高い数値で、比較的容易に得ることができますdは、細胞密度、細胞集団と寸法に関する人間の腰椎IVDsと非常によく似ています。栄養経路が明らかに凝固した血液によってブロックされたしかし、軟骨終板と骨のエンドプレートを保持し、前のウシ尾IVD収穫テクニックは、文化の1〜2日後に失敗しました。 IVDsが最大の無血管器官である、したがって、NPの細胞への栄養素は、隣接する椎体から毛細管芽を経由して拡散にもっぱら依存しています。エンドプレートの表面上に骨の破片と血餅の存在は、ディスクと妥協の細胞の生存の中心に栄養の拡散を妨げることができる。当社グループは、汚染のリスクが低いとアウトテールからIVDsを&quot;クラック&quot;することは比較的迅速なプロトコルを確立した。我々は、血栓や切削屑を除去し、非常に効率的に栄養の拡散経路を再オープン外科ジェット洗浄システムを使用して、切りたての骨端板の表面を透過することができますIVDの中心に。脊椎骨の両側の成長板の存在は、避けるべきと前の文化に削除する必要があります。このビデオでは、我々は準備中に重要なステップを概説し、無料の腫れ文化で14日間高い細胞生存率を維持し成功した器官培養するキーを示しています。培養時間は、適切な機械的な環境が機械的荷重のバイオリアクターを使用して維持することができるときに拡張することができる。ここで示した手法は、ブタ、ヒツジ及びウサギの尾と腰IVD分離など他の動物種に拡張することができます。

このプロトコルは、のための器官培養のための尾骨ウシ椎間板のための収穫技術を示しています。<em&gt; in vitroで</em&gt;器官培養。

椎間板（IVD）は、椎骨と椎骨を連結する脊椎の関節である。これは脊椎への荷重を伝達し、...

本手順の全体的な目的は、培養およびその他のダウンストリームアプリケーションのために、ウシの尾から完全な椎間板を調製することであり、本事例では、複合的な機械的負荷を用いたバイオリアクター内での培養に向けて椎間板を調製することです。まず、子牛の尾を消毒し、次に筋肉を除去して、骨および椎間板構造を明確に視認できるようにします。次に、カスタムカッティングツールを用いて、椎間板の両側に2～3 mmの椎骨の一部を残した状態で、単一の椎間板を切り出します。第3ステップでは、ジェット洗浄システムを用いて椎間板の骨表面を洗浄し、グルコースなどの低分子溶液が椎間板の中心まで拡散するようにします。最終ステップでは、後続のアプリケーションに向けて水分を保持するため、椎間板を安定化バッファーに入れるか、滅菌ガーゼで包みます。最終的に、椎間板培養の開始から14日または21日後に、生死染色を用いて生存細胞の有無を確認し、本手順の成否を評価します。以下のプロトコルでは、メカノバイオロジーや組織工学における重要な疑問を解決する一助となる、臓器培養のための椎間板セグメントの保存方法を示します。牛の尾側椎間板が組織工学における一種のモデルシステムとなったのには十分な理由があります。まず、細胞密度がヒトの髄核のように非常に低く、かつ類似している点が挙げられます。第二に、そこにある細胞集団には、ヒトの状況と同様に、索状細胞が存在しないという特徴があります。第三に、寸法および生化学的組成もヒトの状況と非常に類似しています。一般的に、この方法に不慣れな方は、骨端板と椎体骨を区別することが困難であるため、軟骨成長板が存在することを確認するのに苦労すると思われます。私たちは、個別の培養のために終板を伴う反転ディスクを分離するための、迅速かつ無菌的な手法を探していた際に、まずこの方法を考案しました。切断部位が骨板からわずか1mmの場所に位置しているため、切断箇所を特定することが困難であり、これらの手法を視覚的に提示することが重要です。まず、地域の屠殺場から牛の尾を丸ごと1本入手します。理想的には、尾は死後4時間以内のものであるべきであり、皮膚を除去した状態で採取してください。皮膚が存在すると汚染の可能性が高まるため、解剖工程で使用するすべての器具が滅菌されていることを確認してください。また、作業台の上にオートクレーブ滅菌済みのまな板を設置し、滅菌ワークステーションを作成してください。次に、無菌的なラミナーフローフード内での作業において、55 mMのクエン酸ナトリウムを含む0.9%滅菌生理食塩水で滅菌ガーゼを湿らせます。湿らせたガーゼを6ウェルプレートの各ウェルに配置します。続いて、清潔な容器に水道水で1:100に希釈したベタジン溶液を満たし、尾部をその溶液に5分間浸します。浸漬後、尾部を取り出します。滅菌ガーゼで軽く水分を拭き取り、滅菌ワークステーション上に置きます。まず、20番または22番のメスを使用して、尾部の周囲から筋肉を除去します。次に、ギロチンを用いて尾部の不要な部分（通常は、比較的大きく、あるいは非常に小さな椎間板が含まれる近位端および遠位端）を切り離します。次に、10番メスを用いて椎間板周囲の筋肉と腱をトリミングします。必要に応じて、椎間板の外側線維輪を切断しないよう注意してください。方向を確認するため、外科用皮膚マーカーを使用して椎間板の前方をマークします。次に、尾をゆっくりと動かし、椎間板と椎骨の接合部を確認します。メス刃の鈍い側を使用して、椎間板と骨の境界をなぞります。その後、椎間板から椎骨に向かって1〜2 mm離れた位置にある切開部位を特定します。特注の工業用ブレードホルダーを切断部位に配置します。この図は切断部位を明確に示しています。特注の工業用ブレードホルダーの上からハンマーで叩き、椎間板と椎体を切断します。その後、ブレードホルダーを椎間板と椎体の接合部の反対側に移動させ、接合部のこちら側からハンマーで叩いて椎間板を分離させます。次に、55 mMのクエン酸ナトリウムを含む0.9%塩化ナトリウム溶液で湿らせた滅菌ガーゼを用いて、椎間板を迅速に分離します。この工程を繰り返し、必要な数の椎間板を採取します。通常、1本の尾から直径10〜20 mmの椎間板を約6個採取することが可能です。すべての反転ディスクの採取が完了したら、ジェット洗浄システムを3リットルの滅菌乳酸リンゲル液、滅菌PBS、または0.9%滅菌生理食塩水のバッグに接続します。次に、ピンセットで反転ディスクを保持し、終板表面に対してジェット洗浄器を30度から60度の角度に保ちながら、終板表面の両面をそれぞれ30秒間ジェット洗浄します。この画像はジェット洗浄による洗浄効果を示しています。上段のディスクは洗浄前の反転ディスクであり、下段は洗浄後の同一ディスクを示しています。1つ目の椎間板の洗浄が終わったら、それを湿ったガーゼで包み、その間に他の椎間板を洗浄します。洗浄後、椎間板は臓器培養に使用できる状態になります。さらに、ラミナーフローフード内で作業しながら、椎間板の調製が成功したかを確認するために拡散実験を行うことができます。ディスク1枚につき、5%胎児ウシ血清を含む滅菌済みDMEM培地を40 milliliters用意します。培地をビーカーに移し、そこに椎間板1個を浸します。ビーカーを、温度37 °C、二酸化炭素濃度5%に設定した組織培養インキュベーター内のシェイキングプラットフォームに設置します。椎間板はこの方法で約14日間培養することができます。これらの特注の検体チャンバーを使用することで、適切な機械的負荷が維持され、培養期間の延長が可能になります。まず、前述と同様に、椎間板1枚につき5%胎児牛血清を含む滅菌DMEM培養液40 millilitersを準備します。次に、反転可能なディスクを特製の培養チャンバーのいずれかに配置し、調製したばかりの培地を 40 milliliters 加えます。フローフード内でチャンバーを閉じます。特製の検体チャンバーを組織培養インキュベーターに設置します。椎間板の表面積に応じて、チャンバーに重りを加えます。まず、椎間板1個あたり、PBSで調製したproso redなどの蛍光色素の1%溶液を100 milliliters準備します。次に、椎間板をこの溶液に浸し、同一条件下で一晩インキュベートします。インキュベーション後の遊離膨潤培養については、ディスクを液体窒素で急凍結させ、その後-80 °Cのアセトンに浸漬させます。次に、-20 °C、4 °C、そして最終的に室温のアセトン中でそれぞれ24時間インキュベートし、椎間板をゆっくりと室温に戻します。ディスクが室温に復帰した後、標準的な手順に従って、ポリメチルメタクリレートで1〜2週間かけて完全に包埋します。完全に包埋させた後、ディスクを鋭い刃で切断し、研磨機で研磨して処理します。処理後、ディスク全体へのpro cy redの拡散を顕微鏡で評価できます。これらの画像は、自由膨潤拡散実験の結果を示しています。パネルCは、我々の手法で2つの骨端板を準備した反転可能なディスクのX線概要図を示しています。上側では、成長板を除去せずに蛍光顕微鏡下で撮影しました。gpとラベル付けされた成長板の存在により、赤色蛍光染料の拡散が妨げられており、成長板が軟骨端板の深層および反転可能なディスクへの染色の障壁として機能していることがわかります。成長板は、coと記された一次および二次骨化中心の間に位置しています。成長板が正常に除去されていれば、赤色蛍光染料はnpと記された髄核まで妨げられることなく拡散します。これらの画像は、ジェット洗浄処理によるクリーニング効果を示しています。矢状断切片の厚さは約100 micronsであり、骨端板の厚さは約1.5 millimetersです。ここでは、椎間板にジェット洗浄処理が施されており、端板全体に染料が拡散しているのが確認できます。一方、ジェット洗浄処理を行っていない対照側では、染料は十分に拡散していません。ここでは、このジェット洗浄法で調製し、自由膨潤条件下で保持したウシ椎間板セグメントから撮影した生死判定共焦点顕微鏡画像を示します。髄核極突起はnp、内側線維環はIA、外側線維環はoaと表記されています。緑色の領域はカルシウム・アセチルメチルエステルで染色された生存細胞であり、赤色の領域はエチジウムホモダイマー1で染色された死細胞の核です。同一領域からの画像により、自由膨潤条件下で14日間経過後も、緑色の蛍光で示される多数の生存細胞が維持されていることがわかります。このグラフは、21日間の培養期間における椎間板の髄核および線維輪領域の細胞生存率を示しており、6つのサンプルの平均値に標準誤差を加減した結果となっています。示した通り、群間の統計学的有意差は、非パラメトリックなWilcoxon符号付き順位和検定を用いて検証されました。髄核においては、21日目とそれ以外のすべての時点との間に有意な差が認められた一方、線維輪においては、7日目から0日目にかけて有意な差が認められた。本手順に従えば、機械的負荷、栄養因子、または成長因子がこの変性や再生の進行に与える影響といった追加の疑問に答えるために、この培養条件を修正することが可能である。本プロトコルは採取技術を迅速化し、組織工学的アプローチや生理学、メカノバイオロジーの測定に利用可能な、解釈可能なディスクセグメントの取得を可能にする。従来の手法では、組織学的手法やバンドソー、あるいはベアリング技術が用いられていたが、これらは本プロトコルよりも約2時間長く時間を要する。

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Research

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Bioengineering

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