Name: 用接着周波数アッセイその場で速度論解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: 学ぶ接着周波数アッセイによる細胞表面受容体・リガンド相互作用の速度論解析。マイクロピペットを用いて赤血球を接着センサーとして機能化し、integrin αLβ2とICAM-1の結合親和性とオフレートを測定する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

この研究は、NIHの助成金R01HL091020、R01HL093723、R01AI077343、およびR01GM096187によってサポートされていました。

<ol><li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophys. J. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Chesla, S. E., Li, P., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+anchor+influences+ligand+binding+two-dimensional+kinetic+rates+and+three-dimensional+affinity+of+FcgammaRIII+%28CD16%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The membrane anchor influences ligand binding two-dimensional kinetic rates and three-dimensional affinity of FcgammaRIII (CD16).</a> J. Biol. Chem. 275, 10235-10246 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+and+independent+binding+of+Fcgamma+receptors+IIa+and+IIIb+to+surface-bound+IgG%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Concurrent and independent binding of Fcgamma receptors IIa and IIIb to surface-bound IgG.</a> Biophys. J. 79, 1867-1875 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+binding+to+multiple+ligands%3A+kinetic+rates+of+CD16b+for+membrane-bound+IgG1+and+IgG2%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Concurrent binding to multiple ligands: kinetic rates of CD16b for membrane-bound IgG1 and IgG2.</a> Biophys. J. 79, 1858-1866 (2000).</li>
<li>Williams, T. E., Nagarajan, S., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+impact+of+membrane+microtopology+on+effective+two-dimensional+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the impact of membrane microtopology on effective two-dimensional affinity.</a> J. Biol. Chem. 276, 13283-13288 (2001).</li>
<li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+effects+of+molecular+orientation+and+length+on+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantifying the effects of molecular orientation and length on two-dimensional receptor-ligand binding kinetics.</a> J. Biol. Chem. 279, 44915-44923 (2004).</li>
<li>Long, M., Zhao, H., Huang, K. S., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+measurements+of+cell+surface+E-selectin%2Fcarbohydrate+ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Kinetic measurements of cell surface E-selectin/carbohydrate ligand interactions.</a> Ann. Biomed. Eng. 29, 935-946 (2001).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophys. J. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Wu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+carrier+stiffness+and+microtopology+on+two-dimensional+kinetics+of+P-selectin+and+P-selectin+glycoprotein+ligand-1+%28PSGL-1%29+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Impact of carrier stiffness and microtopology on two-dimensional kinetics of P-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) interactions.</a> J. Biol. Chem. 282, 9846-9854 (2007).</li>
<li>Waugh, R. E., Lomakina, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+site+formation%2C+not+bond+kinetics%2C+limits+adhesion+rate+between+human+neutrophils+and+immobilized+vascular+cell+adhesion+molecule+1%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Active site formation, not bond kinetics, limits adhesion rate between human neutrophils and immobilized vascular cell adhesion molecule 1.</a> Biophys. J. 96, 268-275 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+kinetics+regulation+of+alphaLbeta2-ICAM-1+interaction+by+conformational+changes+of+the+alphaL-inserted+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional kinetics regulation of alphaLbeta2-ICAM-1 interaction by conformational changes of the alphaL-inserted domain.</a> J. Biol. Chem. 280, 42207-42218 (2005).</li>
<li>Lomakina, E. B., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+between+human+neutrophils+and+immobilized+endothelial+ligand+vascular+cell+adhesion+molecule+1%3A+divalent+ion+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion between human neutrophils and immobilized endothelial ligand vascular cell adhesion molecule 1: divalent ion effects.</a> Biophys. J. 96, 276-284 (2009).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> J. Biol. Chem. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chien, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stage+cadherin+kinetics+require+multiple+extracellular+domains+but+not+the+cytoplasmic+region%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Two stage cadherin kinetics require multiple extracellular domains but not the cytoplasmic region.</a> J. Biol. Chem. 283, 1848-1856 (2008).</li>
<li>Huang, J., Edwards, L. J., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+MHC-CD8+interaction+at+the+T+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of MHC-CD8 interaction at the T cell membrane.</a> J. Immunol. 179, 7653-7662 (2007).</li>
<li>Wasserman, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+variant+peptide-mediated+anergy+of+encephalitogenic+T+cells+requires+SHP-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">MHC variant peptide-mediated anergy of encephalitogenic T cells requires SHP-1.</a> J. Immunol. 181, 6843-6849 (2008).</li>
<li>Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 Forthcoming.</li>
<li>Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+low+affinity+peptide-MHC+II+tetramer-negative+effectors+during+polyclonal+CD4%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses.</a> J. Exp. Med. 208, 81-90 (2011).</li>
<li>Jiang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-stage+cooperative+T+cell+receptor-peptide+major+histocompatibility+complex-CD8+trimolecular+interactions+amplify+antigen+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Two-stage cooperative T cell receptor-peptide major histocompatibility complex-CD8 trimolecular interactions amplify antigen discrimination.</a> Immunity. 34, 13-23 (2011).</li>
<li>Spillmann, C. M., Lomakina, E., Waugh, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesive+contact+dependence+on+impingement+force%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesive contact dependence on impingement force.</a> Biophys. J. 87, 4237-4245 (2004).</li>
<li>Zhu, C., Williams, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+concurrent+binding+of+multiple+molecular+species+in+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Modeling concurrent binding of multiple molecular species in cell adhesion.</a> Biophys. J. 79, 1850-1857 (2000).</li>
<li>Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+leukocytes+in+capillaries%3A+role+of+cell+size+and+deformability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Retention of leukocytes in capillaries: role of cell size and deformability.</a> J. Appl. Physiol. 69, 1767-1778 (1990).</li>
<li>Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+and+kinetic+analysis+of+Fcgamma+receptor+IIIa+%28CD16a%29+binding+to+IgG+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Affinity and kinetic analysis of Fcgamma receptor IIIa (CD16a) binding to IgG ligands.</a> J. Biol. Chem. 282, 6210-6221 (2007).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cell. Mol. Bioeng. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Thoumine, O., Kocian, P., Kottelat, A., Meister, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+binding+of+fibroblasts+to+fibronectin%3A+optical+tweezers+experiments+and+probabilistic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Short-term binding of fibroblasts to fibronectin: optical tweezers experiments and probabilistic analysis.</a> Eur. Biophys. J. 29, 398-408 (2000).</li>
<li>Ounkomol, C., Xie, H., Dayton, P. A., Heinrich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+horizontal+force+probe+for+mechanical+tests+on+pipette-held+cells%2C+particles%2C+and+membrane+capsules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Versatile horizontal force probe for mechanical tests on pipette-held cells, particles, and membrane capsules.</a> Biophys. J. 96, 1218-1231 (2009).</li>
<li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophys. J. 74, 492-513 (1998).</li>
<li>Li, P., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+competition+binding+between+soluble+and+membrane-bound+ligands+for+cell+surface+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Analysis of competition binding between soluble and membrane-bound ligands for cell surface receptors.</a> Biophys. J. 77, 3394-3406 (1999).</li>
<li>Long, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+modeling+of+rosette+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Probabilistic modeling of rosette formation.</a> Biophys. J. 91, 352-363 (2006).</li>
<li>Lou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> J. Cell. Biol. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Yago, T., Zarnitsyna, V. I., Klopocki, A. G., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+governs+flow-enhanced+cell+tethering+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Transport governs flow-enhanced cell tethering through L-selectin at threshold shear.</a> Biophys. J. 92, 330-342 (2007).</li>
<li>Evans, E., Berk, D., Leung, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachment+of+agglutinin-bonded+red+blood+cells.+I.+Forces+to+rupture+molecular-point+attachments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detachment of agglutinin-bonded red blood cells. I. Forces to rupture molecular-point attachments.</a> Biophys. J. 59, 838-848 (1991).</li>
<li>Zarnitsyna, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+in+receptor-ligand-mediated+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Memory in receptor-ligand-mediated cell adhesion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 18037-18042 (2007).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

首尾よく、いくつかの重要なステップを考慮する必要がありますマイクロ接着周波数アッセイを使用する。最初に、興味の受容体 - リガンドシステムのための特異的相互作用を記録することを確認してください。非特異的コントロールの測定値（図3参照、4）特異性を確認してください。理想的には、非特異的付着確率は、すべての接触の継続時間を0.05未満である必要がありますし、各時点の特定と非特異的付着確率の間に有意差を持っているため。別の方法は、赤血球の表面に結合するリガンドを使用することができる。それは、方法17をカップリング塩化クロム、ビオチン-ストレプトアビジンの結合より非特異的結合のより高いレベルを与えたことが示された。 第二に、特定の相互作用のための付着確率はミドルレンジにする必要があります。受容体は構成的に細胞上に発現している場合、この要件は、受容体とリガンド（または赤血球上のみリガンドの密度を変えることによって満たすことができるの変更が困難になっている密度）。この目的のために、未知の受容体 - リガンド結合親和性と新しいシステムをテストするとき、リガンド密度の様々なテ...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ＃ </th><th>コメント</th></tr><tr><td> 10倍PBS </td><td> BioWhittaker </td><td> 17 - 517Q </td><td>使用前に脱イオン水で1Xに希釈する</td></tr><tr><td>バキュテイナEDTA </td><td> BD </td><td> 366643 </td><td>赤血球の分離</td></tr><tr><td> 10ML PK100 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 10771 </td><td>赤血球の分離</td></tr><tr><td>アデニン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A2786 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td> D -グルコース（ブドウ糖） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G7528 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td> D -マンニトール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 6360 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S7653 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム、二塩基（ナトリウム＆＃X2082; HPO₄） </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> S374 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td> L -グルタミン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G5763 </td><td> EAS - 45の準備</td></tr><tr><td>ビオチン- X - NHS </td><td>カルビオケム</td><td> 203188 </td><td>赤血球のビオチン化</td></tr><tr><td>ジメチルホルムアミド（DMF） </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 20673 </td><td>赤血球のビオチン化</td></tr><tr><td>ホウ酸緩衝液（0.1M） </td><td>電子顕微鏡学</td><td> 11455〜90 </td><td>赤血球のビオチン化</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 21125 </td><td>官能配位子</td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A0336 </td><td>官能配位子</td></tr><tr><td> Quantibrite PEビーズ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 340495 </td><td>密度の定量化</td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td> BD Immunocytometryシステム</td><td> BD LSR II </td><td>密度量子tification </td></tr><tr><td>毛細管 0.7〜1.0ミリメートル× 30&quot; </td><td>キンブルグラス株式会社</td><td> 46485から1 </td><td>引っ張りマイクロピペット</td></tr><tr><td>鉱油</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> BP2629 - 1 </td><td>チャンバーアセンブリ</td></tr><tr><td>顕微鏡のカバーガラス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 12から544 - G </td><td>チャンバーアセンブリ</td></tr><tr><td> PEα-ヒトCD11a クローンHI 111 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 12-0119-71 </td><td>図1のための試薬</td></tr><tr><td> PE抗ヒトCD54 </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 12から0549 </td><td>図1のための試薬</td></tr><tr><td>マウスIgG1アイソタイプコントロールPE </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 12から4714 </td><td>図1のための試薬</td></tr><tr><td>油圧マイクロマニピュレーター</td><td>ナリシゲ</td><td> MO - 303 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td>メカニカルマニピュレータ</td><td>ニューポート</td><td> 461 - XYZ - M、SM - 13、DM - 13 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td>圧電変換器</td><td> Physik Instrumente </td><td> P - 840 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td> LabVIEWの</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td>バージョン8.6 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td> DAQボード</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td> USB - 6008 </td><td>マイクロピペットシステム</td></tr><tr><td>光学テーブル</td><td>動力学システム</td><td> 5200シリーズ</td><td>マイクロピペットシステム</td></tr></tbody></table>

用接着周波数アッセイその場で</em細胞間のインタフェースにおけるクロス接合分子間相互作用の>速度論解析

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

マイクロピペットの接着アッセイは、2次元（2D）受容体-リガンド結合速度1を測定するために、1998年に開発されました。アッセイは接着センサーと相互作用する分子のいずれかの提示細胞としてのヒト赤血球（RBC）を使用しています。それは正確に制御領域との結合形成を可能にするための時間と他の相互作用する分子を発現し、他の細胞と接触RBCを持って来るためにマイクロマニピュレーションを採用しています。接着イベントは離れた二つのセルを引っ張って上RBCの伸長として検出されます。赤血球表面上に固定化されたリガンドの密度を制御することにより、密着性の確率は0と1の間のミッドレンジ内に保持されます。付着確率は、所定の接触時間の2つの細胞間の繰り返し接触サイクルの順序で接着事象の頻度から推定される。接触時間を変化させることで結合曲線を生成します。結合する受容体-リガンドの反応速度論1の確率モデルのフィット曲線は、2次元親和性とオフレートを返します。 アッセイは、IgGのFc 1-6、複合糖質リガンド6-9、配位子10-13、homotypicalカドヘリン結合14、ペプチド-主要組織適合遺伝子複合体15とT細胞受容体とレセプターとのインテグリンとセレクチンとのFcγ受容体の相互作用を用いて検証されています- 19。 メソッドは、このような膜microtopology 5、膜アンカー2、分子配向と長さ6、キャリアの剛性9曲20、インピンジメント力20、ならびに生化学的要因として生物物理学的な要因によって2D速度の規制を定量化するために使用されていますこのような相互作用する分子が存在し、これらの分子15,17,19の表面の組織細胞骨格と膜の微小環境の変調器として。 方法は、tをも使用されていますOは、修正モデル21を使用してデュアル受容体-リガンドの種3,4の同時結合、および19 trimolecular相互作用を研究する。 法の大きな長所は、それが彼らのネイティブな膜環境での受容体の研究をできることです。結果は、精製された受容体17を用いて得られたものとは大きく異なる可能性があります。また、よく典型的な生化学的方法を超えて時間分解能を持つサブ秒の時間スケールにおける受容体 - リガンド相互作用の研究が可能になります。 マイクロピペットの接着周波数の方式を説明するために、我々はαLβ2をアクティブにするために溶液中で二量体のE -セレクチンと好中球上のインテグリンαLβ2に結合赤血球の官能細胞間接着分子1（ICAM - 1）の動態の測定を示す。

両分子が相互作用する細胞の表面上に固定されているときに受容体 - リガンド相互作用の動力学を測定するための接着の周波数分析が記載されている。この機械的にベースのアッセイは、相互作用する受容体とリガンドと密着センサーとインテグリンαLβ2と細胞間接着分子-1のようなマイクロピペット、加圧されたヒト赤血球を用いて例示される。

マイクロピペット接着アッセイは、二次元（2D）の受容体-リガンド結合キネティクスを測定するために1998年に開発されました1。このアッセイでは、ヒト赤血球...

本実験の全体的な目的は、相互作用する細胞の表面に両方の分子が固定されている場合の、受容体とリガンドの相互作用速度論を測定することです。これは、まず接着センサーとなる赤血球をリガンドで機能化し、受容体を発現させた細胞を準備することで達成されます。第二のステップとして、マイクロピペットチャンバーを組み立て、接着試験を行い、接着イベントを記録します。次に、細胞の接触時間に対する接着確率の曲線をプロットし、モデルを用いてフィッティングを行います。速度論的パラメータを推定するために、データから算出された二次元有効結合親和性と解離速度を示す結果を得ます。では、このアッセイのアイデアはどこから得られたのでしょうか。受容体とリガンドの相互作用に関する研究が行われています。多くの場合、破断力が測定されますが、私たちも同様のことを行ってきました。しかし、ある日、接着がない場合は0、接着がある場合は1というバイナリ結果のみを測定し、それらの0と1の測定値から速度論的な測定値を導き出すことで、マイクロピペット頻度アッセイを示すことができるのではないかと考えました。私の研究室のリサーチサイエンティストであるVeronica Zana Zina博士が、この実験について説明します。全血から単離した赤血球を、接着頻度アッセイのためにビオチン化します。この手順を開始するには、単離した赤血球を含むチューブを遠心分離し、赤血球ペレットを10 µLずつ複数のバイアルに分注し、各バイアルに相当量のPBSを加えて、複数の赤血球ビオチン溶出濃度を調製します。次に、各バイアルに0.1 MのBore eightバッファーを10 µL加えます。次に、計算した量のビオチン溶液を各バイアルに加え、直ちにボルテックスします。各赤血球バイアルを50 milliliterのコニカルチューブに入れ、ローテーターを用いて室温で30分間インキュベートします。30分後、各バイアルにEAS 45緩衝液を加え、2000 rotations per minuteで2分間遠心分離します。EAS 45緩衝液での洗浄を2回繰り返し、計3回の洗浄を行います。最後に、各バイアルに100 µLのEAS 45バッファーを加え、4 °Cで保存して赤血球表面のリガンドを機能化します。前のステップでビオチン化した赤血球を、飽和濃度のstrep TTRとともに4 °Cで30分間インキュベートし、EAS 45バッファーを用いて2000 rpmで2分間、3回洗浄します。その後、赤血球をビオチン化リガンドと直接インキュベートするか、あるいは赤血球を対応するビオチン化捕捉抗体とインキュベートした後、リガンドとインキュベートします。このビデオで示すプロトコルでは、ビオチン化捕捉抗体を使用しています。マイクロピペットは、低融点ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを用

adhesion-frequency-assay-for-situ-kinetics-analysis-cross-junctional

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオでは、HEK細胞凝集アッセイを通じてシナプス細胞接着分子間の細胞間相互作用を測定する技術を実演します。このアッセイでは、所望のシナプス前細胞接着分子と蛍光タンパク質を発現する同数のHEK細胞を、シナプス後細胞接着分子と別の蛍光タンパク質を発現するHEK細胞と混合します。細胞接着分子間の相互作用により、細胞は凝集し、これは蛍光顕微鏡で測定できます。...

細胞接着分子間のトランス相互作用を検出するための細胞凝集アッセイ

このプロトコルは、電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング、細胞の付着、増殖、運動性、および薬理学的および毒性刺激に対する細胞応答の定量化のための接着細胞のインピーダンススペクトルを記録し、分析する方法を検討します。内皮透過性および細胞 - 細胞および細胞 - 基質接点の評価の検出が強調される。...

内皮増殖、バリアー機能、運動性の定量のための電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング

このプレゼンテーションでは、接着性のある培養細胞のエレクトロポレーションを細胞間接合部のコミュニケーションの研究に使用し、細胞が導電性で透明な酸化インジウム-スズでコーティングされたスライド上で成長する方法を示します。...

ギャップ結合審査のための機能アッセイ;インジウム - スズ酸化物に対する接着した細胞のエレクトロポレーション

ここでは、カップル2プロテオミクス技術、すなわち2次元電気泳動（2DE）および質量分析（MS）は、一次サンプルの2つ以上のグループ間で差次的に発現/翻訳後修飾タンパク質を同定するためのプロトコールを記載する。このアプローチは、一緒に機能的な実験と、予後マーカー/治療標的の同定および特徴を可能にします。...

タンパク質機能に2DE  - ゲルスポットから：慢性リンパ性白血病で、HS1から学んだレッスン

私たちは、単一のTリンパ球におけるカルシウムシグナル伝達のリアルタイムイメージングと、力制御された単一の受容体-リガンド結合速度の測定を同時に行うための技術について説明します。...

蛍光生体膜フォースプローブ：単一細胞上の受容体 - リガンド速度論の同時定量との結合によって誘導される細胞内シグナル伝達

この流接着アッセイは、T細胞、上皮細胞間相互作用の単純な、耐衝撃性モデルを提供します。シリンジポンプは、剪断応力を生成するために使用し、共焦点顕微鏡は、定量化のための画像を捕捉します。これらの研究の目的は、効果的に流れ条件を使用して、T細胞接着を定量化することです。...

Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

本研究は、ユーティリティおよび定量的細胞膜拡張測定と細胞の接着能の相関性を示します。代表的な例として、Dickkopf 関連蛋白質 3 を紹介して (DKK3) が増加 lobopodia 形成を促進し、副腎皮質癌における細胞接着細胞の in...

細胞膜の拡張機能と癌細胞の接着の役割を勉強のキャラクタリゼーション

血管壁への免疫細胞の動的付着腸内ホーミングの前提条件です。アドレスを持つコーティング毛細血管を用いた細胞の動的な細胞接着機能の in...

炎症性腸疾患における癒着防止治療の機能分析のための動的接着アッセイ

このプロトコルでは、直接細胞内の細胞接合における局在蛋白質すなわち細胞間相互作用を仲介する蛋白質間の相互作用を調査する変動蛍光分光法に基づくアプローチについて説明します。測定器の校正、データ集録および解析、修正可能なアーチファクトのソースを含む詳細なガイドラインを提供します。...

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

ここでは、蛍光顕微鏡を用いた異種細胞系におけるトランスにおけるリガンド-受容体相互作用を迅速かつ半定量的に測定するための最適化されたプロトコルを提示する。...

異種細胞系におけるタンパク質凝集による細胞間相互作用の測定

このプロトコルは、高速細胞圧延接着中に接着イベントを画像化するために、接着フットプリントアッセイを実行するための実験的手順を提示する。...

接着フットプリントアッセイによる細胞転動における分子接着性のイメージング

学ぶ接着周波数アッセイによる細胞表面受容体・リガンド相互作用の速度論解析。マイクロピペットを用いて赤血球を接着センサーとして機能化し、integrin αLβ2とICAM-1の結合親和性とオフレートを測定する手法です。

用接着周波数アッセイその場で速度論解析

さらに動画を探す