Name: XpertのMTB / RIFのテストで肺結核の診断 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぶXpert MTB/RIF検査による肺結核とリファンピシン耐性菌の迅速診断法。痰サンプルを用いたPCR技術で2時間以内に結果を得られ、感染症診断の標準化に貢献します。

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肺結核が疑われるすべての患者は細菌検査のために少なくとも二つの喀痰検体を提出しなければならないことが結核医療状態の国際規格の標準的な2。痰が最 ​​も高い収率がこの時点で収集された可能な場合には、少なくとも一つの早朝の標本が得られなければならない11 XpertのMTB / RIFアッセイがある誘導または喀出痰から調製された痰のサンプルや濃縮された痰の堆積物に適用することができます正または負の抗酸菌（AFB）塗抹標本は、6、12、13アッセイを持っている結核の臨床上の疑いがある誰のために患者からの検体の使用を意図しています。1、2）抗結核療法を受けていない）&lt;7治療の日、または3）過去60日以内に治療を受けていないていました。それは細菌のDNAは、抗菌薬治療後に持続する可能性があるため、薬物療法7の影響を監視するために使用すべきではないことに注意してください。 1。喀痰サンプル 注：テストを実行できるGeneXpert DXシステムモジュールがあるので一度だけ多くの標本としてプロセス、！ <ol><li>対応する検体IDを持つ各XpertのMTB / RIFカートリッジにラベルを付けます。 </li><li>転送1.0mlを滅菌ピペットを用いて円錐形、スクリューキャップチューブに痰を喀出。また、全体の標本は、元のリークプルーフ痰の収集容器内に処理されることがあります。 </li><li>滅菌ピペットを用いて喀痰に、2.0ミリリットルXpertのMTB / RIFサンプル試薬（V / V 2:1）を追加します。 </li><li>蓋を交換し、10秒間激しくチューブを振る-20時間。また、混合物（30秒）ボルテックスすることができます。 </li><li>チューブを室温で5分間直立することができます。 </li><li>精力的に10〜20倍管を横に振る。また、渦（30秒）を使用します。 </li><li>チューブを室温でさらに10分間直立することができます。 </li><li>標本を検査します。サンプルは痰の目に見える塊で液化する必要があります。 </li></ol> 2。濃縮された堆積物 注：テストを実行する可能GeneXpert DXシステムモジュールがあるので一度だけ多くの標本としてプロセス！ <ol><li>対応する検体IDを持つ各XpertのMTB / RIFカートリッジにラベルを付けます。 </li><li>滅菌ピペットを用いて円錐形、スクリューキャップチューブに1.5ミリリットルXpertのMTB / RIFサンプル試薬を転送します。 </li><li>滅菌ピペットを使用したサンプル用試薬を含むチューブに少なくとも0.5ミリリットルの濃堆積物を追加します。 </li><li>蓋を取り付けて、チューブvを振るigorously 10〜20倍。また、渦（30秒）を使用します。 </li><li>チューブを室温で5分間直立することができます。 </li><li>精力的に10〜20倍管を横に振る。また、渦（30秒）を使用します。 </li><li>チューブを室温でさらに10分間直立することができます。 </li><li>標本を検査します。サンプルは痰の目に見える塊で液化する必要があります。 </li></ol> 3。 XpertのMTB / RIFカートリッジのロード 注：カートリッジにサンプルを追加して30分以内にテストを開始します！ <ol><li> XpertのMTB / RIFカートリッジと検体IDのラベルを確認してください。 </li><li>カートリッジのふたを開きます。 </li><li>提供滅菌ピペットを用いて、メニスカスが最小マークの上になるまで、ピペットに液化した試料を吸引し、XpertのMTB / RIFカートリッジの開いているポートにサンプルを転送します。 </li></ol> 注：エアロゾル形成のリスクを最小限に抑えるために徐々に分配する！ <ol start="4"><li>カートリッジのふたを閉じます。 </li></ol> 4。テストを開始 注：テストを開始する前に、GeneXpert DXシステムはGX2.1ソフトウェアが装備されていることを確認し、XpertのMTB / RIFアッセイは、ソフトウェアにインポートされた9に ！ <ol><li>コンピュータの電源をオンにし、GeneXpert Dxの機器の電源をオンにします。 </li><li> Windowsデスクトップで、GeneXpert Dxのショートカットアイコンをダブルクリックします。 </li><li>あなたのユーザ名とパスワードを使用してGeneXpert DXシステムソフトウェアにログオンします。 </li><li> GeneXpert DXシステム]ウィンドウで、 テストを作成]をクリックします。 スキャンカートリッジのバーコードのダイアログボックスが表示されます。 </li><li> サンプルID]ボックスで 、スキャンまたはサンプルIDを入力します。 </li><li> XpertのMTB / RIFカートリッジ上のバーコードをスキャンします。 作成テスト]ウィンドウが表示されます。 </li><li> テストの開始]をクリックします 強い&gt;と表示されるダイアログボックスでパスワードを入力します。 </li><li>点滅する緑色の光のインストゥルメント·モジュールのドアを開き、カートリッジをロードします。 </li><li>ドアを閉じます。テストが開始され、光の点滅が停止し、常に緑のままです。テストが終了すると、ランプが消灯します。 </li><li>システムが実行の終了時にドアロックを解放するまで待機し、モジュールのドアを開け、カートリッジを取り外します。 </li><li>あなたの機関の標準的な慣行に従って、適切な廃棄容器に使用済みカートリッジを廃棄してください。 </li></ol> 5。代表的な結果各XpertのMTB / RIFカートリッジはMTB複雑でRIF耐性の検出と同様に標的細菌の適切な処理のために制御し、PCR反応において阻害剤の存在下（s）を監視するためのサンプル処理制御（SPC）のための試薬が含まれています。プローブ·チェック·コントロール（PCC）は、試薬の再水和に充填PCRチューブを検証カートリッジは、プローブの整合性、および染料の安定性。XpertのMTB / RIFアッセイで9プライマーは81塩基対の"コア"領域を含むrpoB遺伝子の一部を増幅する。分子ビーコンと呼ばれる5つ異なる色の蛍光核酸ハイブリダイゼーションプローブは、全体の81-bpのコアを尋問する14の各分子ビーコンは、標的配列は、野生型rpoBと異なる場合、そのターゲットにバインドしないように特定するように設計されました一塩基置換のように少しずつ順序。彼らが彼らの目標、すなわち、野生型rpoB配列にバインドされている唯一の分子ビーコン蛍光ので、検定の5つの色のいずれかの不在は、関連付けられているコア領域に保存された野生型配列と変異を区別するRIF耐性6。 SPCは、負のサンプルで陽性であるべきであり、正のサンプルで正または負の値となります。テストSPCは、負のテストで検出されない場合、結果は "無効"になります。 PCR反応の開始前に、GeneXpert DXシステムは、ビーズ水分補給、反応管充填、プローブの整合性と染料の安定性を監視するためのプローブからの蛍光シグナルを測定します。プローブからの蛍光シグナルは、割り当てられた受入基準を満たしている場合、PCCを渡します。以下に示すような結果は、測定した蛍光信号と埋め込 ​​まれた計算アルゴリズムからGeneXpert DXシステムによって解釈され、 ビューの結果ウィンドウ9に表示されます。 MTBが検出されました：MTB、標的DNAが検出され、両方のコントロールを、SPCとPCCは、割り当てられた受入基準を満たしています。低いCt値はDNAテンプレートの高い出発濃度を表しています。高いCt値はDNAテンプレートの低濃度を表しています。 MTB検出結果では、 "RIF耐性が検出されました"（ 図1A）、（ "RIF耐性が検出されません。" <str> MTBが検出されない：MTB、標的DNAが検出されていません。両方のコントロール、SPCとPCC、割り当てられた受入基準（ 図2）を満たす。 無効：MTBの有無を決定することはできません：SPCは、受入基準を満たしていない場合、すなわち、サンプルが適切に処理されていないか、またはPCRが阻害された（ 図3）。注：余分な検体を再検査！ エラー：失敗したPCCの結果（FAIL）の1つ以上の。 MTBとSPCの両方は結果が表示されません。注：余分な検体を再検査！ PCCは（PASS）渡された場合は、エラーはシステムコンポーネントの障害によって引き起こされます。 図1：MTB標的DNAが検出され、両方のコントロール、SPCとPCCは、割り当てられた受入基準を満たしています。低いCt値が高いの開始を表すDNAテンプレートの濃度、より高いCt値はDNAテンプレートの低濃度を表しています。 MTB検出結果に"不定RIF抵抗"、 "RIF耐性が検出されない"（ 図1A）、 "RIF耐性が検出されました"（ 図1B）、または別の行に表示されます。 <img alt="図1A" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1A"> 図1A MTB検出されました。RIF耐性が検出されません、rpoB遺伝子の81 bpのRIF耐性決定領域（RRDR）が存在していたのIEのみ野生型核酸配列6。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図1B" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1B.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1B"> 図1B MTB検出されました。RIF耐性が検出されました。ポジションをカバーする、プローブB（矢印）のドロップアウトが完了Rの513から517 rpoB遺伝子のRDR。例6は、部分的なシーケンスは、rpoB遺伝子変異D516Vが検出されたことを明らかにした。8は <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1Blarge.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2 MTBのターゲットDNAが検出されませんでした;両方のコントロールを、SPCとPCCは、割り当てられた受入基準を満たしています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図3"> サンプルが正常に処理されていないため、SPCは、受入基準を満たしていない場合、またはPCRが阻害されているため。MTBの図3に無効な試験の結果、すなわち有無を決定することはできません。3547fig3large.jpg "ターゲット=" _blank "&gt;拡大図を表示するには、ここをクリックしてください。 </str>

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

XpertのMTB / RIFアッセイは、サンプルの汚染除去、ハンズフリー操作、サンプル処理のオンボード、どちらの喀痰または濃縮された堆積物中の、単一のMTBとRIF抵抗の同時検出のための超高感度半nested PCR法を統合し、システムを使用して簡単にできます。検出のアッセイの分析限界は、痰の131 CFU / mlであることが判明した。Ct値とMTBの細胞数の間に6対数線形関係が存在するCFU / mlの喀痰10月7日から2月 10日までに当てはまります。臨床的に関連MTB濃度は、すべてのアッセイの直線範囲内に収まるように、アッセイは細菌負荷の半定量的な見積もりを提供しています。7アッセイは、唯一の中等度の実験室インフラストラクチャとトレーニングが必要になります。検出限界は、従来の顕微鏡に比べて少なくとも2桁低く位置しています。6特異性が優れています。また、RIF-resistanの同時検出トンMTBは、薬剤耐性結核の時代におけるポイントオブケア検査の設定で重要な利点です。3 臨床の設定があり、肺結核を診断するためのアッセイのパフォーマンスに限られて公開されているデータを最新の状態に12;。文化と比較した場合、13が疑われる肺結核患者の喀痰中の検出MTBのXpertのMTB / RIFアッセイの全体的な臨床的感度は97.6％であったリファレンスとして。と1462人の患者の合計これらの5つの研究サイトを（;バクー、アゼルバイジャン;ケープタウン＆ダーバン、南アフリカ、インドのムンバイリマ、ペルー）が関与してプロスペクティブ多施設共同研究の結果であった。研究対象集団の文化で確認されたTBの全体的なプレテストの確率は50.7％であった。感度は塗抹および培養陽性例のための99.8パーセントと塗抹陰性、培養陽性の場合の90.2パーセントであった。で98.4パーセントと比較して結核とHIV陽性の患者のうち、MTB / RIF検査の感度は、93.9％であったHIV-陰性患者低い結核罹患率の設定では12の文化と比較すると、MTBを検出するための全体的な合意は89％であった。感度は、それぞれ、塗抹陰性検体の塗抹陽性、72％が98％であった、と特異性は良好であった13未治療の喀痰と濃縮された堆積物のそれらのテストの間に感受性の有意差は認められなかった。211例（99.1％感度）209とで同じ調査では12、MTB / RIFテストが正しく検出されたRIF耐性シーケンシングの結果を考慮したRIF感受性を持つすべての506例（100％の特異性）、12作者は、調査結果はに可能性があることを示唆し、ケースの検出、およびRIF耐性の差別、両方のパフォーマンスは、様々なサイト間で同様のことがわかった広く適用可能である。さらに12は 、気管支肺胞洗浄および気管支などの痰以外の呼吸器検体の濃縮された堆積物、lの分泌物は、匹敵する感度と特異度でテストされています。アッセイのパフォーマンスに13データ肺外結核のテストを浮上している15。 グローバルな結核対策は早急に迅速な新しい結核患者の診断とユニバーサル·アクセス·ポイント·オブ·ケアの設定でRIF耐性MTBの検出を可能にする効果的なツールを必要とします。MTBを検出するために使用される3現在の核酸増幅方法は、労働集約的な、複雑であり、技術的に厳しい。 XpertのMTB / RIFアッセイは、彼らはそれを余裕ができるようになることを提供、これらの設定に結核と薬剤耐性の両方の標準化され、敏感な、非常に特定の診断テストをもたらす可能性があります。アクセスを容易にするために、革新的な新しい診断のための財団は、（FIND）XpertのMTB / RIFテストのために大幅な価格引き下げを交渉しています。現在のFIND-ネゴシエートされた価格は、割引の対象国のリストと共に、Web上で利用可能な10 </suP&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/機器 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> XpertのMTB / RIFテスト</td><td>ケフェウス型変光星</td><td> GXMTB/RIF-10 </td></tr><tr><td>転送ピペット</td><td>ザルスタット</td><td> 86.1172.001 </td></tr><tr><td>コニカルチューブ、15ミリリットル、120×17ミリメートル、PS </td><td>ザルスタット</td><td> 62.553.542 </td></tr></tbody></table>

xpertのmtb / rifのテストで肺結核の診断

Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

結核菌 （MTB）による結核（TB）は、公衆衛生上の大きな問題のままです。感染症は世界人口の1の3分の1にまで影響し、約200万人が毎年結核によって殺されている高品質の2ユニバーサルアクセスできます。 、すべての結核患者のための患者中心の治療はストップ結核戦略WHOのによって強調されています。3信頼性の高い薬剤耐性検査の結果に基づいて呼吸器検体と薬物療法でMTBの迅速な検出は、この戦略の実装を成功させるための前提条件です。しかし、世界の多くの分野では、結核の診断はまだ小文字を区別しない、不十分な標準化された喀痰顕微鏡検査の方法に依存しています。無効な結核の検出と薬剤耐性MTB株の出現と伝送ますますグローバル化する結核対策活動を危険にさらす2。 地球規模で - - スタンドの肺結核の効果的な診断は、可用性を必要とする、ardized使いやすい、このようなリファンピシン（RIF）などの主要な抗生物質にMTB複雑と抵抗の両方の直接検出を可能にするであろう強力な診断ツールを使用します。後者の結果は多剤耐性MTB（MDR結核）のためのマーカーとして機能することができ、信頼性の高い試験結果の迅速な可用性&gt; MDR-TBの分離株の95％4、図5に報告されていると、直接音患者管理につながる可能性がある最終的に、個々の患者を治すため、地域社会における結核感染の連鎖が破壊され、意思決定2。 セファイドの（サニーベール、カリフォルニア州、米国）XpertのMTB / RIFアッセイ6、7は顕著な方法で上記の要求を満たしています。それ）が喀痰または濃縮された痰の堆積物中のMTB複雑なDNAの検出1の核酸核酸増幅検査であり、2）rpoB遺伝子のRIF耐性関連変異の検出8これは、セファイドのGeneXpert DXで使用するために設計されています。システム番目で、サンプルの処理、核酸増幅、リアルタイムPCR、逆転写酵素PCRを使用して、ターゲット配列の検出を統合し自動化します。システムテストを実行して結果を表示するための器具、パーソナルコンピュータ、バーコードスキャナ、およびプリロード済みソフトウェアで構成されています。9それは、PCR試薬を保持し、PCRプロセスをホストする単回使用の使い捨てXpertのMTB / RIFカートリッジを採用しています。カートリッジは自己完結型であるため、サンプル間のクロスコンタミネーションが除去されます。MTBを検出するために使用される6現在の核酸増幅方法は、複雑な労働集約的、技術的に厳しいです。 XpertのMTB / RIFアッセイは、彼らはそれを余裕ができるようになることを条件として、ユニバーサル·アクセス·ポイント·オブ·ケアの設定を3に結核と薬剤耐性の両方について、標準化された敏感な、非常に特定の診断テストをもたらす可能性を秘めています。アクセスを容易にするために、革新的な新しい診断のための財団は、（FIND）signifiを交渉していますカント価格引き下げ。現在のFIND-ネゴシエートされた価格は、割引の対象国のリストと共に、Web上で利用可能な10

XpertのMTB / RIFのテストは、サンプルの汚染除去、ハンズフリー操作、サンプル処理のオンボードとの同時検出のための超高感度半nested PCR法を統合<em&gt;結核</em約2時間の喀痰または濃縮された喀痰の堆積物のいずれか&gt;とリファンピシン耐性、、。テストが標準化されているだけ適度な実験室インフラストラクチャとトレーニングが必要になります。

XpertのMTB / RIFのテストで肺結核の診断

Mycobacterium tuberculosis (MTB)による結核（TB）は、依然として重大な公衆衛生上の問題であり、この感染症は世界人口の最大3分の1に影響を及ぼしています...

本手順の総合的な目的は、排出された痰または濃縮された痰沈渣から、マイコバクテリウム、結核菌、およびリファンピシン耐性を2時間以内に同時に検出することです。まず、シンプルで非常に効果的な検体除染プロトコルから開始します。次に、処理済みの各検体を、PCR試薬が含まれPCRプロセスが進行する使い捨ての専門的なM-T-B-R-I-Fカートリッジに転移させます。カートリッジをGeneXpert DXシステムにセットし、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）およびリファンピシン耐性を同時に検出するための超高感度HEMIネステッドPCRを開始します。最終的に、検査結果を読み取り、医師に報告してください。Expert MTPRアッセイは、肺結核の臨床的疑いがあり、同社のテキストに記載された基準を満たす患者からの検体に使用することを目的としています。薬剤療法の効果をモニタリングするために使用してはならないことに注意してください。Crystal。それでは、私の研究室の技術者が、結核ケアの国際標準の標準2に従ってプロトコルを実演します。肺結核が疑われる各患者から、細菌学的検査のために2つの検体を採取してください。検体ごとにGeneXpert DXシステムのモジュールを1台割り当て、カートリッジに検体IDを記入します。次に、各サンプルのアッセイにおいて、別の滅菌転送ピペットを用いて喀痰1 mLを15 mLコニカルスクリューキャップチューブに移します。M-T-B-R-I-Fサンプル試薬2 mLを加えます。蓋をしっかりと閉めます。チューブを10〜20回振ってください。激しく振った後、チューブを室温で5分間静置します。再度、室温で10分間平衡化します。すべての検体にEDが施されており、痰の塊が見られないことを確認してください。まず、各痰沈渣検体の検体IDをカートリッジに記入します。各沈渣検体にM-T-B-R-I-F検体試薬を1.5 milliliters加え、そのうち0.5 millilitersを15 milliliterの円錐形スクリューキャップチューブに移します。蓋を閉めて30秒間ボルテックスし、チューブを直立させた状態で5分間静置します。ボルテックスで混合し、チューブを直立させたまま10分間静置します。液状化したサンプルを点検し、痰の凝塊がないことを確認してください。チューブのラベルと対応するカートリッジを照合します。検査の準備が整うまでカートリッジを開封しないでください。また、カートリッジの蓋を開けてから30分以内に使用してください。滅菌転送ピペットを使用して、液状検体をメニスカスが最小標線（minimum mark）を超えるまで吸引します。その後、サンプルをゆっくりとカートリッジに注入してください。カートリッジの蓋を閉めます。サンプルをカートリッジに添加してから30分以内にテストを開始してください。まずコンピュータの電源を入れ、次にデスクトップ上の装置の電源を入れます。gene expert DXアイコンをダブルクリックします。システムソフトウェアにログインします。[create test]を選択して、スキャンカートリッジバーコードダイアログボックスを開きます。次に、サンプルIDを入力し、カートリッジのバーコードをスキャンします。「Create Test」ウィンドウが表示されたら、「Start Test」をクリックし、ダイアログボックスにパスワードを入力してください。その後、装置モジュールのドアを開き、カートリッジをロードします。ドアを閉じてテストを開始します。緑色のライトが消灯すると、テストは完了です。システムがドアロックを解除したら、モジュールのドアを開けてカートリッジを取り出してください。最後に、使用済みのカートリッジを適切な廃棄容器に廃棄します。各テストカートリッジには、Mycobacterium tuberculosis complexのリファンピシン耐性のQPCR用試薬および適切な実験用コントロールが含まれています。プローブチェックコントロールにより、カートリッジ内での試薬の再水和、PCRチューブへの充填、プローブの完全性、および色素の安定性を検証します。サンプル処理曲線は、標的細菌が適切に処理されたことを示す陽性コントロールとして機能し、PCR阻害剤の存在も示します。プライマーは、保存された野生型配列と、RIF耐性に関連するRPOB遺伝子のコア領域における変異とを区別するように設計されています。CT値は、テストサンプル中の標的M-T-B-D-N-Aテンプレートの濃度に反比例します。テスト結果のダイアログボックスにより、この患者検体ではMTB標的DNAが検出され、RIF耐性は検出されなかったと結論付けられます。MTB標的DNAは低レベルで検出されており、リファンピシン耐性の兆候が見られます。SPCおよびPCCの両コントロールは、割り当てられた判定基準を満たしています。SPCが陰性であり、PCR産物が検出されなかったため、このアッセイ結果は無効とみなされます。サンプルが適切に処理されていなかったか、あるいはPCRが阻害された可能性があります。アッセイを繰り返してください。ビデオでご覧いただいた通り、この試験法は標準化されており、中程度の研究施設とトレーニングのみで実施可能です。したがって、エキスパートM-T-B-R-Fアッセイは、結核およびリファンピシン耐性の両方に対する標準化された高感度かつ極めて特異的な診断検査を、あらゆるポイント・オブ・ケア（POC）設定で利用可能にする潜在能力を持っていると考えています。

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免疫学と感染症

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自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ</i

学ぶXpert MTB/RIF検査による肺結核とリファンピシン耐性菌の迅速診断法。痰サンプルを用いたPCR技術で2時間以内に結果を得られ、感染症診断の標準化に貢献します。

XpertのMTB / RIFのテストで肺結核の診断

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