細胞内のリフォールディングアッセイ
January 24th, 2012
このプロトコルでは熱ショック後に細胞内タンパク質のリフォールディングを測定する方法が記載されている。このメソッドは、その活性に影響を与えることができる分子シャペロンとその補因子または化合物のようなfoldasesを研究するために使用することができます。ホタルルシフェラーゼ活性は、シャペロンのリフォールディング活性を測定するためのレポーターとして使用されます。
次の実験の全体的な目標は、シャペロン依存性の細胞内タンパク質、熱ショック後のリフォールディングを測定することです。ルシフェラーゼレポーターを使用して、まず、ルシフェラーゼレポーター遺伝子と目的のシャペロンをコーティングしたプラスミドを細胞にトランスフェクションします。次に、トランスフェクションした細胞を実験計画の回復時点に分割します。
翌日、細胞に熱ショックを与えてタンパク質のアンフォールディングを誘導します。細胞内タンパク質の折り畳みを取り戻すための回復を待ってから、ルシフェラーゼレポーターの活性を測定します。結果は、ルシフェラーゼアッセイに基づいて、時間依存性およびシャペロン依存性のタンパク質リフォールディングを測定します。
この手法の主な利点は、in vitroリフォールディングアッセイのような既存の方法よりも、シャペロン活性に対する化合物またはタンパク質の影響をme生理学的に読み出すことができる可能性があることです。この技術の意味は、シャペロンがこれらの病状の発症に重要な役割を果たすため、神経変性疾患や癌などの幅広い疾患の治療にまで及びます。まず、培地、PBS、トリプシンを水浴で摂氏37度に予温します。
HEK 2 93細胞のコンフルエント培養物を5ミリリットルのPBSで洗浄します。次に、0.025%EDTAを含むトリプシンの1ミリリットルを適用し、トリプシンの均一な分布のためにプレートを静かに回転させ、摂氏37度でインキュベートします。プレートを定期的に振って、細胞の剥離を確認します。
ここで、resは細胞を10ミリリットルの完全なDMEM培地に懸濁し、50ミリリットルのファルコンチューブに移します。次に、ベックマンカウンタープレートを使用して細胞を列挙します。細胞は約60〜70%coの流暢さで、6〜8時間インキュベートします。
極端な遺伝子、9つの試薬を室温で平衡化し、血清を含まない培地のアリコートを摂氏37度に平衡化します。無血清培地を2本のアイノアチューブにピペットで移します。次に、極端な遺伝子9試薬をアイノアチューブの壁に触れずに添加し、室温で5分間インキュベートします。
その間に、チューブ1で2D NAトランスフェクションミックスを調製し、チューブ2でランバニラホタルと空のベクターコントロールを追加します。ランバニラホタルと分子シャペロンを追加します。トランスフェクション試薬にDNAを添加し、ボルテックスを混合し、室温で20分間インキュベートします。
この混合物をプレーティングした細胞に続けて加え、24時間インキュベートします。6つのウェルプレートで60〜70%coの流暢さでトリプシンシード細胞を使用してトランスフェクション細胞を収穫し、インキュベーターに一晩放置します。トランスフェクションした細胞から培地を吸引します。
次に、1ミリリットルのヒートショックバッファーを加え、30分間インキュベートします。Denovoタンパク質合成を停止するには、パラフォームストリップで蓋を密封し、摂氏45度の水浴で30分間インキュベートします。次に、パラフォームを取り外し、細胞をインキュベーターに戻して、指定した時点で回収します。
細胞を採取し、PBSで一度洗浄する 効率的な細胞溶解スナップのために、細胞ペレットを液体窒素で凍結し、希釈した受動溶解緩衝液200マイクロリットルを加えます。次に、三重で分注します。96ウェルプレートのウェルあたり30マイクロリットルの細胞溶解液。
トランスフェクション効率を評価するには、ショックを受けていないリファレンスサンプルから始めます。ランルシフェラーゼ活性を測定するには、1ミリモルのA TPと0.2マイクロモルのエジネ反応バッファーを含むgly Glyバッファー反応バッファーに、新しい0.2ミリモルのルシファーを調製します。96ウェルプレートをルミノメーターに挿入し、プログラムを開始します。
Wallach 1420ワークステーション。ポンプ1を0.2マイクロモルのエジン反応緩衝液を含むFalconチューブに導入します。メニューから、オプションのディスペンサーのメンテナンス、およびダニポンプ1を選択します。
「塗りつぶし」オプションを選択して、プレートのレイアウトを編集します。オプションを選択し、メニューでプロトコルと結果を探索します。プロトコルを選択します。
次に、読み取るウェルを選択します。Wallach Managerに戻り、[start]をクリックしてサンプルの排出量を測定します。482ナノメートルで、ディスペンサーのメンテナンスに進み、エンプティとポンプ1を選択して、すべての残留溶液をチューブに戻します。
次に、チューブを水とカチカチと音を立てて水を入れたハヤブサに移動します。[empty] を選択して続行します。次に、ポンプ1のチューブを反応バッファーに入れ、ポンプ2のチューブをLUCIFERIAN溶液に入れます。
プレートのレイアウトを変更します。ポンプ 1 とポンプ 2 の充填を選択します。ディスペンサーのメンテナンスメニューからプロトコルを選択し、560ナノメートルのホタルルシフェラーゼ反応波長の測定を開始します。
繰り返しの最後に、空、フラッシュ、空という手順を繰り返します。ポンプ 1 とポンプ 2 については、Wallach 1420 Explorer で結果を表示します。各実験はアッセイに関連付けられています。
番号、ユーザー名の開始日と終了日、結果をExcelファイルとしてエクスポートします。解析では、タンパク質のリフォールディングは回収時間に直接関係しています。この実験では、熱ショック後の異なる時点で細胞を評価します。
分子シャペロンの不在下および存在下。予想通り、リフォールディングされたルシフェラーゼの割合は、分子シャペロンをトランスフェクションしたコントロール細胞と細胞の両方で回復時間が長くなると増加します。対照的に、無効なデータセットでは、時間と再フォールディングの相関関係について、不適切な R 二乗値が表示されます。
この技術に続いて、シャペロンの酵素活性の阻害などの追加の質問に答えるために、in vitro TPAsアッセイなどの他の方法を実行できます。このビデオを見れば、細胞内タンパク質の測定方法について十分に理解できるはずです。ヒッチショックの後を追いかけます。
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概要
このプロトコルは、分子シャペロンの役割に焦点を当てて、熱ショック後の細胞内タンパク質の再折りたたみを測定する方法を説明しています。ホタルのルシフェラーゼ活性は、シャペロンの再折りたたみ活性を評価するためのレポーターとして機能します。
主要な研究要素
科学の分野
- 細胞生物学
- タンパク質の折りたたみ
- 分子シャペロン
背景
- タンパク質の再折りたたみを理解することは細胞機能にとって重要です。
- 熱ショックはタンパク質の開裂を引き起こし、再折りたたみメカニズムを必要とします。
- 分子シャペロンは再折りたたみプロセスを支援します。
- ルシフェラーゼアッセイは再折りたたみ活性の定量的測定を提供します。
研究の目的
- シャペロン依存性の細胞内タンパク質の再折りたたみを測定すること。
- 熱ショックがタンパク質構造に与える影響を調査すること。
- ルシフェラーゼをシャペロン活性の評価レポーターとして使用すること。
使用された方法
- ルシフェラーゼとシャペロン遺伝子を含むプラスミドを用いて細胞をトランスフェクションすること。
- トランスフェクション後の回復時間点を確立すること。
- タンパク質の開裂を促進するために熱ショックを誘導すること。
- 再折りたたみ効率を評価するためにルシフェラーゼ活性を測定すること。
主な結果
- タンパク質の時間依存的な再折りたたみが観察されました。
- ルシフェラーゼアッセイによってシャペロン活性が確認されました。
- 結果はタンパク質回復におけるシャペロンの有効性を示しました。
- データは細胞のストレス応答における分子シャペロンの役割を支持しています。
結論
- この方法は熱ショック後のタンパク質の再折りたたみを効果的に測定します。
- ルシフェラーゼアッセイはシャペロン活性の研究に信頼できるツールです。
- 結果は細胞内のタンパク質ホメオスタシスの理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This intracellular refolding assay provides a cell-based readout for measuring molecular chaperone activity, enabling target validation in protein homeostasis pathways. By linking chaperone function to luciferase refolding, it supports mechanistic de-risking in oncology and neurodegeneration drug discovery. The assay facilitates compound screening for modulators of chaperone activity, informing lead identification and predictive confidence in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chaperone-dependent protein refolding as a therapeutic hypothesis in stress response pathways.
- Operational Value: Provides a quantitative, luciferase-based readout for assessing chaperone function in live cells.
- Predictive Value: Supports target confidence by measuring compound effects on intracellular refolding activity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates dose-response data for compounds that inhibit or stimulate chaperone-mediated refolding.
- Operational Value: Uses a normalized dual-luciferase system (firefly/renilla) to control for transfection efficiency and variability.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats for medium-throughput screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models chaperone involvement in cancer chemoresistance and neurodegeneration, supporting translational biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Bridges target validation to functional assessment of chaperone activity in disease-relevant systems.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables go/no-go decisions based on compound effects on proteostasis mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for modulators of protein folding networks.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about chaperone function in intracellular refolding after heat shock-induced protein unfolding.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative luminescence readouts suitable for compound library screening.
- Analytics: Provides time-dependent and chaperone-dependent refolding metrics for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical models where chaperones influence disease progression in cancer and neurodegeneration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing chaperone modulators across multiple target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Measures target engagement through functional refolding output, reducing mechanistic ambiguity in chaperone modulation.
- Operational Value: Standardizes assay conditions using defined transfection and recovery protocols for cross-lab reproducibility.
- Strategic Value: Improves portfolio prioritization by identifying compounds with desired effects on proteostasis pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of chaperone-targeted candidates in oncology and CNS therapeutic areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell transfection and luciferase reporter assays.
- Dependent on luminometer compatibility for dual-wavelength luciferase detection.
- Necessitates standardized heat shock and recovery conditions across experimental batches.
- Adaptation to other chaperone-client pairs may require validation of refolding dependence.
- Limited to soluble, refoldable protein reporters like luciferase; not suitable for aggregation-prone clients without modification.
