Name: 血管のCaの可視化 2 +パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: 学ぶ血管カルシウムシグナリングの可視化法。マクロファージ由来ROSをきっかけにした血管内皮細胞のカルシウム動員を共培養モデルと蛍光イメージングで観察します。血管生物学と細胞シグナル伝達の理解に役立ちます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この作品は、MMに健康補助金（R01 HL086699、HL086699 - 01A2S1、1S10RR027327 - 01）の国立研究所によってサポートされていました。私たちの記事は、部分的にカールツァイスマイクロイメージングLLCによってサポートされています。

活性酸素種が酸化感受性色素（1＆2）を使用するか、共焦点顕微鏡によるプラスミドセンサー（3＆4）を用いて生細胞で測定することができます。 1。 J774細胞における細胞質ROSの可視化<ol><li> 48時間、35 - mmディッシュ（ハーバード装置）ガラスの底にJ774.1マウス単球由来マクロファージを（10 6細胞/ ml）を成長する</li><li> 37℃6時間℃：TLRアゴニスト（1μg/ mlのLPS - TLR4アゴニスト; C）- TLR3アゴニスト10μg/ml、ポリ（I 2μg/ mlを、リポ - テイコ酸- TLR2アゴニスト）とチャレンジの細胞 注：同様の条件下で処理したマクロファージが共存培養モデルのCa 2 +動員のために使用された。 </li><li>追加染料H 2 DCF - DA（Invitrogen社）がECMで、10μMの最終濃度を（細胞外培地与えるために酸化感受性：121 mMのNaCl、5mMの飽和NaHCO 3、10mMののNa - HEPES、4.7 mMの塩化カリウム、1.2 mMのKH 2 PO 4、1.2 mMのMgSO 4を 、2mMのCaCl 2を 、10mMグルコース、2.0％デキストラン、pH7.4の、Sigma社から入手したすべての）共焦点顕微鏡下で可視化する前に20分間料理とインキュベート細胞に2％BSAを含む。 </li><li>染料ロード後に、適切なイメージングシステムの温度制御されたステージ上に置か細胞を可視化する。我々は40倍油浸対物13（図1AおよびD）を使用してDCF蛍光用488nmの励起にアルゴンイオンレーザ光 ​​源と組み合わせることカールツァイスLSM 510のメタ共焦点イメージングシステムを使用してください。 </li><li> ImageJのソフトウェア（1.44）、国立衛生研究所から自由に入手可能なソフトウェアを（Rasband、WS、ImageJは、米国国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国、使用して画像を分析<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij /</a> 、1997〜2009）。 </li></ol> 2。 J774細胞におけるmROSの可視化<ol><li> 48時間、35 - mmディッシュ（ハーバード装置）ガラスの底にJ774.1マウス単球由来マクロファージを（10 6細胞/ ml）を成長する</li><li>mROSの生産誘導するTLRリガンドで細胞に挑戦（2μg/ mlを、リポ - テイコ酸- TLR2を、10μg/ml、ポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）37 6時間℃ですC. </li><li> ° CのMitoSOXレッドのロードを許可するために37℃で30分間料理とインキュベート細胞に2％BSAを含むECMの5μMの最終濃度を得たミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターMitoSOXレッド（Invitrogen社）を追加します。 </li><li>染料ロード後に、40倍油浸対物（図1BおよびE）を使用してMitoSOX赤蛍光のための561 nmの励起でのアルゴンイオンレーザー光源を持つカールツァイスLSM 510メタ共焦点イメージングシステムの夫婦の温度制御されたステージ上で細胞を可視化する。 </li><li>対照実験のため、色素ローディング追加PBSまたはDMSO（ネガティブコントロール）または2μmののアンチマイシン後（ミトコンドリアのスーパーオキシドのような発電機陽性対照）細胞への事前の画像サンプルを2.4（図1C）で説明したように。 </li><li> ImageJのソフトウェア（1.44）を使って画像を分析する。 </li></ol> 3。 Visualizati安定したハイパーCYTO MPMVECsにおける細胞質ROSの上<ol><li>我々はpHyPer - CYTO（Evrogen）哺乳動物発現ベクターのエンコーディング細胞質およびH 2 O 2 14の特に感覚マイクロモル以下の濃度に局在する蛍光センサーのハイパーを使用してください。 </li><li>エレクトロポレーションまたはトランスフェクション試薬のいずれかを使用してpHyPer - CYTOベクターでトランスフェマウス肺微小血管内皮細胞（MPMVECs）。我々は、バイオラッドジーンパルサーエレクトロ系（、500μF250V）を用いてエレクトロを経由してpHyPer - CYTOの10μgの10 × 10 6個の細胞とトランスフェを使用してください。 DMEM培地で培養MPMVECsは、10％FBS、非必須アミノ酸、内皮細胞増殖サプリメントと抗生物質を補充した。 注：以下のトランスフェクション、コロニーの成長を促進するために低密度でプレートの細胞。 </li><li> 500μg/ mlのG418、トランスフェクション後48時間を添加した完全培地で培地を交換してください。 Hの割合が最も高いを持つクローンの画面ハイパー陽性細胞（図2）の数を増やすことyPer陽性細胞と継代ハイパー陽性クローン。 注：私たちは、非常にハイパーを発現する安定細胞の単一細胞とスクリーンのクローン選択のために細胞の希釈系列を使用する。 </li><li> 0.2パーセントゼラチンコートしたカバースリップ（80％コンフルエント）で安定したハイパーCYTO MPMVECsを成長する。 TLRのリガンドと翌日のチャレンジ細胞（2μg/ mlを、リポテイコ酸- TLR2、10μg/ml、ポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）6時間37℃未処理の細胞は、対照として役立つ。 </li><li>治療後、Attofluorセル室（Invitrogen社）にカバースリップをマウントします。チャンバーへのハンクス平衡塩溶液（HBSS）を暖め、事前の1mlを追加し、カールツァイスLSM 510メタ共焦点イメージングシステムの温度制御されたステージ上のチャンバーを配置。視覚化し、40倍油浸対物（図3AおよびD）を用いて488nmの励起での画像の蛍光の変化。 </li><li> ImageJのソフトウェアを（1.44）（セクション6を参照）を使用して画像を分析する。 </li></ol>安定したハイパーdMito MPMVECsにおけるミトコンドリアROSのitle"&gt; 4。可視化<ol><li>我々はpHyPer - dMito（Evrogen）H 2 O 2の、特にミトコンドリアと感覚マイクロモル以下の濃度に局在する哺乳動物発現ベクターのエンコーディングミトコンドリアを標的としたハイパーを使用してください。 </li><li>トランスフェクションのpHyPer - dMitoとMPMVECsとは、セクション3.2から3.3で説明されている手順に従って、安定したハイパーdMitoのMPMVECsを生成します。 </li><li> 0.2パーセントゼラチンコートしたカバースリップ（80％コンフルエント）で安定したハイパーdMito MPMVECsを成長する。 </li><li> TLRのリガンドと翌日のチャレンジ細胞（2μg/ mlを、リポテイコ酸- TLR2、10μg/ml、ポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）6時間37℃未処理の細胞は、ネガティブコントロールとして機能します。 2μmのアンチマイシン（ミトコンドリアスーパーオキシド誘導物質陽性対照は）前に視覚化するためにサンプルを追加。 </li><li>治療後、Attofluorセル室（Invitrogen社）にカバースリップをマウントします。チャンバーに予め温めておいたハンクス平衡塩溶液（HBSS）1mlのを追加します。とカールツァイスLSM 510メタ共焦点イメージングシステムの温度制御ステージにチャンバーを配置。視覚化し、40倍油浸対物（図3B、CとE）を用いて488nmの励起での画像の蛍光の変化。 </li><li> ImageJのソフトウェアを（1.44）（セクション6を参照）を使用して画像を分析する。 </li></ol> 5。のCa 2をトリガパラクリン由来ROSの可視化のための共培養モデル+内皮細胞のシグナル伝達我々は、Ca 2を使用する [Ca 2 +] iの変化+感受性蛍光色素フルオレセイン- 4 AM（Invitrogen社）の可視化と計測のための。 <ol><li> 0.2パーセントゼラチンコートした25ミリメートルのガラスのカバースリップ（80％コンフルエント）にMPMVECsを成長する。 </li><li> ECMの30分が2％BSAと5μMであるFluo - 4 AM（Invitrogen）を蛍光- 4 AMをロードできるように、最終濃度0.003％のプルロニック酸を含むため、室温でカバースリップ上で培養した細胞をインキュベートする。ロード後に、実験的なイメージングソリューション（ECM、0を含むで細胞を洗浄する。色素の損失を最小限に抑えるためにスルフィンピラゾンを含む25％BSA）。 </li><li> Attofluorセル室（Invitrogen社）にみたFluo - 4、マウントカバースリップをロードした後。チャンバーに予め温めておいた実験的なイメージングソリューションの800μlを追加し、カールツァイスLSM 510メタ共焦点イメージングシステムの温度制御されたステージの上に置きます。 </li><li> 2％BSAを含むECMでセルトラッカー赤CMTPX（500ng/ml）（Invitrogen社）を有するマウス（6時間LPSで処理） -別々のチューブのラベルに非活性化または活性化マクロファージは、野生型またはgp91 phoxの- /のどちらかから分離と0.003％プルロニック酸。実験的なイメージングソリューションの200μlので細胞を洗浄し、懸濁します。 </li><li>チャンバー内のアセンブリの蛍光- 4がロード午前MPMVECsへのラベル付けマクロファージを追加。 </li><li>蛍光- 4 AMと細胞トラッカー赤色蛍光respectivelのための488および561 nmで励起によるアルゴンイオンレーザーを光源とカールツァイスLSM510メタ共焦点イメージングシステムを用いて10〜20分間、緑色と赤色の蛍光ごとに3秒を記録Y（図4 AC）。 注：別の方法として、J774.1細胞株がMPMVECsのCa 2 +動員を誘発するために使用することができる。 </li><li> ImageJのソフトウェアを（1.44）（セクション6を参照）を用いて蛍光- 4蛍光強度の変化を分析。 </li></ol> 6。 ImageJのソフトウェアを使用してデータ分析データ分析のため。LSMのフォーマットのファイルとして共焦点システムから取得した画像を転送。 ZEN 2009年とLSM 510メタ共焦点顕微鏡またはLSM 710多光子共焦点顕微鏡に付属のZEN 2010ソフトウェアは、それぞれ。LSMの形式でファイルを保存します。我々は、このネイティブを使用することをお勧めします。LSMファイルを画像解析のために元の品質が保持される。このファイル形式は、直接J.以下の手順では、単一のイメージの例定量分析を提供する画像解析プログラムのイメージで開くことができます。追加のプラグインは、このデータ解析は必要ありません。 <ol><li> FILE&gt; OPENを使用して画像Jのプログラムで開いている。LSMまたは。TIFFファイル</li><li>タブの画像をクリック&gt; COLOR&gt; SPLITチャンネルと緑とDICのチャンネルを分割。その後の分析のための緑のチャンネルから画像を使用してください。 </li><li>ダブルクリックすると"楕円形ブラシの選択"タブを選択して、20ピクセルの値を設定します。 </li><li>ハイパーCYTO画像では、測定の円形の領域を定義する単一のセルをクリックしてください。その後、選択した領域の強度を測定する"M"キーを押してください。値は、新しい結果ウィンドウに保持されます。 </li><li> "M"キーを押すことによって、続いて別の領域を、選択するために別のセルには"Shift"キークリックを保持することによって、次の。強度は、結果ウィンドウに記録されます。 50種類のセル4-5の手順を繰り返します。 </li><li>ハイパーD -水戸の画像では、楕円ブラシの選択の10のピクセル値を設定します。関心領域（ROI）は、手動で特定の細胞のミトコンドリアを含むトレースする必要があります。 </li><li>フリーハンドを使用して、"M"を押してミトコンドリアの周りの領域をトレースして。 50種類のセル上で6から7の手順を繰り返します。 </li><li>私をコピーします。 Excelシートや結果をプロットするために、任意のソフトウェアで結果ウィンドウと貼り付けの値。我々は、グラフなどのデータをプロットするSigmaPlotのかグラフパッドPRISMのいずれかを使用。 </li></ol> 7。代表的な結果図1は、TLRのリガンドとの挑戦に応じて細胞質とミトコンドリアROS産生を示しています。代表的な共焦点画像は、DCF（細胞質）とMitoSOX赤（ミトコンドリア）刺激の6時間後の蛍光の増加を示す。蛍光の変化は、倍の変化として正規化し、発現させた。 図2は、安定したハイパーCYTOおよびHyper - dMito内皮細胞の生成を示しています。マウス内皮細胞をエレクトロポレーションを介したpHyPer - CYTOまたはpHyPer - dMitoプラスミド構築物でトランスフェクションした。安定してプラスミドを発現する細胞は、2週間のG418で選択した。選択後、希釈した細胞を96ウェルプレートに播種した。個々のコロニーを単離し、均一な発現のために画像化した。 e_content"&gt;図3は、内皮細胞質とミトコンドリアのH 2 O 2レベルの測定を示しています。代表的な共焦点画像は、Hyper - CYTO（細胞質）およびHyper - dMito（ミトコンドリア）刺激の6時間後の蛍光の増加を示す。蛍光強度の変化が正規化されたと倍の変化として表現。 図4は、マクロファージ由来ROS誘発内皮細胞質ゾルのCa 2 +動員の評価を示しています。 LPS刺激マクロファージは、以前は+（[Ca 2 +] iの）インジケーター色素であるFluo - 4細胞内Ca 2でロードされていた肺微小血管内皮細胞（PMVEC）に追加されました。野生型のアプリケーションがLPS活性化マクロファージは、〔Ca 2 +] iは機能的なNADPHオキシダーゼ（gp91 phoxの- / - ）のノックアウトによって減衰したPMVECsに上昇誘発。 <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1。 Visualizatiマクロファージのに携帯ROSとミトコンドリアのスーパーオキシドを生成する。 J774.1細胞はTLR2、3と4配位でチャレンジした。（2μg/ mlを、リポテイコ酸- TLR2、10μg/ml、ポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）を6時間で37℃または（B）ミトコンドリアスーパーオキシドインジケーター（MitoSOXレッド、赤色蛍光）、治療の細胞は、（A）携帯ROSインジケータ（緑色蛍光H 2 DCF - DA）を充填した後。 （C）アンチマイシンAは、ミトコンドリアROS産生のためのポジティブコントロールとして使用した。蛍光強度の変化は、共焦点顕微鏡を用いて評価した。 （D）および平均蛍光変化の（E）定量。 <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2。内皮細胞の細胞質とミトコンドリアROSの指標の安定した発現を生成するの模式図。 <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 図3。 V。内皮細胞質とミトコンドリアのH 2 O 2レベルのisualization安定ハイパーCYTO（）を発現または（B）のHyper - dMitoがTLR2とチャレンジしたMPMVECs、3と4配位子（2μg/ mlを、リポテイコ酸- TLR2、10μgの/ mlのポリ（I：C）- TLR3、1μg/ mlのLPS - TLR4）6時間37℃ （C）アンチマイシンAは、ミトコンドリアROS産生のためのポジティブコントロールとして使用した。治療後、蛍光強度の変化は、共焦点顕微鏡を用いて評価した。 （D）および平均蛍光変化の（E）定量。 <img src="/files/ftp_upload/3511/3511fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図4"> 図4。 ROSは、障害内皮細胞のCa 2 +動員を誘導するマクロファージ由来。 （A）内皮細胞/マクロファージの共培養モデルの研究の模式図。WTとgp91phox欠損マウス（ジャクソン研究所）の両方から（B）新しく単離したマウスマクロファージは6時間に1μg/ mlのLPSによって活性化したMacrophagesが細胞トラッカーレッド（赤）で標識し、パラクリンO 2•評価するためであるFluo - 4ロードPMVECs（緑）の上に追加された- 。シグナリング（C）WTマウスから単離したLPS活性化マクロファージは、大規模で急速なCa 2 +の動員を誘発したPMVECsでgp91phox欠損マウス由来のマクロファージと比較。マクロファージ活性化の検証は、以前は実証されています。

<ol><li>Madesh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+role+for+superoxide+in+InsP3+receptor-mediated+mitochondrial+dysfunction+and+endothelial+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective role for superoxide in InsP3 receptor-mediated mitochondrial dysfunction and endothelial apoptosis.</a> J. Cell. Biol. 170, 1079-1090 (2005).</li>
<li>Droge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+in+the+physiological+control+of+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Free radicals in the physiological control of cell function.</a> Physiol. Rev. 82, 47-95 (2002).</li>
<li>Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reactive+oxygen+species+regulate+cellular+signaling+and+dictate+biological+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes.</a> Trends Biochem. Sci. 35, 505-513 Forthcoming.</li>
<li>Hawkins, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-glutathionylation+activates+STIM1+and+alters+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">S-glutathionylation activates STIM1 and alters mitochondrial homeostasis.</a> J. Cell. Biol. 190, 391-405 (2010).</li>
<li>Madesh, M., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VDAC-dependent+permeabilization+of+the+outer+mitochondrial+membrane+by+superoxide+induces+rapid+and+massive+cytochrome+c+release%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">VDAC-dependent permeabilization of the outer mitochondrial membrane by superoxide induces rapid and massive cytochrome c release.</a> J. Cell Biol. 155, 1003-1015 (2001).</li>
<li>Finkel, T., Holbrook, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidants+oxidative+stress+and+the+biology+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxidants oxidative stress and the biology of ageing.</a> Nature. 408, 239-247 (2000).</li>
<li>Rittirsch, D., Flierl, M. A., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harmful+molecular+mechanisms+in+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Harmful molecular mechanisms in sepsis.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 776-787 (2008).</li>
<li>Sanlioglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+induces+Rac1-dependent+reactive+oxygen+species+formation+and+coordinates+tumor+necrosis+factor-alpha+secretion+through+IKK+regulation+of+NF-kappa%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide induces Rac1-dependent reactive oxygen species formation and coordinates tumor necrosis factor-alpha secretion through IKK regulation of NF-kappa.</a> 276, 30188-30198 (2001).</li>
<li>Hawkins, B. J., Madesh, M., Kirkpatrick, C. J., Fisher, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+flux+in+endothelial+cells+via+the+chloride+channel-3+mediates+intracellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Superoxide flux in endothelial cells via the chloride channel-3 mediates intracellular signaling.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 2002-2012 (2007).</li>
<li>Vliet, A. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases+in+lung+biology+and+pathology%3A+host+defense+enzymes+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases in lung biology and pathology: host defense enzymes and more.</a> Free Radic. Biol. Med. 44, 938-955 (2008).</li>
<li>Babior, B. M., Kipnes, R. S., Curnutte, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+defense+mechanisms.+The+production+by+leukocytes+of+superoxide%2C+a+potential+bactericidal+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent.</a> J. Clin. Invest. 52, 741-744 (1973).</li>
<li>Lambeth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX+enzymes+and+the+biology+of+reactive+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">NOX enzymes and the biology of reactive oxygen.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 181-189 (2004).</li>
<li>Mukhopadhyay, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+of+apoptosis+and+mitochondrial+superoxide+production+in+live+cells+by+flow+cytometry+and+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection of apoptosis and mitochondrial superoxide production in live cells by flow cytometry and confocal microscopy.</a> Nat. Protoc. 2, 2295-2301 (2007).</li>
<li>Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue-scale+gradient+of+hydrogen+peroxide+mediates+rapid+wound+detection+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish.</a> Nature. 459, 996-999 (2009).</li>
<li>Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptors+and+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptors and innate immunity.</a> Nat. Rev. Immunol. 1, 135-145 (2001).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

方法は、細胞を生きたどちら酸化感受性色素やプラスミドセンサーを使用して活性酸素種の迅速かつ定量的な測定を可能にするここで説明する。 TLRのアゴニスト（Toll様受容体）は細胞表面上に存在するTLRを介して細胞を刺激し、下流のシグナル伝達経路15を引き起こす化合物である。我々のプロトコルでは、我々は、3つの異なるTLRアゴニストのVIZを使用し、リポ - テイコ酸- TLR2アゴニスト、ポリ（I：C）。- TLR3アゴニスト、ROSの測定を実証するためのモデル系としてROSを誘導することが報告されているLPS - TLR4アゴニスト。酸化剤感受性色素を用いたROSの測定が迅速であり、ROSの種の様々な測定に使用することができます。プラスミドベースのセンサーハイパーの使用は、選択的にH 2 O 2濃度を検出します。 H 2 O 2は、より安定な酸化剤であり、また安定したセル設定でハイパーCYTOとHyper - dMitoの使用は、ROS感受性蛍光色素の光自己酸化よりも有利に追加されます。ハイパーは、人為的ROS生成が発生すること...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> Attofluor細胞室</td><td>インビトロジェン</td><td> A7816 </td></tr><tr><td>アンチマイシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A8674 </td></tr><tr><td> DMEM低グルコース培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 10567-014 </td></tr><tr><td>内皮細胞増殖因子のサプリメント（心電図） </td><td>州の北部</td><td> 02から102 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>インビトロジェン</td><td> 12662011 </td></tr><tr><td> G418 </td><td>インビトロジェン</td><td> 10131-027 </td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G1393 </td></tr><tr><td> H 2 DCFDA </td><td>インビトロジェン</td><td> D - 399 </td></tr><tr><td> LPS </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> L4516 </td></tr><tr><td> LTA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> L2515 </td></tr><tr><td> MitoSOXレッド</td><td>インビトロジェン</td><td> M36008 </td></tr><tr><td>のOpti - MEM Iには、血清培地を削減</td><td>インビトロジェン</td><td> 51985091 </td></tr><tr><td>ペン/咽頭（10倍） </td><td>インビトロジェン</td><td> 15140163 </td></tr><tr><td> pHyPer - CYTO </td><td> Evrogen </td><td> FP941 </td></tr><tr><td> pHyPer - dMito </td><td> Evrogen </td><td> FP942 </td></tr><tr><td>ポリ（I：C） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P0913 </td></tr><tr><td>プリズムソフトウェア5.0 </td><td>グラフパッドソフトウェア社</td><td></td></tr><tr><td> SigmaPlotの11.0 </td><td> SYSTATソフトウェア株式会社</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン- EDTA（10倍） </td><td>インビトロジェン</td><td> 15400054 </td></tr><tr><td> T - 25フラスコ</td><td>コー​​ニング</td><td> 430639 </td></tr><tr><td> T - 75フラスコ</td><td> BDファルコン</td><td> 353136 </td></tr><tr><td> 96ウェルTCマイクロウェルプレート</td><td> BDファルコン</td><td> 353072 </td></tr><tr><td>禅2009ソフトウェア</td><td>カールツァイス510メタ共焦点顕微鏡</td><td></td></tr></tbody></table>

血管のcaの可視化 2 +パラクリン派生rosをきっかけにシグナリング

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

酸化ストレスは、虚血/再灌流損傷、敗血症を含む病理学的条件の数に関与している。 、H 2 O 2、及びヒドロキシルラジカル-酸化ストレスの概念は、O 2•を含むROSの異常形成（活性酸素種）を指します。活性酸素種は、シグナル伝達、細胞増殖と細胞死1から6を含む細胞プロセスの多数に影響を与えます。 ROSは直接、血管や臓器の細胞を損傷する可能性を持って、そして最終的に最初のROSを介する組織損傷の増幅につながる二次化学反応と遺伝的変化を開始することができます。不可逆的な組織損傷を悪化させる増幅カスケードの主要なコンポーネントは、炎症細胞を循環の動員および活性化です。炎症時に、炎症性細胞は、腫瘍壊死因子-α（TNFα）とIL - 1そのようなサイトカインを産内皮細胞（EC）および上皮細胞を活性化し、さらに炎症反応7を増大させる。血管内皮機能障害は、急性炎症の確立された機能です。マクロファージは不明のままメカニズムによって炎症時に血管内皮機能障害に寄与する。 O 2の細胞外放出におけるマクロファージの結果のアクティベーション• -隣接セル内の病理学的シグナル8をトリガすると、様々な炎症性サイトカイン、。 NADPHオキシダーゼは、細胞型のほとんどにROSのメジャーと主な情報源です。最近では、NADPHオキシダーゼによって生成されたROSは、多くの病態生理学的状態の間にミトコンドリアROS産生を誘導することを私達と他の9,10によって示されています。したがって、ミトコンドリアROS産生を測定することは細胞質ROSの測定に加えて、同様に重要です。マクロファージは、炎症の主要な役割を果たしているフラビン酵素のNADPHオキシダーゼによるROSを生成する。一度活性化、宿主の防御機構11,12で重要である-食細胞NADPHオキシダーゼは、O 2大量の•を生成します。 •パラクリン由来のO 2がは- +動員はまだ仮説であるCa 2を含むパラクリンROS誘発性細胞内シグナルの可視化、血管疾患の病因に重要な役割を果たしている。隣接する内皮細胞へシグナルを伝達するために-私たちは、活性化マクロファージがO 2•のソースとして使用されているモデルを開発した。隣接する内皮細胞のシグナル伝達カルシウムにつながる-このモデルを使用して我々は、O 2•はマクロファージ由来を示しています。

内皮のCa2 +シグナリングのパラクリン由来ROSの誘導を可視化についての洞察を得るために効率的な方法が記載されている。このメソッドは、共培養モデルにおける血管内皮細胞におけるCa 2 +の動員を引き起こしたパラクリン由来ROSを測定を利用しています。

血管のCaの可視化 2 +パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング

酸化ストレスは、虚血再灌流障害や敗血症を含む多くの病理学的状態に関与していると考えられています。酸化...

本手順の全体的な目的は、ペリクリン由来の活性酸素種（ROS）によって誘発される血管内カルシウムシグナリングを可視化することです。これはまず、活性化マクロファージにおいて酸化感受性染料を用いてROSを可視化することによって達成されます。また、プラスミドベースの蛍光センサーを用いることで、内皮細胞におけるROSを可視化することも可能です。次に、共培養モデルにおいて、CellTracker Redで標識した活性化マクロファージとFluo-4で標識した血管内皮細胞を同時に可視化します。最後に、共焦点イメージングシステムを用いて、マクロファージ由来のROSによって誘発される血管内皮細胞内のカルシウムシグナリングを測定します。これらの結果により、ROSレベルを独立して実証できるだけでなく、Peregrine由来のROSによって誘発される細胞内カルシウム動員の同時評価が可能になります。本手法は、血管シグナリングおよびシミュレーター病態生理学的環境を密接に引き起こす2つの異なるシグナル分子の同時評価を可能にします。私の研究室のポスドクであるKarthikとRajが、ROSおよびカルシウム測定、ならびにマクロファージと内皮細胞の相互作用に関する手順を実演します。マウス単球由来マクロファージを底面ガラスの35 mmディッシュで培養します。次に、Toll様受容体アゴニストで細胞を刺激し、37 °Cで6時間インキュベートします。細胞質の可視化のためには、ROS酸化感受性色素を添加し、細胞を20分間インキュベートします。次に、共焦点イメージングシステムの温度制御ステージ上で細胞を可視化します。あるいは、TLR活性化細胞におけるミトコンドリアROSを可視化するには、ミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターを添加し、37 °Cで30分間細胞をインキュベートします。陰性対照として、細胞をPBSで処理し、陽性対照としてDMSOで処理します。また、2 mMのアンチマイシンで細胞を処理します。その後、共焦点イメージングシステムの温度制御ステージ上で、すべての細胞を可視化します。ImageJソフトウェアを使用して、すべての画像データを解析します。この蛍光センサーは、サブマイクロモル濃度の過酸化物を特異的に検出し、哺乳類での発現に基づき、ベクター設計によって細胞質またはミトコンドリアのいずれかを標的とすることができます。エレクトロポレーションを用いて、適切な高発現プラスミドを保持するマウス肺微小血管内皮細胞の安定細胞株を作成します。コロニーの増殖を促進するため、細胞を低密度で完全TMEM培地に播種し、48時間インキュベートした後、培地を選択抗剤を添加した完全培養培地に交換します。ハイパーポジティブ細胞の割合が最も高いクローンをスクリーニングし、培養を拡大して、個々の実験に用いる安定したハイパーポ

visualization-vascular-ca2-signaling-triggered-paracrine-derived

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この資料では、ラット腸間膜血管新生を刺激するための単純なモデルを説明しています。モデルは、単一細胞レベル全体を微小血管網のEN面の可視化を可能に組織内の比較的短い時間の経過とともに毛細管発芽、血管領域と血管密度の劇的な増加を生成します。...

ラット腸間膜具象化：血管新生に関与する細胞のダイナミクスを調べるためのモデル

私たちは、超音波と内視鏡検査という2つの補完的なイメージングモダリティを使用して、癌細胞によって分泌される因子のプールの血管新生の可能性を説明するためのマトリゲルプラグアッセイについて説明します。細胞外マトリックス(ECM)模倣ゲルであるマトリゲルは、コンディショニング培地(C.M.)に分泌される血管新生因子を宿主(マウス)に導入するために使用されます。...

急成長腫瘍生成細胞によって分泌される因子によって募集のモニタリング機能と血管系の形態

ここでは、マウスの体性感覚皮質にRose Bengal光血栓をin vivoで誘導するための半侵襲的光学顕微鏡法のアプローチについて説明します。...

共焦点光学イメージングによるローズベンガル光血栓<em&gt;インビボ</em&gt;：単一の容器ストロークのモデル

誘導多能性幹細胞(iPSC-EPs)に由来する内皮前駆体は、心血管疾患治療に革命を起こさせ、より忠実な心血管疾患モデルの作成を可能にする可能性を秘めています。本明細書において、三次元(3D)コラーゲン微小環境におけるiPSC-EPの封入およびこれらの細胞の血管球電位の定量分析について説明する。...

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

冠状血管新生のインビトロモデルは、冠状血管新生の細胞および分子機構の発見に利用することができる。静脈内および心内膜組織のインビトロ外植培養はVEGF-Aに応答して強固な成長を示し、in...

冠動脈血管新生のインビトロモデル

設計された組織は、重要な栄養素やガスを提供し、代謝廃棄物を除去するために適切な血管ネットワークに大きく依存しています。この研究では、内皮細胞と支持細胞の段階的な播種プロトコルにより、制御された3D環境における血管挙動の開発を研究するための高スループットプラットフォームで、高度に組織化された血管ネットワークを作成する。...

発芽血管を研究するためのテッセレーション足場の段階的な細胞播種

細胞外グルタミン酸誘発全身カルシウムシグナル伝達は、植物における機械的創傷および草食動物攻撃に対する植物防御応答の誘導にとって極めて重要である。本稿では、カルシウムとグルタミン酸に敏感な蛍光バイオセンサーを発現する シロイヌナズナ植物...

シロイヌナズナにおける局所および全身創傷信号の広視野、リアルタイムイメージング

このアッセイは、3Dコラーゲンゲルで培養した胚様体に分化したマウス胚性幹細胞を利用して、 in...

インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

本研究では、パラクリンの非標準的なWntシグナル伝達イベントを in vitroで 研究するための再現性が高く扱いやすい方法を概説しています。このプロトコルは、マウス神経堤細胞および筋芽細胞におけるパラクリンWnt5aシグナル伝達の影響を評価するために適用されました。...

in vitroでのパラクリン非標準Wntシグナル伝達のモデリング

この研究では、2次元(2D)スクラッチ創傷移動アッセイと3次元(3D)スフェロイドスプラウティングアッセイ、およびRNA抽出や免疫細胞化学などのそれぞれのダウンストリーム分析方法が、 in...

Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

学ぶ血管カルシウムシグナリングの可視化法。マクロファージ由来ROSをきっかけにした血管内皮細胞のカルシウム動員を共培養モデルと蛍光イメージングで観察します。血管生物学と細胞シグナル伝達の理解に役立ちます。

血管のCaの可視化^{2 +}パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング

さらに動画を探す