Name: 用接着周波数アッセイその場で速度論解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: 学ぶ接着周波数アッセイによる細胞表面受容体・リガンド相互作用の速度論解析。マイクロピペットを用いて赤血球を接着センサーとして機能化し、integrin αLβ2とICAM-1の結合親和性とオフレートを測定する手法です。

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この研究は、NIHの助成金R01HL091020、R01HL093723、R01AI077343、およびR01GM096187によってサポートされていました。

<ol><li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+anchor+influences+ligand+binding+two-dimensional+kinetic+rates+and+three-dimensional+affinity+of+FcgammaRIII+%28CD16%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16).</a> J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+and+independent+binding+of+Fcgamma+receptors+IIa+and+IIIb+to+surface-bound+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG.</a> Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+binding+to+multiple+ligands%3A+kinetic+rates+of+CD16b+for+membrane-bound+IgG1+and+IgG2%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2.</a> Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).</li>
<li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+effects+of+molecular+orientation+and+length+on+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics.</a> J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).</li>
<li>Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+measurements+of+cell+surface+E-selectin%2Fcarbohydrate+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions.</a> Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophys. J. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+carrier+stiffness+and+microtopology+on+two-dimensional+kinetics+of+P-selectin+and+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+%28PSGL-1%29+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions.</a> J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).</li>
<li>Waugh, R. E., Lomakina, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+site+formation%2C+not+bond+kinetics%2C+limits+adhesion+rate+between+human+neutrophils+and+immobilized+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1.</a> Biophys. J. 96, 268-275 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+kinetics+regulation+of+alphaLbeta2-ICAM-1+interaction+by+conformational+changes+of+the+alphaL-inserted+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).</li>
<li>Lomakina, E. B., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+between+human+neutrophils+and+immobilized+endothelial+ligand+vascular+cell+adhesion+molecule+1%3A+divalent+ion+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects.</a> Biophys. J. 96, 276-284 (2009).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chien, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stage+cadherin+kinetics+require+multiple+extracellular+domains+but+not+the+cytoplasmic+region%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region.</a> J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).</li>
<li>Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+MHC-CD8+interaction+at+the+T+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane.</a> J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).</li>
<li>Wasserman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+variant+peptide-mediated+anergy+of+encephalitogenic+T+cells+requires+SHP-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1.</a> J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).</li>
<li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 Forthcoming.</li>
<li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).</li>
<li>Jiang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-stage+cooperative+T+cell+receptor-peptide+major+histocompatibility+complex-CD8+trimolecular+interactions+amplify+antigen+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination.</a> Immunity. 34, 13-23 (2011).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).</li>
<li>Zhu, C., Williams, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+concurrent+binding+of+multiple+molecular+species+in+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion.</a> Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).</li>
<li>Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+leukocytes+in+capillaries%3A+role+of+cell+size+and+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability.</a> J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).</li>
<li>Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+kinetic+analysis+of+Fcgamma+receptor+IIIa+%28CD16a%29+binding+to+IgG+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands.</a> J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+binding+of+fibroblasts+to+fibronectin%3A+optical+tweezers+experiments+and+probabilistic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis.</a> Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).</li>
<li>Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+horizontal+force+probe+for+mechanical+tests+on+pipette-held+cells%2C+particles%2C+and+membrane+capsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules.</a> Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).</li>
<li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophys. J. 74, 492-513 (1998).</li>
<li>Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+competition+binding+between+soluble+and+membrane-bound+ligands+for+cell+surface+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors.</a> Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).</li>
<li>Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+modeling+of+rosette+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Probabilistic modeling of rosette formation.</a> Biophys. J. 91, 352-363 (2006).</li>
<li>Lou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+governs+flow-enhanced+cell+tethering+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear.</a> Biophys. J. 92, 330-342 (2007).</li>
<li>Evans, E., Berk, D., Leung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+of+agglutinin-bonded+red+blood+cells.+I.+Forces+to+rupture+molecular-point+attachments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments.</a> Biophys. J. 59, 838-848 (1991).</li>
<li>Zarnitsyna, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+in+receptor-ligand-mediated+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

首尾よく、いくつかの重要なステップを考慮する必要がありますマイクロ接着周波数アッセイを使用する。最初に、興味の受容体 - リガンドシステムのための特異的相互作用を記録することを確認してください。非特異的コントロールの測定値（図3参照、4）特異性を確認してください。理想的には、非特異的付着確率は、すべての接触の継続時間を0.05未満である必要がありますし、各時点の特定と非特異的付着確率の間に有意差を持っているため。別の方法は、赤血球の表面に結合するリガンドを使用することができる。それは、方法17をカップリング塩化クロム、ビオチン-ストレプトアビジンの結合より非特異的結合のより高いレベルを与えたことが示された。 第二に、特定の相互作用のための付着確率はミドルレンジにする必要があります。受容体は構成的に細胞上に発現している場合、この要件は、受容体とリガンド（または赤血球上のみリガンドの密度を変えることによって満たすことができるの変更が困難になっている密度）。この目的のために、未知の受容体 - リガンド結合親和性と新しいシステムをテストするとき、リガンド密度の様々なテ...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ＃ </th><th>コメント</th></tr><tr><td> 10倍PBS </td><td> BioWhittaker </td><td> 17 - 517Q </td><td>使用前に脱イオン水で1Xに希釈する</td></tr><tr><td>バキュテイナEDTA </td><td> BD </td><td> 366643 </td><td>赤血球の分離</td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 10771 </td><td>赤血球の分離</td></tr><tr><td>アデニン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A2786 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td> D -グルコース（ブドウ糖） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G7528 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td> D -マンニトール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 6360 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S7653 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基（ナトリウム＆＃X2082; HPO₄） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> S374 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G5763 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td>ビオチン- X - NHS </td><td>カルビオケム</td><td> 203188 </td><td>赤血球のビオチン化</td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド（DMF） </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 20673 </td><td>赤血球のビオチン化</td></tr><tr><td>ホウ酸緩衝液（0.1M） </td><td>電子顕微鏡学</td><td> 11455〜90 </td><td>赤血球のビオチン化</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 21125 </td><td>官能配位子</td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A0336 </td><td>官能配位子</td></tr><tr><td> Quantibrite PEビーズ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 340495 </td><td>密度の定量化</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td> BD Immunocytometryシステム</td><td> BD LSR II </td><td>密度量子tification </td></tr><tr><td>毛細管 0.7〜1.0ミリメートル× 30&quot; </td><td>キンブルグラス株式会社</td><td> 46485から1 </td><td>引っ張りマイクロピペット</td></tr><tr><td>鉱油</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP2629 - 1 </td><td>チャンバーアセンブリ</td></tr><tr><td>顕微鏡のカバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 12から544 - G </td><td>チャンバーアセンブリ</td></tr><tr><td> PEα-ヒトCD11a クローンHI 111 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 12-0119-71 </td><td>図1のための試薬</td></tr><tr><td> PE抗ヒトCD54 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 12から0549 </td><td>図1のための試薬</td></tr><tr><td>マウスIgG1アイソタイプコントロールPE </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 12から4714 </td><td>図1のための試薬</td></tr><tr><td>油圧マイクロマニピュレーター</td><td>ナリシゲ</td><td> MO - 303 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td>メカニカルマニピュレータ</td><td>ニューポート</td><td> 461 - XYZ - M、SM - 13、DM - 13 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td>圧電変換器</td><td> Physik Instrumente </td><td> P - 840 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td> LabVIEWの</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>バージョン8.6 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td> DAQボード</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td> USB - 6008 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td>光学テーブル</td><td>動力学システム</td><td> 5200シリーズ</td><td>マイクロピペットシステム</td></tr></tbody></table>

用接着周波数アッセイその場で</em細胞間のインタフェースにおけるクロス接合分子間相互作用の>速度論解析

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

マイクロピペットの接着アッセイは、2次元（2D）受容体-リガンド結合速度1を測定するために、1998年に開発されました。アッセイは接着センサーと相互作用する分子のいずれかの提示細胞としてのヒト赤血球（RBC）を使用しています。それは正確に制御領域との結合形成を可能にするための時間と他の相互作用する分子を発現し、他の細胞と接触RBCを持って来るためにマイクロマニピュレーションを採用しています。接着イベントは離れた二つのセルを引っ張って上RBCの伸長として検出されます。赤血球表面上に固定化されたリガンドの密度を制御することにより、密着性の確率は0と1の間のミッドレンジ内に保持されます。付着確率は、所定の接触時間の2つの細胞間の繰り返し接触サイクルの順序で接着事象の頻度から推定される。接触時間を変化させることで結合曲線を生成します。結合する受容体-リガンドの反応速度論1の確率モデルのフィット曲線は、2次元親和性とオフレートを返します。 アッセイは、IgGのFc 1-6、複合糖質リガンド6-9、配位子10-13、homotypicalカドヘリン結合14、ペプチド-主要組織適合遺伝子複合体15とT細胞受容体とレセプターとのインテグリンとセレクチンとのFcγ受容体の相互作用を用いて検証されています- 19。 メソッドは、このような膜microtopology 5、膜アンカー2、分子配向と長さ6、キャリアの剛性9曲20、インピンジメント力20、ならびに生化学的要因として生物物理学的な要因によって2D速度の規制を定量化するために使用されていますこのような相互作用する分子が存在し、これらの分子15,17,19の表面の組織細胞骨格と膜の微小環境の変調器として。 方法は、tをも使用されていますOは、修正モデル21を使用してデュアル受容体-リガンドの種3,4の同時結合、および19 trimolecular相互作用を研究する。 法の大きな長所は、それが彼らのネイティブな膜環境での受容体の研究をできることです。結果は、精製された受容体17を用いて得られたものとは大きく異なる可能性があります。また、よく典型的な生化学的方法を超えて時間分解能を持つサブ秒の時間スケールにおける受容体 - リガンド相互作用の研究が可能になります。 マイクロピペットの接着周波数の方式を説明するために、我々はαLβ2をアクティブにするために溶液中で二量体のE -セレクチンと好中球上のインテグリンαLβ2に結合赤血球の官能細胞間接着分子1（ICAM - 1）の動態の測定を示す。

両分子が相互作用する細胞の表面上に固定されているときに受容体 - リガンド相互作用の動力学を測定するための接着の周波数分析が記載されている。この機械的にベースのアッセイは、相互作用する受容体とリガンドと密着センサーとインテグリンαLβ2と細胞間接着分子-1のようなマイクロピペット、加圧されたヒト赤血球を用いて例示される。

マイクロピペット接着アッセイは、二次元（2D）の受容体-リガンド結合キネティクスを測定するために1998年に開発されました1。このアッセイでは、ヒト赤血球...

本実験の全体的な目的は、相互作用する細胞の表面に両方の分子が固定されている場合の、受容体とリガンドの相互作用速度論を測定することです。これは、まず接着センサーとなる赤血球をリガンドで機能化し、受容体を発現させた細胞を準備することで達成されます。第二のステップとして、マイクロピペットチャンバーを組み立て、接着試験を行い、接着イベントを記録します。次に、細胞の接触時間に対する接着確率の曲線をプロットし、モデルを用いてフィッティングを行います。速度論的パラメータを推定するために、データから算出された二次元有効結合親和性と解離速度を示す結果を得ます。では、このアッセイのアイデアはどこから得られたのでしょうか。受容体とリガンドの相互作用に関する研究が行われています。多くの場合、破断力が測定されますが、私たちも同様のことを行ってきました。しかし、ある日、接着がない場合は0、接着がある場合は1というバイナリ結果のみを測定し、それらの0と1の測定値から速度論的な測定値を導き出すことで、マイクロピペット頻度アッセイを示すことができるのではないかと考えました。私の研究室のリサーチサイエンティストであるVeronica Zana Zina博士が、この実験について説明します。全血から単離した赤血球を、接着頻度アッセイのためにビオチン化します。この手順を開始するには、単離した赤血球を含むチューブを遠心分離し、赤血球ペレットを10 µLずつ複数のバイアルに分注し、各バイアルに相当量のPBSを加えて、複数の赤血球ビオチン溶出濃度を調製します。次に、各バイアルに0.1 MのBore eightバッファーを10 µL加えます。次に、計算した量のビオチン溶液を各バイアルに加え、直ちにボルテックスします。各赤血球バイアルを50 milliliterのコニカルチューブに入れ、ローテーターを用いて室温で30分間インキュベートします。30分後、各バイアルにEAS 45緩衝液を加え、2000 rotations per minuteで2分間遠心分離します。EAS 45緩衝液での洗浄を2回繰り返し、計3回の洗浄を行います。最後に、各バイアルに100 µLのEAS 45バッファーを加え、4 °Cで保存して赤血球表面のリガンドを機能化します。前のステップでビオチン化した赤血球を、飽和濃度のstrep TTRとともに4 °Cで30分間インキュベートし、EAS 45バッファーを用いて2000 rpmで2分間、3回洗浄します。その後、赤血球をビオチン化リガンドと直接インキュベートするか、あるいは赤血球を対応するビオチン化捕捉抗体とインキュベートした後、リガンドとインキュベートします。このビデオで示すプロトコルでは、ビオチン化捕捉抗体を使用しています。マイクロピペットは、低融点ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを用いて作製します。まず、マイクロピペットプラーを用いてキャピラリーチューブを引き伸ばします。次に、マイクロフォージを備えたマイクロマニピュレーターを使用し、マイクロピペットの先端をカットして、目的の開口サイズに調整します。必要な直径は、通常、研究に使用する細胞の大きさに応じて1〜5 µmの範囲となります。セルチャンバーを準備するには、希望のサイズにカットした2枚の顕微鏡用カバーガラスを使用し、エアダスターでカバーガラスからホコリを除去した後、セルチャンバー用培地を加え、培地の蒸発を防ぐために両側からミネラルオイルでチャンバーを封印します。蒸発が起こると、実験中に浸透圧が変化してしまいます。本アッセイで使用されるマイクロピペットシステムは、マイクロピペットで吸引された細胞の動きを観察・記録・分析するためのイメージングサブシステム、セルチャンバーから細胞を選択するためのマイクロマニピュレーションサブシステム、および細胞をマイクロピペット内に吸引するための圧力サブシステムの3つのサブシステムで構成されています。イメージングサブシステムの中心となるのは、100倍の油浸対物レンズを備えた倒立顕微鏡です。対物レンズによる画像は電荷結合素子（CCD）カメラで検出され、ビデオカセットレコーダーに送信されます。時間の経過を記録するため、システムにビデオタイマーを接続します。マイクロピペットに脱イオン水を満たした後、顕微鏡に取り付けられたメカニカルドライブ上のホルダーに配置します。マイクロピペットは、3軸油圧マイクロマニピュレーターを用いて微細な位置調整が可能です。マイクロピペットホルダーの1つは、コンピュータ制御のピエゾ電気トランスレーターに取り付けられています。これにより、ピペットを精密に、かつ接着試験サイクルに合わせて移動させることができます。圧力調節サブシステムは、吸引の制御に使用されます。実験中、油圧ラインがマイクロピペットホルダーと液体リザーバーを接続します。精密機械ポジショナーにより、リザーバーの高さを正確に操作することが可能です。チャンバーの組み立て後、マイクロピペットをセットし、細胞をチャンバー内に注入してアッセイを開始します。相互作用させる細胞をそれぞれのピペットで吸引し、PSO電動トランスレーターを用いて、接触面積と時間を制御しながら、赤血球を好中球に接触させたり離脱させたりします。赤血球が細胞分離時に伸長した場合を接着イベントとして観察し、赤血球の伸長が見られない場合を非接着イベントとします。観察された接着イベントを、接着がある場合は「1」、ない場合は「0」としてExcelスプレッドシートの列に記録してください。各接触時間について、少なくとも3組の異なる細胞ペアを用いて、接着頻度対接触時間の曲線を記録します。コントロールとして平均値とSEM（標準誤差）を得るために、適切なリガンドでコーティングした赤血球を使用するか、または特異的な機能遮断剤を用いてリガンドまたは受容体を遮断し、非特異的結合曲線を記録します。モノクローナル抗体を用いた場合、各接触時間における特異的接着頻度は、非特異的接着頻度を差し引くことで算出できます。特定の接着頻度対接触時間のデータは、単一種類の受容体と単一種類のリガンドとの間における、2次順方向および1次逆方向の単一ステップ相互作用を記述する確率モデルによってフィッティングされます。この式において、KAは2D親和性を示し、Kdは2D解離速度定数を示します。MRおよびMLはそれぞれ受容体およびリガンドの密度であり、ACは接触面積です。曲線フィッティングにはac、k、a、およびKoffの2つのパラメータがあり、ACとKAはまとめて「実効2D親和性」と呼ばれます。この実効2D親和性とオフレートの積が実効2Dオンレートとなり、AC Kon = AC KA × Koffとなります。ここでは、インテグリンαLβ2の決定例を示しています。好中球におけるサイト密度。好中球をまず1 µg/mLのE selectin IGでインキュベートし、次いで飽和濃度のPE標識抗ヒトCD 11モノクローナル抗体、または対照として適切なマウスIgG1で処理した。30分間のインキュベーション後、サンプルを洗浄し、標準的な設定のフローサイトメーターで測定した。高輝度PE校正ビーズ。パネルAは、校正ビーズと、E-selectin IG処理済みまたは未処理細胞の蛍光ヒストグラムを示している。特定のCD 11 Aモノクローナル抗体による染色は実線で、対応するアイソタイプ一致コントロール抗体による染色は点線で示されている。パネルBは、密度の定量化プロセスを示しています。4つのビーズそれぞれの平均蛍光強度のLog 10を算出しました。パネルAのキャリブレーションピーク値と、ロット固有のビーズあたりのPE分子数を用いて計算しています。再選択された浸入細胞について、ビーズあたりのPE分子数のlog 10と蛍光強度のlog 10を用いて線形回帰プロットを作成した。特定のモノクローナル抗体についてはlog 10 fiが3.99（青い塗りつぶし円で表示）、コントロール抗体については2.23（青い白抜き円で表示）であった。Xの線形方程式を解いた結果、αLβ2陽性細胞または好中球の総数は9,587個と算出された。好中球の直径を8.4 µmとして計算した結果、表面密度は1 µm²あたり43サイトであった。次のグラフは、1秒および10秒時点における特異的結合の接着頻度fiの推移を示している。これらの接触時間は、ICAM-1をコーティングした赤血球と、インテグリンαLβ2を発現するヒト好中球との間の反復的な接着テストサイクルから測定したものである。対照的に、こちらに示されているのは、ヒトIgGでコーティングされた赤血球と、インテグリンαLβ2を発現しているヒト好中球との間の繰り返し接着試験サイクルから測定された、接触時間1秒および10秒における非特異的結合の接着頻度fiです。この最後のグラフは、IA-1の好中球インテグリンαLβ2への結合キネティクスを示しています。非特異的結合を制御するため、各接触時間において3組の細胞ペアで測定された接着確率を平均し、接触時間に対してプロットしました。2つの異なる条件が用いられました。抗TFCキャプチャー抗体でコーティングした赤血球を、ICAM-1 IgGおよびIgG2の代わりにヒトIgGでインキュベートした例。また、キャプチャー抗体でコーティングしていない赤血球に好中球が結合している例。ヒトIgGコントロール曲線として記録された非特異的結合を用いて、特異的接着確率曲線を得た。非特異的結合補正のために、既報の方程式を用いた。補正後の特異的接着確率曲線をモデルフィッティングにより近似しました。特異的接着確率曲線から有効結合親和性が得られました。CKAは1.4 × 10⁻⁴ µm⁴、koffは0.3 s⁻¹に等しくなります。このビデオを視聴することで、両方の分子が相互作用細胞の表面に固定されている場合の受容体-リガンド相互作用キネティクスの測定方法について、十分な理解を得ることができます。この手順を行う際は、まず、接着頻度が中間範囲に収まるようにリガンド側の密度範囲を調整することが重要であること、また、血液や特定の処理に使用する試薬（例：ナトリウムアジ化物やDMSOなど）は極めて有害である可能性があることを忘れないでください。したがって、試薬のMSDSを注意深く読み、本手順の実行中は手袋を着用するなど、適切な予防措置を講じることが求められます。

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