用接着周波数アッセイその場で速度論解析

本実験の全体的な目的は、相互作用する細胞の表面に両方の分子が固定されている場合の、受容体とリガンドの相互作用速度論を測定することです。これは、まず接着センサーとなる赤血球をリガンドで機能化し、受容体を発現させた細胞を準備することで達成されます。第二のステップとして、マイクロピペットチャンバーを組み立て、接着試験を行い、接着イベントを記録します。

次に、細胞の接触時間に対する接着確率の曲線をプロットし、モデルを用いてフィッティングを行います。速度論的パラメータを推定するために、データから算出された二次元有効結合親和性と解離速度を示す結果を得ます。では、このアッセイのアイデアはどこから得られたのでしょうか。

受容体とリガンドの相互作用に関する研究が行われています。多くの場合、破断力が測定されますが、私たちも同様のことを行ってきました。しかし、ある日、接着がない場合は0、接着がある場合は1というバイナリ結果のみを測定し、それらの0と1の測定値から速度論的な測定値を導き出すことで、マイクロピペット頻度アッセイを示すことができるのではないかと考えました。私の研究室のリサーチサイエンティストであるVeronica Zana Zina博士が、この実験について説明します。

全血から単離した赤血球を、接着頻度アッセイのためにビオチン化します。この手順を開始するには、単離した赤血球を含むチューブを遠心分離し、赤血球ペレットを10 µLずつ複数のバイアルに分注し、各バイアルに相当量のPBSを加えて、複数の赤血球ビオチン溶出濃度を調製します。次に、各バイアルに0.1 MのBore eightバッファーを10 µL加えます。

次に、計算した量のビオチン溶液を各バイアルに加え、直ちにボルテックスします。各赤血球バイアルを50 milliliterのコニカルチューブに入れ、ローテーターを用いて室温で30分間インキュベートします。30分後、各バイアルにEAS 45緩衝液を加え、2000 rotations per minuteで2分間遠心分離します。EAS 45緩衝液での洗浄を2回繰り返し、計3回の洗浄を行います。

最後に、各バイアルに100 µLのEAS 45バッファーを加え、4 °Cで保存して赤血球表面のリガンドを機能化します。前のステップでビオチン化した赤血球を、飽和濃度のstrep TTRとともに4 °Cで30分間インキュベートし、EAS 45バッファーを用いて2000 rpmで2分間、3回洗浄します。その後、赤血球をビオチン化リガンドと直接インキュベートするか、あるいは赤血球を対応するビオチン化捕捉抗体とインキュベートした後、リガンドとインキュベートします。このビデオで示すプロトコルでは、ビオチン化捕捉抗体を使用しています。

マイクロピペットは、低融点ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを用いて作製します。まず、マイクロピペットプラーを用いてキャピラリーチューブを引き伸ばします。次に、マイクロフォージを備えたマイクロマニピュレーターを使用し、マイクロピペットの先端をカットして、目的の開口サイズに調整します。

必要な直径は、通常、研究に使用する細胞の大きさに応じて1〜5 µmの範囲となります。セルチャンバーを準備するには、希望のサイズにカットした2枚の顕微鏡用カバーガラスを使用し、エアダスターでカバーガラスからホコリを除去した後、セルチャンバー用培地を加え、培地の蒸発を防ぐために両側からミネラルオイルでチャンバーを封印します。蒸発が起こると、実験中に浸透圧が変化してしまいます。

本アッセイで使用されるマイクロピペットシステムは、マイクロピペットで吸引された細胞の動きを観察・記録・分析するためのイメージングサブシステム、セルチャンバーから細胞を選択するためのマイクロマニピュレーションサブシステム、および細胞をマイクロピペット内に吸引するための圧力サブシステムの3つのサブシステムで構成されています。イメージングサブシステムの中心となるのは、100倍の油浸対物レンズを備えた倒立顕微鏡です。対物レンズによる画像は電荷結合素子（CCD）カメラで検出され、ビデオカセットレコーダーに送信されます。

時間の経過を記録するため、システムにビデオタイマーを接続します。マイクロピペットに脱イオン水を満たした後、顕微鏡に取り付けられたメカニカルドライブ上のホルダーに配置します。マイクロピペットは、3軸油圧マイクロマニピュレーターを用いて微細な位置調整が可能です。

マイクロピペットホルダーの1つは、コンピュータ制御のピエゾ電気トランスレーターに取り付けられています。これにより、ピペットを精密に、かつ接着試験サイクルに合わせて移動させることができます。圧力調節サブシステムは、吸引の制御に使用されます。

実験中、油圧ラインがマイクロピペットホルダーと液体リザーバーを接続します。精密機械ポジショナーにより、リザーバーの高さを正確に操作することが可能です。チャンバーの組み立て後、マイクロピペットをセットし、細胞をチャンバー内に注入してアッセイを開始します。相互作用させる細胞をそれぞれのピペットで吸引し、PSO電動トランスレーターを用いて、接触面積と時間を制御しながら、赤血球を好中球に接触させたり離脱させたりします。

赤血球が細胞分離時に伸長した場合を接着イベントとして観察し、赤血球の伸長が見られない場合を非接着イベントとします。観察された接着イベントを、接着がある場合は「1」、ない場合は「0」としてExcelスプレッドシートの列に記録してください。

各接触時間について、少なくとも3組の異なる細胞ペアを用いて、接着頻度対接触時間の曲線を記録します。コントロールとして平均値とSEM（標準誤差）を得るために、適切なリガンドでコーティングした赤血球を使用するか、または特異的な機能遮断剤を用いてリガンドまたは受容体を遮断し、非特異的結合曲線を記録します。モノクローナル抗体を用いた場合、各接触時間における特異的接着頻度は、非特異的接着頻度を差し引くことで算出できます。

特定の接着頻度対接触時間のデータは、単一種類の受容体と単一種類のリガンドとの間における、2次順方向および1次逆方向の単一ステップ相互作用を記述する確率モデルによってフィッティングされます。この式において、KAは2D親和性を示し、Kdは2D解離速度定数を示します。

MRおよびMLはそれぞれ受容体およびリガンドの密度であり、ACは接触面積です。曲線フィッティングにはac、k、a、およびKoffの2つのパラメータがあり、ACとKAはまとめて「実効2D親和性」と呼ばれます。この実効2D親和性とオフレートの積が実効2Dオンレートとなり、AC Kon = AC KA × Koffとなります。ここでは、インテグリンαLβ2の決定例を示しています。

好中球におけるサイト密度。好中球をまず1 µg/mLのE selectin IGでインキュベートし、次いで飽和濃度のPE標識抗ヒトCD 11モノクローナル抗体、または対照として適切なマウスIgG1で処理した。30分間のインキュベーション後、サンプルを洗浄し、標準的な設定のフローサイトメーターで測定した。

高輝度PE校正ビーズ。パネルAは、校正ビーズと、E-selectin IG処理済みまたは未処理細胞の蛍光ヒストグラムを示している。特定のCD 11 Aモノクローナル抗体による染色は実線で、対応するアイソタイプ一致コントロール抗体による染色は点線で示されている。

パネルBは、密度の定量化プロセスを示しています。4つのビーズそれぞれの平均蛍光強度のLog 10を算出しました。パネルAのキャリブレーションピーク値と、ロット固有のビーズあたりのPE分子数を用いて計算しています。

再選択された浸入細胞について、ビーズあたりのPE分子数のlog 10と蛍光強度のlog 10を用いて線形回帰プロットを作成した。特定のモノクローナル抗体についてはlog 10 fiが3.99（青い塗りつぶし円で表示）、コントロール抗体については2.23（青い白抜き円で表示）であった。Xの線形方程式を解いた結果、αLβ2陽性細胞または好中球の総数は9,587個と算出された。

好中球の直径を8.4 µmとして計算した結果、表面密度は1 µm²あたり43サイトであった。次のグラフは、1秒および10秒時点における特異的結合の接着頻度fiの推移を示している。これらの接触時間は、ICAM-1をコーティングした赤血球と、インテグリンαLβ2を発現するヒト好中球との間の反復的な接着テストサイクルから測定したものである。

対照的に、こちらに示されているのは、ヒトIgGでコーティングされた赤血球と、インテグリンαLβ2を発現しているヒト好中球との間の繰り返し接着試験サイクルから測定された、接触時間1秒および10秒における非特異的結合の接着頻度fiです。この最後のグラフは、IA-1の好中球インテグリンαLβ2への結合キネティクスを示しています。非特異的結合を制御するため、各接触時間において3組の細胞ペアで測定された接着確率を平均し、接触時間に対してプロットしました。2つの異なる条件が用いられました。

抗TFCキャプチャー抗体でコーティングした赤血球を、ICAM-1 IgGおよびIgG2の代わりにヒトIgGでインキュベートした例。また、キャプチャー抗体でコーティングしていない赤血球に好中球が結合している例。ヒトIgGコントロール曲線として記録された非特異的結合を用いて、特異的接着確率曲線を得た。非特異的結合補正のために、既報の方程式を用いた。

補正後の特異的接着確率曲線をモデルフィッティングにより近似しました。特異的接着確率曲線から有効結合親和性が得られました。CKAは1.4 × 10⁻⁴ µm⁴、koffは0.3 s⁻¹に等しくなります。

このビデオを視聴することで、両方の分子が相互作用細胞の表面に固定されている場合の受容体-リガンド相互作用キネティクスの測定方法について、十分な理解を得ることができます。この手順を行う際は、まず、接着頻度が中間範囲に収まるようにリガンド側の密度範囲を調整することが重要であること、また、血液や特定の処理に使用する試薬（例：ナトリウムアジ化物やDMSOなど）は極めて有害である可能性があることを忘れないでください。したがって、試薬のMSDSを注意深く読み、本手順の実行中は手袋を着用するなど、適切な予防措置を講じることが求められます。