血管のCaの可視化 ^{2 +}パラクリン派生ROSをきっかけにシグナリング

この手順の全体的な目標は、周分泌由来の活性酸素種またはrosによって引き起こされる血管カルシウムシグナル伝達を視覚化することです。これは、まず活性マクロファージ中の酸化感受性色素を用いてR osを可視化することで達成されます。ROSは、プラスミドベースの蛍光センサーを使用して、内皮細胞内でも可視化できます。

次に、細胞トラッカーの赤色標識活性化マクロファージと、共培養モデルで4つの標識内皮細胞のインフルエンザを同時に視覚化します。最後に、マクロファージ由来のROSによって引き起こされる内皮細胞のカルシウムシグナル伝達を測定します。共焦点イメージングシステムを使用する。

これらの結果は、R osレベルを独立して示すだけでなく、同時にペレグリン由来のROSによって引き起こされる細胞内カルシウム動員を評価することができます。この方法により、血管シグナル伝達とシミュレータの病態生理学的設定を密接に引き出す2つの異なるシグナル伝達分子の同時評価が可能になります。私の研究室の2人のポスドク、KarthikとRajは、生とカルシウムの測定、およびマクロファージ内皮細胞の相互作用の手順を実演します。

マウス単球由来マクロファージをガラス底35mm皿で培養。次に、Toll様受容体アゴニストで細胞を攻撃し、摂氏37度で6時間インキュベートします。細胞質の可視化に。

ROSは酸化感受性色素を添加し、細胞を20分間インキュベートします。次に、共焦点イメージングシステムの温度制御されたステージで細胞を視覚化します。あるいは、TLR活性化細胞のミトコンドリアROSを可視化するために、ミトコンドリアスーパーオキシドインジケーターを添加し、細胞を摂氏37度で30分間インキュベートします。

ネガティブコントロールの場合は、ポジティブコントロールのために細胞をPBSまたはDMSOで処理します。細胞を2ミリモルのアンチマイシンで処理します。A 共焦点イメージングシステムの温度制御されたステージ上のすべての細胞を視覚化します。

image Jソフトウェアを使用して、すべての画像データを解析します。蛍光センサーhyperは、過酸化物のサブマイクロモル濃度を特異的に感知し、哺乳類の発現に基づいて、ベクター設計は細胞質またはミトコンドリアのいずれかに標的を絞ることができます。エレクトロポレーションを使用して、不適切な過剰発現プラスミドを持つマウス肺微小血管内皮細胞の安定した系統を作成します。

完全TMEMで低密度のコロニー増殖プレート細胞を促進し、48時間インキュベートするには、培地を選択抗生物質を添加した完全培地に交換します。ハイパーポジティブ細胞の割合が最も高いクローンをスクリーニングし、培養物を増幅して、個々の実験で安定したハイパーポジティブラインを作成します。0.2%ゼラチンコーティングされたカバースリップ上のシードセルを一晩で80%コンフルエンスまで培養します。

次に、TLRリガンドで細胞を活性化し、摂氏37度で6時間インキュベートします。細胞質性ROSを検出するには、細胞のカバースリップをアデロ細胞チャンバーに取り付けます。1ミリリットルの予熱タンクを追加し、塩溶液のバランスを取り、チャンバーを共焦点イメージングシステムの温度制御ステージに置きます。

細胞内の蛍光変化を記録し、ミトコンドリアを検出します。ROSです。2マイクロモルのアンチマイシンAのポジティブコントロールを含め、次に、共焦点顕微鏡検査のために処理された細胞のカバースリップを準備します。image Jソフトウェアを使用して画像解析を行います。

ゼラチンコーティングされたガラスカバースリップ上で80%コンフルエンスまで増殖した内皮細胞から始めて、細胞内カルシウムの変化を可視化および測定します。蛍光色素インフルエンザoh 4:00 AMに室温で30分間細胞をインキュベートし、色素損失を最小限に抑え、suen pyro zoneを含む実験イメージング溶液で細胞を洗浄します。次に、マウントカバーを800マイクロリットルの予熱済み実験イメージング溶液でアデロ細胞チャンバーに滑り込ませ、細胞を別のチューブ内の共焦点イメージングシステムの温度制御ステージに配置します。

セルトラッカーred C-M-T-P-Xを1ミリリットルあたり500ナノグラムで15分間使用して、調査中のマクロファージ集団を標識し、細胞を洗浄し、ペレットを200マイクロリットルの実験イメージング溶液に再懸濁します。次に、ラベル付けされたマクロファージをインフルエンザoh 4:00 AMロードに追加します。共焦点チャンバーアセンブリ内の内皮細胞は、3秒ごとに緑と赤の蛍光を10分間記録します。

この実験では、J 7 74 0.1細胞にTLR 2、3、および4つのリガンドを6時間挑戦しました。代表的な共焦点画像は、DCFによって測定された細胞質のR osの増加を示しています。興味深いことに、有糸分裂ソックスの赤い蛍光は、ミトコンドリアROSの同様の増加を示しています。

これらの蛍光変化は定量的です。したがって、結果は正規化され、治療ごとの相対的な倍率変化として表されなければならず、アンチマイシンAシグナルはミトコンドリアROS産生の陽性制御を検証します。この図は、安定的に発現するHyper CytoまたはHyper D mitoにおける内皮、細胞質、およびミトコンドリアの過酸化物レベルの画像を示しています。

MP ECSをTLRアゴニストで刺激。平均蛍光変化の定量は、共培養システムでの6時間の刺激後にhyper cytoおよびhyper D mito蛍光の増加を示しています。野生型とGP 91 Foxヌルマウスの両方から新たに単離されたミリンマクロファージを活性化したペレグリンROSシグナルを評価するために、LPSの1ミリリットルあたり1マイクログラムで6時間活性化しました。

マクロファージはC-M-T-P-Xで赤色にラベル付けされ、緑色のインフルエンザ4に添加されました。ロード。MPM ecs.興味深いことに、野生型マウスから単離されたLPS活性化マクロファージは、GP 91 Foxヌルマウスのマクロファージと比較して、MPM ECSで大規模かつ迅速なカルシウム動員を引き起こしました。

LIの試みはこの手順を実行しますが、長時間のダウンロードまたはレーザー曝露のいずれかがDCFの自動酸化につながることを覚えておくことが重要です。ハイパーサイトおよびハイパーD僧帽弁の光退色を避けることが重要です。一度習得すると、マクロファージや内皮細胞のRA測定は、適切に実施されれば7時間で行うことができます。