Name: 脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: 学ぶ蛍光相関分光法による脂質ラフトの動態解析。生細胞膜におけるGM1ガングリオシドの分配を定量化し、拡散時間の違いから微小ドメインの挙動を解明する手法を習得できます。

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1。 FCSセットアップのキャリブレーション<ol><li>温度とCO 2制御のための共焦点顕微鏡、レーザー、コンピューター、インキュベーターを開始します。 </li><li> SPAD（単一光子アバランシェダイオード）が上にあり、SPAD内部の蛍光フィルターはよくあなたのサンプルに適していることを確認してください。 SPADは、時間で同期されていることを確認します。あなたのSPAD設定が取得の準備ができているに一度だけあなたのFCSのソフトウェアを起動するために注意してください。 </li><li> 1μg/ mlの（17.5 nm）の濃度に到達するためにPBSで希釈したコレラ毒素-Alexa488の新鮮な溶液を調製します。 </li><li>顕微鏡の内部検出を使用したソリューションの共焦点イメージングを最適化します。 </li><li>スキャンモードを指し、溶液試料中のポイントを選択するスイッチ。レーザー照射の時間は（&gt; 5分）あなたのFCSの買収を実行するために十分な長さであることを確認してください。 </li><li> SPADによる外部検出およびFCSのソフトウェアに切り替えます。あなたの蛍光シグナルを監視し、それがよく隋であることを確認してくださいSPADのテッド（十分な信号がない彩度、10 000 50 000までカウント/ sで結構です）。必要であれば、z位置、利得および/または適切な蛍光シグナルを達成するためにレーザーパワーを変更します。 </li><li> 30秒測定の10セットを取得します。アクイジション時間（最高サンプリングと退色の問題の間の妥協点）をサンプル用に最適化する必要があります。 </li><li> 図 （（約0.2ミリ）が溶液中に拡散1蛍光種に対応する自己相関曲線（ 図の式2）を持っていることを確認して、フィッティング後に得られる拡散時間が正しいことをする（ステップ4を参照）データを分析する3）。 </li></ol> 2。脂質ラフトマーカーと共に生きた細胞の染色<ol><li>ポリ-L-リジン（1mg/ml）の接着が正しいことを確認するために、イメージングの前日で被覆された8ウェルLabteks上にプレートしたHEK293細胞。蛍光シグナルのない摂動がないことを確認するにはフェノールレッドを含まない培地を使用しています。 </li><li>HBSS（ハンクス緩衝塩溶液）で細胞を2回洗浄します。 </li><li> 37℃で30分間細胞に500μlのHBSSでコレラ毒素-Alexa488（1μg/ ml）を/ BSA（0.1％）を追加℃、コレラ毒素は、優先的に脂質ラフトに分割することが知られているガングリオシドGM1に結合するであろう。 </li><li> HBSS（ハンクス緩衝塩溶液）で細胞を2回洗浄します。 </li></ol> 3。生きている細胞にFCSデータ·アクイジション<ol><li>顕微鏡ステージ上で染色した細胞を配置します。温度とCO 2の条件は、これは拡散時間の工芸品につながる可能性がありそうでなければ最適であることを確認してください。 </li><li>顕微鏡内部の検出（ 図4）を使用して、目的の細胞の共焦点イメージングを最適化します。 </li><li>スキャンモードを指し、目的の細胞の原形質膜内のポイントを選択して切り替えます。細胞が取り込み中に移動されていないことを確認するには、セル1-2のライブ映像を実行します。 </li><li> SPADすることにより、外部検出に切り替えて、FCSソフトにウェア。あなたの蛍光シグナルを監視し、それがよく（十分な信号がない彩度、10 000から50 000カウント/ sは結構です）SPADに適していることを確認してください。必要であれば、z位置、利得および/または適切な蛍光シグナルを達成するためにレーザーパワーを変更します。これが十分でない場合は、染色条件を変えると考えるかもしれません。 </li><li> 30秒測定の10サンプルを取得します。ほとんどの細胞は自動蛍光性であるように、自家蛍光フェージングに起因する、最初の買収時の蛍光の減少が表示されることがあります。 </li></ol> 4。 FCSデータ解析<ol><li>相関間隔を設定し、FCSのソフトウェアとの自己相関曲線を生成します。相関間隔は一般的に最大の相関時間は合計捕捉時間に近づくと最短解決の遅れ時間から最大可能な最長時間に（測定の統計はますます不十分になると、最大遅延時間が80％に制限されている範囲になりますPicoqua上に捕捉時間NTソフトウェア）。 </li><li>それぞれのサンプルについては、時間の関数としての蛍光の変動と自己相関に対応するファイルをエクスポートします。 </li><li>データ分析と、そのようなファイルをインポートするには、Originのプロとしてフィッティングソフトウェアを使用しています。 </li><li>それぞれのサンプルについては、蛍光が30秒の間に安定したまま、すなわち全く退色は、取得時に存在しないことを確認してください。これは人工的な長い拡散時間の原因となりますので退色が表示され、任意の測定値を破棄します。 </li><li>残りのFCSカーブの形状は（ 図5参照）が正しいことを確認します。平均FCSカーブを決定します。 </li><li>適切な数学モデル（ 図2）カーブに合う。このフィットは、あなたの拡散時間（s）と、この（ESE）の拡散時間（s）と拡散分子の割合を与える。 </li></ol> 5。代表的な結果コレラ毒素Alexa488ソリューションとFCSのキャリブレーションの例を図3に示されている強い&gt;。時間の関数として蛍光の個々の対策を確認した後、任意の退色（ 図3A）を示す個人やFCSカーブを算出したわけではありませんでした。 FCSカーブは様々な拡散モデル（ 図2の例）に対応する方程式を装備したを意味します。古典的なフィットの質を決定すると考えパラメータは、決定係数R 2である。 R 2に近い優れた、1に適合している。このケースでは、平均FCSカーブに合わせて、最も正確なモデルが3次元（ 図2および図3Bの式1）で自由に拡散する蛍光分子の集団を記述するものです。フィットから派生した拡散時間は0.32ミリ秒です。カーブフィッティング（ 図3C）およびR 2は係数（0.99906）からの残差はフィットの品質の推定値を与える。 コレラ毒素Alexa488で染色HEK2のFCS解析の例93細胞は、 図5に示します。多面平均FCSカーブの形状が異なる拡散時間で蛍光分子の集団の存在を明らかにする。妨げ拡散（膜面内の2つの次元の拡散）の2次元および3次元で自由に拡散します（ 図2と図5の式（2））：この曲線のベストフィットは、蛍光プローブの3つの集団を持つモデルに対応。この後者の集団は、分泌物やリサイクル経路を介して膜に到達するか、エンドサイトーシスによって細胞膜を残し、それらの膜ターゲットへのバインディングまたはアンバインドのいずれかの膜面、すなわち、外に移動する蛍光分子に対応しています。 GM1に結合したコ​​レラ毒素に対応した膜で2つの拡散時間は、脂質​​ラフトの外に拡散に対応した2つのMS（分子の25％）と、脂質ラフトの拡散に対応する75ミリ秒（分子の50％）であった。すべての光退色に注意してください買収時のINGは、人工的な長い拡散時間はこうしておそらく脂質ラフトドメインのGM1の局在化に向かってバイアスを作成することにつながるでしょう。 <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1。FCSセットアップ（Marquerらから変更された画像12）の模式図<img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2拡散モデルと自己相関曲線をフィットするために使用される対応する式の例を次に示します。構造パラメータSはS = Z 0 / W、Z 0 0 1 / e 2の強度で光軸に沿って効果的な焦点の半径とW0効果的なアラカルトのように書くことができます1 / e 2の強度でteralフォーカル半径。これらの値は、古典的な点広がり関数（PSF）の測定から抽出することができます。 <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> 図3 FCSキャリブレーション用溶液中でのコレラ毒素Alexa488の拡散時間の評価。 30秒の買収の代表例の時間の関数としてA）蛍光変動。 B）式（1）を装備し、30秒の取得の10サンプル（図2を参照）。C）曲線の当てはめからの残差から得られる自己相関曲線を意味します。 <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図4"> 図4：HEK-293細胞は、コレラ毒素-Alexa488で染色した。細胞は内部488nmのレーザーラインでSP5共焦点顕微鏡（ライカマイクロシステムズ、ヴェッツラー、ドイツ）上に結像された。蛍光は500〜X60プランアポクロマートの油浸対物レンズで集められた650 nmである。 <img src="/files/ftp_upload/3513/3513fig5.jpg" alt="図5" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図5"> 図5。HEK293細胞の細胞膜におけるコレラ毒素-Alexa488の拡散時間の評価。 A）（ 図2を参照）、式（2）を装備し、自己相関曲線を意味します。 Bカーブフィッティングから）残差。 （Marquerらから変更された12）

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここで紹介するFCS法は、生きた細胞への関心の蛍光プローブの分割脂質ラフトの高感度で迅速な分析を可能にします。 FCSは、単一光子計数の感度を持つ共焦点顕微鏡の局在化の精度を兼ね備えています。 FCS、標準的な生化学的手法の主な違いは、ラフトの分離又は共パッチの場合のようにFCSがターゲットの脂質ラフトのパーティションではなく、相対的なパーティションの絶対的な決定を可能にすることです。 FCSデータの取得は、各サンプルのために約5分（30秒10の買収）を取り、通常の生化学的手法に比べて、したがって、非常に急速である。この速度は、それが可能な時間に薬物添加に起因するかもしれない脂質ラフトのパーティショニングの摂動を追跡することができます。フィッティングのためにさまざまなモデルを決定するために介して閲覧する必要がありますしかし、自己相関曲線の分析は少しトリッキーなことができます。最も正確なもの。また、取得時に退色することにより、このアーティファクトにつながる可能性がありますので避けなければなりません。 ガングリオシドGM1（ <...

<html><table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>コレラ毒素サブユニットB-アレクサ488 </td><td>インビトロジェン</td><td> C-34775 </td><td> MW（ペンタマー）= 57キロ/モル</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td> SP5 </td><td></td></tr><tr><td>温度とCO 2制御のためのインキュベーター</td><td>寿命イメージングサービス</td><td>キューブとボックス</td><td></td></tr><tr><td> SPAD（単一光子アバランシェダイオード） </td><td> MPD（マイクロ光子デバイス） </td><td> PDMセリエA（100μmの敏感なエリア） </td><td></td></tr><tr><td>高域488 nmのフィルター</td><td> Semrock </td><td>エッジBrightLineロングパスフィルタをブロックする488 nmの パーツ＃ails.aspx？ID = FF01-488/LP-25 &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; FF01-488/LP-25 </td><td></td></tr><tr><td> FCS検出部</td><td> Picoquant </td><td> Picoharp 300モジュール</td><td></td></tr><tr><td>取得と自己相関のソフトウェア</td><td> Picoquant </td><td> SymPhoTime </td><td></td></tr><tr><td>フィッティングソフト</td><td> OriginLabの</td><td> OriginPro8 </td><td></td></tr></tbody></table>

脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（fcs）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS)

過去15年間で、細胞膜が均一ではありませんし、その機能を発揮するマイクロドメインに依存している概念は広く受け入れられるようになっています。脂質ラフトは、コレステロールとスフィンゴ脂質に富んだ細胞膜マイクロドメインである。彼らはこのようなシグナル伝達などの細胞生理学的プロセスにおいて役割を果たしており、人身売買の1,2だけでなく、ウイルスや細菌感染症や神経変性疾患の3を含むいくつかの疾患の主要なプレーヤーであると考えられている。 まだ彼らの存在は依然として論争4,5の問題です。確かに、脂質ラフトの大きさは、このように彼らのダイレクトイメージングを排除し、はるかに、従来の顕微鏡の分解能の限界（200 nm付近）の下で、約20 nmの6であると推定されている。現在までに、脂質ラフト内の目的タンパク質のパーティションを評価するために使用される主な技術は、界面活性剤耐性膜（ラフト）抗体を用いた分離と共同パッチでした。でも広く使われているbeca彼らは、むしろ簡単な実装を使用して、これらの技術は工芸品に傾向があったので、7,8を批判した 。技術的な改良は、したがって、これらの工芸品を克服し、生きた細胞における脂質ラフトのパーティションを調べることができるように必要であった。 ここでは、生きた細胞の細胞膜に蛍光タグタンパク質や脂質の脂質ラフトパーティションの高感度分析手法を提案する。このメソッドは、蛍光相関分光法（FCS）と呼ばれる、脂質ラフトの内側または外側に位置する蛍光プローブの拡散時間の格差に依存しています。実際には、人工膜や細胞培養の両方で明らかなように、プローブは、はるかに高速外緻密な脂質ラフト9,10の内側よりも拡散するだろう。拡散時間を決定するために、分蛍光変動がある（ 図共焦点顕微鏡で細胞の細胞膜に位置し、焦点体積（約1フェムトリットル）内の時間の関数として測定される1）。自己相関曲線は、これらの変動から引き出され、適切な数学的拡散モデル11に取り付けることができます。 FCSは、それらが蛍光標識されている限り、様々なプローブのパーティショニング脂質ラフトを決定するために使用することができます。蛍光タグは、蛍光融合蛋白質の発現によって、または蛍光リガンドの結合によって達成することができます。また、FCSは、最近12を説明したように、人工の膜と細胞株でも初代培養だけでなく使用することができます。また、薬剤の添加や膜脂質組成の変化12の後にパーティショニング脂質ラフトの動態を追跡するために使うことができます。

生きた細胞の原形質膜における蛍光タンパク質の脂質ラフトのパーティショニングを調べるための手法が説明されています。これは、脂質ラフトの内側または外側に位置するタンパク質の拡散時間に格差を利用しています。買収は、コントロール条件でまたは薬物を添加した後、動的に実行することができます。

脂質ラフトの決定は、蛍光相関分光法（FCS）による生細胞の蛍光タグ付きプローブの分割

過去15年間で、細胞膜は均一ではなく、その機能を発揮するためにマイクロドメインに依存しているという概念が広く受け入れられるようになりました。

リピッドラフトは細胞膜内に存在するマイクロドメインであり、シグナリングやトラフィッキングなどの細胞プロセスにおけるオーガナイジングセンターとして機能します。本ビデオでは、蛍光相関分光法を用いて生細胞の細胞膜におけるリピッドラフトへの分配を定量し、ガングリオシド GM1 のリピッドラフトへの分配を検討します。哺乳類細胞を、Alexa 488 標識コレラトキシンBサブユニットを用いてプローブします。共焦点顕微鏡を用いて、脂質ラフトに優先的に分配されるガングリオシドGM1に蛍光タンパク質を結合させます。細胞膜における微小な蛍光変動を測定します。自己相関曲線を生成し、適切な数学的拡散モデルでフィッティングさせることで、Fluorの拡散時間を決定します。プローブは密なリピッドラフトの内部よりも外部でより速く拡散するため、得られた結果は分配レベルを示しています。界面活性剤耐性膜の単離や抗体を用いた共パッチ法などの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、FCSを用いることで、標的の相対的なリピッドラフトパターンではなく、絶対的なパターンを決定できることです。さらに、蛍光標識されていれば、脂質とタンパク質の両方に適用可能です。この手法は、アミロイドβの産生における脂質の重要性など、アルツハイマー病研究分野における重要な疑問への回答に寄与します。これにより、脂質グラフト成分に特異的に結合する新規阻害剤などの重要な発見につながります。まず、蛍光相関分光法（FCS）システムのキャリブレーションから本手順を開始してください。このFCSセットアップは、検出フィルターとアバランシェフォトダイオードを備えた外部検出ユニット、および時間相関単一光子計数システムに接続された共焦点顕微鏡で構成されています。共焦点顕微鏡のレーザー、共焦点イメージング用コンピュータ、およびFCSデータ収集用コンピュータを起動します。次にインキュベーターの電源を入れ、温度を37°C、二酸化炭素濃度を5%に設定します。単一光子アバランシェダイオード（SPAD）の電源が入っており、SPAD内部の蛍光フィルターがサンプルに適していることを確認してください。SPADの時間同期が取れているかを確認します。SPADの設定がデータ収集可能な状態になったら、FCS PICO quantソフトウェアを起動してください。コレラトキシン Alexa 4 88をPBSで希釈し、最終濃度を1 µg/mLとした新鮮な溶液を調製します。この溶液をカバースリップ上にピペットで滴下します。次に、顕微鏡のZ設定を調整し、蛍光が最も強く観察される平面を探します。ポイントスキャンモードに切り替えるには、ブリーチポイントボタンをクリックし、次に画像スクリーンをクリックして、溶液サンプル内のポイント関心領域を選択します。ソフトウェアを使用して、露光時間を5分以上に設定します。これにより、FCS測定を行うのに十分な長さのレーザー照射が確保されます。次にFCSソフトウェアを使用して、spadによる外部検出に切り替えます。蛍光信号が10,000から50,000 counts per secondの範囲にあることを確認してください。目的は、飽和させずに十分な信号を得ることです。同一視野において32回の測定を10セット取得します。サンプリングの質を高めつつフォトブリーチングを防ぐため、サンプルの特性に合わせて取得時間を最適化してください。最適化用のサンプルデータを取得した後、それを用いて自己相関曲線を生成し、そこから蛍光種の拡散時間を決定します。まず最初に。FCSソフトウェアを使用して相関間隔を設定し、溶液中で拡散する蛍光種に対応する自己相関曲線を生成します。32回ごとの測定において、ソフトウェアは各32個のサンプルを独立して分析し、観測値間の類似度を時間間隔の関数として報告する古典的な数学関数を用いて、蛍光強度から自己相関曲線を生成します。相関間隔は通常、分解可能な最短のLAC時間から、可能な最長の時間までになります。ここに見られるように、最大相関時間が全取得時間に近づくにつれて、測定の精度が低下します。ここでは、最大ラグ時間を取得時間の80%に制限しています。次に、各サンプルについて、時間の関数としての蛍光ゆらぎおよび自己相関に対応するファイルをエクスポートします。その後、これらのファイルをOrigin Proなどのデータ解析・フィッティングソフトウェアにインポートし、取得中に光退色が発生しなかったことを確認します。蛍光変動ファイルを確認します。蛍光は30秒間安定している必要があり、平坦な直線として表示されるはずです。蛍光測定値に光退色が認められる場合があります。残りのFCS曲線で拡散時間が人為的に長く算出される可能性があるため、該当するFCS曲線は以降の解析に使用しないでください。各時間点における自己相関値を平均し、平均FCS曲線を決定します。最後に、適切な数式を用いてOrigin Proのフィッティングモジュールを使用し、曲線を適切な数学的モデルにフィットさせます。このフィッティングにより、分子および溶液の拡散時間を求めることができます。この場合、拡散して自由に動いている集団は1種類のみです。得られた拡散時間が正しければ、約0.2 millisecondsとなります。装置の校正は適切に完了しており、今後の実験に使用可能です。校正の確認が済みましたので、本システムを用いて植物相の脂質RAFの分配を測定できます。目的とする4つの生細胞として、HEC 2 93細胞をインキュベーターから取り出します。細胞は、あらかじめポリLリジンでコーティングされた8ウェル Lab-Tek スライドに、前日に播種しておき、十分に接着させておく必要があります。蛍光信号への干渉を防ぐため、フェノールレッド不含の培地を使用してください。ピペットを用いて、細胞が乾燥しないように注意しながら、ウェル内の培地の大部分を静かに除去します。次に、ウェルにHBSSを静かに加えます。この洗浄操作を各ウェルで1回繰り返します。希釈したコレラトキシン Alexa 488を500 µL、細胞に加えて30分間インキュベートします。37 °Cにて、コレラトキシンをインキュベートすると、リピッドラフトに優先的に分配されることが知られているガングリオシドGM1に結合します。以前と同様に、HBSSで細胞を2回洗浄すると、FCSデータ収集の準備が完了します。染色した細胞を顕微鏡のステージ上に配置し、温度と二酸化炭素の設定を確認してください。顕微鏡の内蔵検出器を使用して、目的の細胞の共焦点イメージングを最適化します。膜が十分に染色されている細胞を探します。前述と同様にポイントスキャンモードに切り替え、目的の細胞の細胞膜上の1点を選択します。細胞の撮影中に細胞が移動していないことを確認するため、1〜2枚のスナップショットを撮影します。 previouslyと同様に、SPADによる外部検出およびFCSソフトウェアに切り替え、信号が10,000〜50,000の適切な範囲にあることを確認します。Z位置のゲインまたはレーザー出力を調整してください。ほとんどの細胞に自発蛍光があるため、32回目の測定として10個のサンプルを取得します。自発蛍光の減衰により、最初の取得時に蛍光強度が低下することがあります。平均FCS曲線を決定するために、これまでと同様に蛍光変動を解析します。次に、多相平均FCS曲線を適切な数学的モデルでフィッティングします。Origin Proのフィッティングモジュールを用い、適切な方程式を適用してください。このフィッティングにより、拡散時間およびそれらの拡散時間で拡散する分子の割合が求められます。この図は、コレラトキシンAlexa 488溶液を用いたFCSキャリブレーションの例を示しています。時間関数としての蛍光強度の個々の測定値を確認し、光退色が見られないことを確認した後、個別のFCS曲線および平均FCS曲線を算出しました。平均FCS曲線は、さまざまな拡散モデルに対応する方程式を用いてフィッティングされました。適合度の質を決定するために従来考慮されるパラメータは、決定係数 R squared です。R squared が 1 に近いほど適合度が良く、この場合、最も正確な適合モデルであると言えます。平均 FCS 曲線は、3 次元的に自由に拡散する蛍光分子の集団を記述するものです。フィッティングから得られた拡散時間は0.32 millisecondsです。ここでのフィッティングの品質は、曲線フィッティングの残差およびR2乗（R squared）係数によって評価されます。R2乗値は0.99906であり、良好なフィッティングであることが示されています。Alexa 4 88で染色したコレラトキシンを用いたHC 2 93細胞のFCS分析の例をここに示します。この例では、細胞内に小さな蛍光ドットが存在することから、トキシンがエンドサイトーシスされ始めていることが分かります。これは拡散を評価するためのものです。形質膜におけるコレラトキシン Alexa 4 88の時間経過です。データは、このビデオで説明した通りに収集および分析されました。多相的な平均FCS曲線の形状から、異なる拡散時間を有する蛍光分子の集団が存在することが明らかになります。この曲線の最良適合（ベストフィット）は、3つの蛍光プローブ集団からなるモデルに相当し、そのうち2つは拡散が制限されています。膜平面内のような2次元拡散と、3次元内で自由に拡散する現象が考えられます。後者の集団は、膜平面外を移動する蛍光分子に相当します。言い換えれば、蛍光分子は分泌経路またはリサイクル経路を通じて膜に到達し、膜標的に結合または解離しているか、あるいはエンドサイトーシスによって膜から離脱しています。膜において2つの拡散時間が観察されました。分子の25%は2ミリ秒の拡散速度を示し、これは脂質ラフト外での拡散に対応していました。また、分子の50%は75ミリ秒の拡散時間を示し、これは脂質ラフト内での拡散に対応していました。この手順に代替的な光学構成を組み合わせることで、回折限界以下の単分子検出が可能となり、開発後、より広範な拡散時間の解析が可能になります。この技術により、脂質ラフト分野の研究者は、薬剤投与や細胞株および初代培養細胞における膜脂質組成の変化に伴う、疾患に関連した脂質ラフト分画のダイナミクスを研究する道が開かれました。

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Biology

生物学

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