細胞内のリフォールディングアッセイ

本実験の目的は、ヒートショック後のシャペロン依存的な細胞内タンパク質の再折り畳みを測定することです。ルシフェラーゼレポーターを用いて、まずルシフェラーゼレポーター遺伝子と目的のシャペロンをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクションします。その後、実験計画に基づいた回復時間のタイムポイントごとに、トランスフェクションした細胞を分割します。

翌日、細胞にヒートショックを加え、タンパク質のアンフォールディングを誘導します。その後、回復時間を設けて細胞内のタンパク質フォールディングを回復させ、ルシフェラーゼレポーター活性を測定します。結果は、ルシフェラーゼアッセイに基づいた、時間依存的およびシャペロン依存的なタンパク質の再フォールディングを測定するものです。

in vitro リフォールディングアッセイなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、化合物やタンパク質がシャペロン活性に及ぼす影響を、より生理学的な読み出しで評価できる可能性があることです。シャペロンはこれらの病理の発症において重要な役割を果たしているため、本手法の応用範囲は、神経変性疾患やがんなど、広範な疾患の治療にまで及びます。まず、培地、PBS、およびトリプシンをウォーターバスで37 °Cに予熱します。

コンフルエントに達したHEK 2 93細胞の培養物を5 mLのPBSで洗浄します。次に、0.025% EDTAを含むトリプシンを1 mL加え、プレートを緩やかに回転させてトリプシンを均一に分散させ、37 °Cでインキュベートします。定期的にプレートを揺らし、細胞が剥離していることを確認してください。

次に、細胞を10 millilitersの完全DMEM培地で再懸濁し、50 milliliterのファルコンチューブに移します。その後、Beckmanカウンタープレートを用いて細胞数を計測します。細胞を約60%から70%のコンフルエンシーで播種し、6時間から8時間インキュベートします。

ExtremeGene 9試薬を室温に、無血清培地の分注液を37°Cにそれぞれ平衡化します。無血清培地を2本のエッペンドルフチューブにピペットで分注します。次に、チューブの壁面に触れないようにExtremeGene 9試薬を加え、室温で5分間インキュベートします。

その間に、チューブ1で2D NAトランスフェクション混合液を調製し、チューブ2にran vanilla fireflyと空ベクトルコントロールを添加します。さらにran vanilla fireflyと分子シャペロンを添加します。DNAをトランスフェクション試薬混合液に加え、ボルテックスし、室温で20分間インキュベートします。

この混合液をプレート上の細胞にさらに添加し、24時間インキュベートします。6ウェルプレートでコンフルエンシーが60〜70%になるように播種してトランスフェクションした細胞を、トリプシンを用いて回収します。また、細胞をインキュベーター内で一晩静置します。トランスフェクションした細胞から培地を吸引除去します。

次に、ヒートショックバッファーを1 mL加え、30分間インキュベートします。新規タンパク質合成を停止させるため、パラフィルムで蓋を密閉し、45 °Cのウォーターバスで30分間インキュベートします。その後、パラフィルムを取り除き、指定した時間経過後に回収するため、細胞をインキュベーターに戻します。

細胞を回収し、PBSで1回洗浄します。効率的に細胞を溶解させるため、細胞ペレットを液体窒素で急速凍結させ、希釈したパッシブ溶解バッファーを200 microliters加えます。次に、これを3連で分注します。96ウェルプレートの1ウェルあたり、細胞溶解液を30 microlitersずつ分注してください。

トランスフェクション効率を評価するために、まず電気ショックを与えていないリファレンスサンプルから開始します。Ren ルシフェラーゼ活性を測定するために、1 mM ATPおよび0.2 µM ルシフェラーゼ反応バッファーを含む、新鮮な0.2 mM Luciferin グリシンバッファー反応液を調製します。96ウェルプレートをルミノメーターに挿入し、プログラムを開始します。

Wallach 1420ワークステーションを使用します。0.2 µM ezine反応バッファーが入ったFalconチューブにポンプ1を挿入します。メニューから「dispenser maintenance」オプションを選択し、「pump one」にチェックを入れます。

プレートレイアウトを編集するには、fillオプションを選択してください。メニューからオプション、プロトコル、および結果を確認してください。プロトコルを選択してください。

次に、読み取りを行うウェルを選択します。Wallach managerに戻り、「start」をクリックしてサンプルの発光を測定します。482 nanometersでの測定後、ディスペンサーのメンテナンスに進み、「empty and pump one」を選択して、残液をすべてチューブに戻します。

次に、チューブを水が入ったファルコンチューブに移し、チック（洗浄）してフラッシュします。続けて「empty」を選択してください。その後、ポンプ1のチューブを反応バッファーに、ポンプ2のチューブをLUCIFERIAN溶液に浸します。

プレートレイアウトを変更します。ポンプ1とポンプ2にフィルを選択してください。ディスペンサーメンテナンスメニューからプロトコルを選択し、波長 560 nanometers でのホタルルシフェラーゼ反応の測定を開始します。

繰り返しの最後に、空にする、洗浄する、空にするという手順を再度行ってください。ポンプ1およびポンプ2について、Wallach 1420 Explorerで結果を確認します。各実験はアッセイに関連付けられています。

ユーザー名を指定し、開始日と終了日を入力して、結果をExcelファイルとしてエクスポートします。解析において、タンパク質の再折り畳みは回復時間と直接的な関係があります。本実験では、ヒートショック後の異なるタイムポイントで細胞を評価します。

分子シャペロンの不在下および存在下。予想通り、コントロールおよび分子シャペロンを導入した細胞の両方において、回復時間の延長に伴いルシフェラーゼの再折り畳み率は上昇します。対照的に、不適切なデータセットでは、時間と再折り畳みの相関におけるR2値が低い値を示します。

この手法に続き、シャペロンの酵素活性の阻害など、さらなる疑問を解消するために、in vitro TPAアッセイなどの他の方法を実施することができます。このビデオを視聴することで、細胞内タンパク質の測定方法について十分な理解を得られるはずです。私たちはヒートショック後の経過を追っています。