Name: 慢性ニコチン投与によるマウスノックインで蛍光標識ニコチン性受容体のスペクトル共焦点イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 学ぶスペクトル共焦点イメージング法でマウス脳内の蛍光標識ニコチン性受容体の変化を定量化する技術。慢性ニコチン曝露による受容体アップレギュレーションをサブミクロン解像度で解析し、ニコチン依存症のメカニズム理解に貢献します。

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アンソニーRendaは、ビクトリア研究フェローシップ賞の大学によってサポートされていました。 MyreとWinifredのシム·ファンド、イノベーション助成金、ブリティッシュコロンビア州の知識開発基金のためのカナダの財団 - この研究は自然科学とカナダのディスカバリーグラント工学研究評議会、NARSAD若手研究者賞（RNまで）、ビクトリア財団によってサポートされていました自然科学とカナダのリサーチ·ツールと計測グラント工学研究評議会。我々は優れたマウスの飼育のためにジリアン·マッケイ、クリスティーナ·バーンズ、アリエル·サリバン、ジェニファーマクドナルド、ダニエルMorgadoに感謝します。

<ol><li>Perry, D. C., Davila-Garcia, M. I., Stockmeier, C. A., Kellar, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+nicotinic+receptors+in+brains+from+smokers%3A+membrane+binding+and+autoradiography+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Increased nicotinic receptors in brains from smokers: membrane binding and autoradiography studies.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 289, 1545-1552 (1999).</li>
<li>Schwartz, R. D., Kellar, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinic+cholinergic+receptor+binding+sites+in+the+brain%3A+regulation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nicotinic cholinergic receptor binding sites in the brain: regulation in vivo.</a> Science. 220, 214-216 (1983).</li>
<li>Marks, M. J., Burch, J. B., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chronic+nicotine+infusion+on+tolerance+development+and+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Effects of chronic nicotine infusion on tolerance development and nicotinic receptors.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 226, 817-8125 (1983).</li>
<li>Carlezon, W. A. J., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+GluR1+in+the+midbrain%3A+a+trigger+for+sensitization+to+drugs+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of GluR1 in the midbrain: a trigger for sensitization to drugs of abuse.</a> Trends Neurosci. 25, 610-615 (2002).</li>
<li>Fitzgerald, L. W., Ortiz, J., Hamedani, A. G., Nestler, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+of+abuse+and+stress+increase+the+expression+of+GluR1+and+NMDAR1+glutamate+receptor+subunits+in+the+rat+ventral+tegmental+area%3A+common+adaptations+among+cross-sensitizing+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Drugs of abuse and stress increase the expression of GluR1 and NMDAR1 glutamate receptor subunits in the rat ventral tegmental area: common adaptations among cross-sensitizing agents.</a> J. Neurosci. 16, 274-2782 (1996).</li>
<li>Saal, D., Dong, Y., Bonci, A., Malenka, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+of+abuse+and+stress+trigger+a+common+synaptic+adaptation+in+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Drugs of abuse and stress trigger a common synaptic adaptation in dopamine neurons.</a> Neuron. 37, 577-5782 (2003).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Nashmi, R., Dickinson, M. E., McKinney, S., Jareb, M., Labarca, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+%CE%B14%CE%B22+nicotinic+acetylcholine+receptors+assessed+with+functional+fluorescently+labeled+subunits%3A+effects+of+localization%2C+trafficking%2C+and+nicotine-induced+upregulation+in+clonal+mammalian+cells+and+in+cultured+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of α4β2 nicotinic acetylcholine receptors assessed with functional fluorescently labeled subunits: effects of localization, trafficking, and nicotine-induced upregulation in clonal mammalian cells and in cultured midbrain neurons.</a> J. Neurosci. 23, 11554-11567 (2003).</li>
<li>Nashmi, R., Xiao, C., Deshpande, P., McKinney, S., Grady, S. R., Whiteaker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+nicotine+cell+specifically+upregulates+functional+%C3%8E%C2%B14%2A+nicotinic+receptors%3A+basis+for+both+tolerance+in+midbrain+and+enhanced+long-term+potentiation+in+perforant+path%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Chronic nicotine cell specifically upregulates functional Î±4* nicotinic receptors: basis for both tolerance in midbrain and enhanced long-term potentiation in perforant path.</a> J. Neurosci. 27, 8202-8218 (2007).</li>
<li>Dickinson, M. E., Bearman, G., Tilie, S., Lansford, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-spectral+imaging+and+linear+unmixing+add+a+whole+new+dimension+to+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Multi-spectral imaging and linear unmixing add a whole new dimension to laser scanning fluorescence microscopy.</a> BioTechniques. 31, 1272-1278 (2001).</li>
<li>Nashmi, R., Fraser, S. E., Lester, H., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNashmi%2C+R+%22Molecular+imaging%3A+fret+microscopy+and+spectroscopy%22">Molecular imaging: fret microscopy and spectroscopy</a>. Periasamy, A., Day, R. N. , Oxford University Press. 180-192 (2005).</li>
<li>Zimmermann, T., Rietdorf, J., Girod, A., Georget, V., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+imaging+and+linear+un-mixing+enables+improved+FRET+efficiency+with+a+novel+GFP2-YFP+FRET+pair%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2-YFP FRET pair.</a> FEBS Lett. 531, 245-249 (2002).</li>
<li>Larson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nikon+C1si+combines+high+spectral+resolution%2C+high+sensitivity%2C+and+high+acquisition+speed%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">The Nikon C1si combines high spectral resolution, high sensitivity, and high acquisition speed.</a> Cytometry A. 69, 825-8234 (2006).</li>
<li>Melvin, N. R., Sutherland, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+caveats+of+standard+immunohistochemical+procedures%3A+implications+for+optical+disector-based+designs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Quantitative caveats of standard immunohistochemical procedures: implications for optical disector-based designs.</a> J. Histochem. Cytochem. 58, 577-5784 (2010).</li>
<li>Jones, I. W., Wonnacott, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+doesn%27t+nicotinic+ACh+receptor+immunoreactivity+knock+out%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Why doesn't nicotinic ACh receptor immunoreactivity knock out.</a> Trends Neurosci. 28, 343-345 (2005).</li>
<li>Moser, N., Mechawar, N., Jones, I., Gochberg-Sarver, A., Orr-Urtreger, A., Plomann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+suitability+of+nicotinic+acetylcholine+receptor+antibodies+for+standard+immunodetection+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Evaluating the suitability of nicotinic acetylcholine receptor antibodies for standard immunodetection procedures.</a> J. Neurochem. , (2007).</li>
<li>Whiteaker, P., Cooper, J. F., Salminen, O., Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Brown, R. W., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolabeling+demonstrates+the+interdependence+of+mouse+brain+a4+and+b2+nicotinic+acetylcholine+receptor+subunit+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Immunolabeling demonstrates the interdependence of mouse brain a4 and b2 nicotinic acetylcholine receptor subunit expression.</a> The Journal of Comparative Neurology. 499, 1016-1038 (2006).</li>
<li>Marks, M. J., McClure-Begley, T. D., Whiteaker, P., Salminen, O., Brown, R. W. B., Cooper, J., Collins, A. C., Lindstrom, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+nicotinic+acetylcholine+receptor+protein+underlies+chronic+nicotine-induced+up-regulation+of+nicotinic+agonist+binding+sites+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Increased nicotinic acetylcholine receptor protein underlies chronic nicotine-induced up-regulation of nicotinic agonist binding sites in mouse brain.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. , 337-3187 (2011).</li>
<li>Marks, M. J., Rowell, P. P., Cao, J. Z., Grady, S. R., McCallum, S. E., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+acetylcholine-stimulated+86%5BRb%5D%2B+efflux+and+125%5BI%5D-epibatidine+binding+sites+in+C57BL%2F6+mouse+brain+are+differentially+affected+by+chronic+nicotine+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Subsets of acetylcholine-stimulated 86[Rb]+ efflux and 125[I]-epibatidine binding sites in C57BL/6 mouse brain are differentially affected by chronic nicotine treatment.</a> Neuropharmacology. 46, 1141-1157 (2004).</li>
<li>King, S. L., Caldarone, B. J., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta2-subunit-containing+nicotinic+acetylcholine+receptors+are+critical+for+dopamine-dependent+locomotor+activation+following+repeated+nicotine+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Beta2-subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors are critical for dopamine-dependent locomotor activation following repeated nicotine administration.</a> Neuropharmacology. 47, 132-139 (2004).</li>
<li>Robinson, S. F., Marks, M. J., Collins, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbred+mouse+strains+vary+in+oral+self-selection+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Inbred mouse strains vary in oral self-selection of nicotine.</a> Psychopharmacology (Berl). 124, 332-339 (1996).</li>
<li>Sparks, J. A., Pauly, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+continuous+oral+nicotine+administration+on+brain+nicotinic+receptors+and+responsiveness+to+nicotine+in+C57Bl%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Effects of continuous oral nicotine administration on brain nicotinic receptors and responsiveness to nicotine in C57Bl/6 mice.</a> Psychopharmacology (Berl). , 141-145 (1999).</li>
<li>Rahman, S., Zhang, J., Engleman, E. A., Corrigall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroadaptive+changes+in+the+mesoaccumbens+dopamine+system+after+chronic+nicotine+self-administration%3A+a+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuroadaptive changes in the mesoaccumbens dopamine system after chronic nicotine self-administration: a microdialysis study.</a> Neuroscience. 129, 415-4124 (2004).</li>
<li>Picciotto, M. R., Zoli, M., Rimondini, R., Lena, C., Marubio, L. M., Pich, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+receptors+containing+the+%C3%8E%C2%B22+subunit+are+involved+in+the+reinforcing+properties+of+nicotine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine receptors containing the Î²2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine.</a> Nature. 391, 173-177 (1998).</li>
<li>Fowler, C. D., Lu, Q., Johnson, P. M., Marks, M. J., Kenny, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habenular+%CE%B15+nicotinic+receptor+subunit+signalling+controls+nicotine+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Habenular α5 nicotinic receptor subunit signalling controls nicotine intake.</a> Nature. 471, 597-601 (2011).</li>
<li>Maskos, U., Molles, B. E., Pons, S., Besson, M., Guiard, B. P., Guilloux, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+reinforcement+and+cognition+restored+by+targeted+expression+of+nicotinic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors.</a> Nature. 436, 103-107 (2005).</li>
<li>Matta, S. G., Balfour, D. J., Benowitz, N. L., Boyd, R. T., Buccafusco, J. J., Caggiula, A. R., Craig, C. R., Collins, A. C., Damaj, M. I., Donny, E. C., Gardiner, P. S., Grady, S. R., Heberlein, U., Leonard, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+on+nicotine+dose+selection+for+in+vivo+research%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Guidelines on nicotine dose selection for in vivo research.</a> Psychopharmacology. 190, 269-319 (2007).</li>
<li>Lang, T., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+clusters+at+nanoscale+resolution%3A+more+than+pretty+pictures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Membrane protein clusters at nanoscale resolution: more than pretty pictures.</a> Physiology (Bethesda). 25, 116-1124 (2010).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

<p class="jove_content"&gt;量と特定のイオンチャネルの局在を決定するためのノックインマウスモデルにおける蛍光体の使用は多くの利点を提供しています。そのような普遍的にすべての細胞に発現しているアクチン、などのタンパク質とは対照的に、イオンチャネルは、はるかに少ない数で存在し、それらの発現は困難で、従来の免疫組織化学的手法を介して正確な分析を行うニューロンのサブタイプ間で異なります。 α4YFP遺伝子産物は、同一のプロモーター、エンハンサー、人身売買メカニズムの制御下に、WTレベルで発現しています<sup&gt; 12</sup&gt;。蛍光受容体はまた、WTのイオンチャネルと同じ機能と感度を示す<sup&gt; 12</sup&gt;。免疫組織化学の伝統的な方法は、残念ながら固定げっ歯類の神経組織スライスに一般的な抗体の番号を使用して、不完全抗体の浸透を示す<sup&gt; 17</sup&gt;偏った結果につながる。ノックインモデルは、組織（図6）全体で一貫性の強さのレベルを提供します。いくつかの商用抗体は非特異性の問題があるかもしれませんが<sup&gt; 18、19</sup&gt;、抗体および適切なコントロールを慎重に選択と集中で、1は、CNSにニコチ...

<table border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ミニ浸透圧ポンプ</td><td> Alzet </td><td>モデル2002 </td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td> Teknova </td><td> S5819 </td><td></td></tr><tr><td> （ - ） - ニコチン酒石酸水素塩</td><td>シグマ</td><td> N5260 </td><td></td></tr><tr><td>目薬</td><td>ノバルティス</td><td>涙ジェル</td><td></td></tr><tr><td> Vetbondグルー</td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>シグマ</td><td> H4784 </td><td></td></tr><tr><td> 10倍PBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 70011 </td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td> WyetHアニマルヘルス</td><td> 0856-4403-01 </td><td></td></tr><tr><td> medatomidine塩酸塩</td><td>ファイザー</td><td> 1950673 </td><td></td></tr><tr><td> 23G翼状針</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 367253 </td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 15710 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製の埋め込み型</td><td> VWR </td><td> 18986から1 </td><td></td></tr><tr><td> 10月取付物</td><td>組織 - Tek社</td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Mowiol 4から88 </td><td> EMD-カルビオケム</td><td> 475904 </td><td> pH 8.5の</td></tr></table>

慢性ニコチン投与によるマウスノックインで蛍光標識ニコチン性受容体のスペクトル共焦点イメージング

Spectral Confocal Imaging of Fluorescently tagged Nicotinic Receptors in Knock-in Mice with Chronic Nicotine Administration

中枢神経系（CNS）のリガンド依存性イオンチャネルは、深刻な医学的および社会的影響を持つ多数の条件に関与している。例えば、喫煙を介してニコチンへの中毒は、早死に世界的に（世界保健機構）の主要な原因である可能性が高いと脳1のイオンチャネルの分布の変化によって引き起こされます。 1月3日脳組織内のニコチン性アセチルコリン受容体（nAChRs）数の増加の両方のげっ歯類およびヒトの結果の慢性ニコチン曝露。同様に、グルタミン酸作動性GluN1またはGluA1チャネルの変化は、そのようなコカイン、アンフェタミンとアヘン4月6日のような他の依存性薬物に感作を誘発に関与している。 したがって、特定のイオンチャネルの分布と発現パターンをマッピングし、定量化する能力は、中毒のメカニズムを理解する上で非常に重要です。脳領域特異的EFの研究個々の薬剤のfectsこのような放射性リガンドとしての技術の出現によって進められた。しかし、放射性リガンド結合の低空間分解能は、ニューロンの特定のサブタイプのリガンド依存性イオンチャネルを定量化する能力を防ぎます。 そのような緑色蛍光タンパク質（GFP）とその多くの色の変種とし ​​て遺伝的にエンコードされた蛍光レポーターは、生物学の7分野に革命をもたらしました。遺伝的にタギングすることで蛍光レポーターは1つがin vivoで 7-10 のタンパク質を可視化することができます内因性蛋白質に。プローブを用いた蛍光タグタンパク質の一つの利点は、標的タンパク質に非特異性とアクセシビリティの問題を抱えている抗体の使用の排除です。我々は、トランスフェクションした培養細胞11にフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）を用いた受容体アセンブリーの研究を有効にして蛍光ラベルnAChRs、この戦略を使用しています。最近では、我々は石油公社を使用しているK-のスペクトル共焦点顕微鏡12を介して中枢神経系ニューロンのサブミクロンの解像度で受容体を ex vivoでの正確な定量を可能にする、α4のnAChRサブユニット（α4YFP）をタグ付け黄色蛍光タンパク質を持つエンジニアのマウスへのアプローチ。対象と蛍光ノックイン変異は野生型マウスのタグの付いていない受容体に比較した場合の発現と受容体の調節の正常なレベルを生産する、内因性遺伝子座にその天然のプロモーターの制御下に組み込まれています。このノックインアプローチは蛍光他のイオンチャネルをタグ付けしCNS内の受容体の可視化と定量化の強力なアプローチを提供していますように拡張することができます。 本稿では、慢性的なニコチンへの曝露後、特定のCNSニューロンでのnAChR発現の変化を定量化する方法を説明します。私たちの方法は、ミニ浸透圧ポンプ注入、心臓内灌流固定、蛍光標識ニコチンRECのイメージングと解析が含まれていからeptorサブユニットα4YFPノックインマウス（図1）。我々は、固定脳tissue.We詳細に正確にα4YFP蛍光シグナルを得るためにautofluoresent信号を減算する線形スペクトルアンミキシングアルゴリズムと組み合わせてスペクトル共焦点顕微鏡を使用して、私たちのイメージング手法を説明しますから、蛍光最小限に抑えるために固定技術を最適化しました。最後に、我々は、海馬の内側perforantパス内のα4YFP受容体の慢性的なニコチン誘発性の亢進の結果を示しています。

私たちはより良いアプローチノックインおよびスペクトルを用いた受容体の蛍光タンパク質タグを含むアプローチの組み合わせを使用して、ニコチン中毒のメカニズムを理解するCNSニューロンの特定のサブタイプの細胞内領域内のニコチン性アセチルコリン受容体の変化を定量化する新しい技術を開発しました共焦点イメージング。

中枢神経系（CNS）におけるリガンド門扉型イオンチャネルは、深刻な医学的および社会的影響を及ぼす数多くの疾患に関与しています。...

この手順の全般的な目的は、慢性的なニコチン投与によるマウス脳内における蛍光標識ニコチン受容体の変化を定量化することです。まず、α4 YFPノックインマウスに生理食塩水またはニコチンを満たした小型浸透圧ポンプを植え込みます。処置後、マウスを心内固定し、脳を凍結切片化します。次に、カバーガラスで密封した脳を、スペクトル共焦点顕微鏡を用いてイメージングします。本手順の最終ステップは、リニアスペクトルアンミキシングおよびα4 YFP発現レベルの解析です。最終的に、これらの結果は、慢性的にニコチンに曝露されたマウス脳ニューロンにおいて、サブミクロン解像度でα4 YFPニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットのアップレギュレーションを正確に定量化できる、スペクトル共焦点顕微鏡とリニアアンミキシングの能力を示しています。抗体や放射性リガンドによる標識などの既存の手法と比較した本技術の主な利点は、Y FPSが受容体に付着するように遺伝的にコードされているため、標的受容体をより直接的かつ精密にイメージングできることです。これにより、中枢神経系（CNS）ニューロンにおける受容体局在の高解像度な細胞内イメージングが可能となり、プローブの特異性、染色のムラ、あるいは組織深層の抗原へのプローブ到達に関する潜在的な問題が解消されます。手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるAnthony rdaです。経管灌流で固定した脳を取り出し、カミソリで小脳を切り離します。脳の下にある型（モールド）の底に封入剤を少量滴下し、脳を吻側が上になるようにプラスチック製の封入型に配置します。その後、型をドライアイスに入れます。脳を適切な方向で凍結させた後、型の残りの部分に包埋剤を充填します。次に、クライオスタットを用いて厚さ 30 micron の脳切片を採取します。2本の細い絵筆を使用して、切片をコート済みスライドに転写します。スライドトレイの蓋で常に覆い、脳切片を遮光することを忘れないでください。脳切片は、無水硫酸カルシウムの乾燥剤を1個入れたスライドボックスに保存します。-20 °Cで保存する場合、湿気による冷凍焼けを防ぐため、スライドボックスをZiploc密封袋に入れてください。イメージング前の光退色を最小限に抑えるため、スライドを光源にさらす時間を最小限にしてください。スライドトレイの蓋で覆っておくことで、カバーガラスをかける際の気泡形成を抑えるためにピペットチップを切断して使用することができます。MO Wild 4 88などの、蛍光タンパク質の蛍光を阻害しない封入剤を使用してください。カバーガラスを被せる前に、MOを室温で平衡化させてください。気泡の混入を防ぐため、脳切片のスライドは1枚ずつ処理します。カバーガラスを被せる際にマニキュアを使用しないでください。消光の原

spectral-confocal-imaging-fluorescently-tagged-nicotinic-receptors

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオは、マウス腹側海馬におけるニコチン性アセチルコリン受容体のニコチン媒介活性化が、軸索に沿った持続的なカルシウムシグナル伝達をもたらす方法を示しています。...

シナプス共培養における腹側海馬軸索に沿ったニコチン誘発性カルシウムシグナル伝達のイメージング

本稿では、急性単離した脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するための有用な方法を説明します。このメソッドは、標準パッチクランプ法を用いて記録された神経細胞への薬物のローカルアプリケーションのための薬剤を充填したマイクロピペットの使用を含む。...

マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション

私たちは、ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)を介したシナプス伝達のシナプス前メカニズムを直接ライブイメージングで分析するための、腹側海馬-側坐回路の遺伝子キメラ製剤をin...

ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング

この記事は、ニコチンの調査によるマウス脳切片でニコチン性アセチルコリン受容体 (nAChRs) を研究するための方法を示します。同時パッチ ・...

活性型のニコチンのレーザー フラッシュ ・ フォトリシス法によるマウス脳切片でのニコチン性アセチルコリン受容体の機能を探る

Situハイブリダイゼーション(ISH)におけるマルチプレックスは、成体マウスの全迷頭神経節複合体における2つのGタンパク質共役受容体および1つの転写因子の転写を同時に可視化するために採用された。このプロトコルは、迷走性の刺激性ニューロンの転写プロファイルの正確な地図を生成するために使用することができる。...

マウスバガル・アファレントニューロンにおけるGタンパク質結合受容体発現 の 検出

このプロトコルは、哺乳類のNeuro-2a細胞株を用いたニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットの発現と定量を記述しています。pH感応蛍光タグと共焦点顕微鏡は、pH中性細胞内区画での受容体局在とpH中性細胞内区画での受容体の位置を正確に評価し、nAChRの輸送および薬理学的調節の研究を促進します。...

哺乳類細胞における細胞膜および細胞内ニコチン性アセチルコリン受容体の局在化

このプロトコルでは、カルシウムイメージングの最近の進捗状況を更新...

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

ここでは、アストロサイトのGタンパク質共役受容体の可塑性の研究のためのニューロンにおいて恒常的な可塑性を誘導するために使用されるプロトコルの適合を記載している。最近、幼若マウスにおけるIのmGluRアストロサイトのグループ内の変化を調べるために使用される、この方法は、 インサイチューおよびインビボで 、成体マウスからの組織において、種々の星状細胞GPCRのスケーリングを測定し、星状細胞受容体の感受性のより良い理解を得るために適用することができる神経活動の変化に。...

神経発火率を操作することによってアストロサイト受容体の可塑性を誘導すること

出生後の小脳の発達中に、胚帯に由来する未熟な顆粒細胞は、最終目的地に到達し、ニューロンネットワークを確立するための明確な移動の様相を示します。このプロトコルでは、小脳スライスの準備と、ニューロンの移動を調節する要因を調査するために使用される共焦点巨視的アプローチについて説明します。...

共焦点肉眼検査を使用した生後小脳顆粒細胞の移動のex vivoイメージング

ポストエンベッドイムノゴールド法は、特定の分子の細胞内局在を高解像度で分析するための最も効果的な方法の一つです。ここでは、網膜リボンシナプスにおけるグルタミン酸受容体を定量的に解析するためのプロトコールについて述べます。...

網膜リボンシナプスにおける膜受容体の高分解能定量的イムノゴールド分析

学ぶスペクトル共焦点イメージング法でマウス脳内の蛍光標識ニコチン性受容体の変化を定量化する技術。慢性ニコチン曝露による受容体アップレギュレーションをサブミクロン解像度で解析し、ニコチン依存症のメカニズム理解に貢献します。

慢性ニコチン投与によるマウスノックインで蛍光標識ニコチン性受容体のスペクトル共焦点イメージング

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