光音響流量測定法を用いて循環メラノーマ細胞の検出と分離

本実験の目的は、二次腫瘍が形成される前に癌の存在を検出することである。まず、ステージ4のメラノーマ患者から血液サンプルを採取し、分離することでこれを達成する。次に、血液を光音響フローチャンバーに導入し、メラノーマ細胞の検出および単離を行う。

次に、捕捉された細胞をイメージングし、検出されたメラノーマの存在を確認します。結果から、光音響波形と細胞イメージング技術に基づき、メラノーマ細胞を正確かつ迅速に検出し、単離できる本システムの能力が示されました。RT-PCRやバイオ磁気細胞分離術などの既存の循環メラノーマ細胞検出法に対する本手法の主な利点は、ラベルフリーであることであり、細胞表面を変化させたり基質に固定したりすることなく、循環メラノーマ細胞を捕捉できる点にあります。

転移性がん検出のためのサンプルを調製するには、まずステージ4のがん患者から約10 mLの全血を採取します。5 mLのバキュテイナー2本に分注し、3000 RPMで10分間遠心分離します。これにより、血液サンプルは3つの異なる層に分離します。最下層は赤血球で構成されます。

バフィーコートとも呼ばれる中間層には白血球とメラノーマ細胞が含まれており、最上層には血漿と血小板が含まれています。バフィーコートを乱さないように、可能な限り血漿を取り除きます。2 mLのチューブに250 µLのhis opaque 10 77を加えます。

9インチのパステルピペットを使用して、残りの血漿、バフィーコート全体、および赤血球の最上層を抽出します。回収量が500 µL未満になるように注意してください。抽出した溶液を、あらかじめ準備しておいたwind Trobeチューブに移します。

血液は再び分離しますが、今度は赤血球がヒスパによって分離され、バフィーコートを容易に抽出できるようになります。9インチのペサピペットを使用してバフィーコート全体を単離し、2 mLのエンドルフチューブに入れます。その後、2% v/vのβ-メルカプトエタノールを含む1.5 mLのPBSに懸濁させます。

フローチャンバーを製作するには、まず、長さ8 mm、外径20 mm、内径17 mmのアクリル製シリンダーを用意します。次に、シリンダーの側面に、互いに90度の角度になるように、直径5 mmの穴を3つ開けます。その後、ポリマーチューブを3本カットし、開けた穴に挿入します。

アクリルリングの底部にパラフィルムを張り、水密シールを作ります。パラフィルムはアクリルリングと共に浅いボウル状になり、フローチャンバーを形成するためのアクリルアミド溶液を保持します。向かい合った2本のチューブに直径1.6 millimeterのワイヤーを通し、リングの中央から3本目のチューブに向かってワイヤーだけが見えていることを確認します。

直径1.6 mmのワイヤーを挿入し、チューブを吊り下げたワイヤーから1 mm離れた位置に配置します。これらのワイヤーは、アクリルアミドがチューブ内に浸入するのを防ぎます。5 mLのアクリルアミドを準備します。

次に、混合液をアクリルリングに素早く注ぎ、上端まで満たします。数秒後、溶液がゲル化します。フローチャンバーの型を作成するため、アクリルアミドゲルを乱さないように注意しながらワイヤーを慎重に引き抜きます。これにより、円筒形の流路と、流路に焦点を合わせた光ファイバーを配置するためのスペースが形成されます。

これで、超音波ジェルを用いて音響的にフローチャンバーを使用する準備が整いました。ポリビニリデンフルオリド圧電音響トランスデューサを、流路の直上のフローチャンバーに結合させます。バヨネットコネクタまたはBNCケーブルを使用して、トランスデューサをブロードバンドレシーバーの入力端子に接続してください。

フィルターの出力をオシロスコープに接続し、オシロスコープをトリガーさせます。トランスデューサーの近くにフォトダイオードを設置し、BNCケーブルを使用してオシロスコープに接続します。フローチャンバーの小さなチューブを引き出し、小さな気泡ができるまで調整して、トランスデューサーと結合させます。

次に、光ファイバーを挿入し、ポケットを水で満たして界面信号を低減させ、流路に照射されるレーザー光の量を増やします。光ファイバーの開口数と流路までの距離が短いため、レーザーは一度に1つのサンプルセグメントのみを照射し、レーザーの直前にあるサンプルが光音響信号を生成しているサンプルと同一であることが保証されます。

次に、フローチャンバーの片側にT字コネクタを取り付け、コネクタの他の2つの分岐に2台のシリンジポンプを接続します。一方のシリンジには空気、もう一方にはあらかじめ調製した細胞懸濁液を入れます。その後、両方のシリンジポンプを作動させます。

2つの混和不可能な流体がT字接合部に到達すると、均質なスラグに分割され、トランスデューサを通過します。流れるサンプルにナノ秒パルスレーザーを照射し、メラノーマ細胞に光音響波を発生させます。メラニンは広帯域の光吸収体であるため、可視光域の任意のレーザー波長を使用できます。

ナメクジがトランスデューサーの上にあるときにオシロスコープに信号が現れれば、そのナメクジがメラノーマを含んでいることを示します。回収用バイアルに投入する前に、システム内で追跡してください。免疫細胞化学のためのサンプルを準備するには、ガラススライドをサイトファンネルに入れ、サイトスピンにセットして遠心分離を行い、捕捉した細胞をガラススライドに付着させます。

各ファンネルに1%BSA含有PBSを100 µLずつ注入します。次に、600 RPMで3分間遠心分離します。遠心分離後、CyTOFファンネル用の細胞サンプルを加え、再び600 RPMで3分間遠心分離します。

エタノールベースの固定液をスライドにスプレーします。次に、非特異的結合をブロックするため、PBSで10分間の洗浄を2回行います。各スライドを、ヤギ血清10 µLとPBS 90 µLの混合液とともに、室温で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、スライド上の液を捨て、一次抗体溶液を加えます。各スライドに、1%rabbit mark、1%mouse CD 45、およびPBSで調製した10%goat serumを加え、加湿チャンバー内で室温で1時間インキュベートします。次に、PBSで10分間の洗浄を3回行います。

次に、スライドを適切な蛍光二次抗体とともに暗所で室温で1時間インキュベートし、液を捨てます。その後、PBSで5分間の洗浄を3回行い、核を染色するため、0.1 µg/mLのDPIで細胞を1分間インキュベートします。最後に、スライドの液を捨て、PBSで洗浄します。

最後に、樹脂系封入剤を用いてカバーガラスを細胞サンプルの上に被せ、カバーガラスの周囲をクリアネイルポリッシュで密封し、蛍光顕微鏡で観察します。白血球およびメラノーマ細胞からの光音波形を左側に示します。固有の色素を持たない白血球からは光音波が発生せず、右側のように電子ノイズによる平坦な線として現れます。

しかしながら、色素を有するメラノマ細胞は強力な光音響波を発生させます。免疫細胞化学染色および化学染色の後、培養されたメラノマ細胞は青色の斑点状のシグナルを示しており、DPIのオーバーレイ画像で緑色に強調されているものが1つの標識細胞であり、CD 45を白血球の指標として標識したものがもう1つあります。この図は、分化後の白血球の中に存在するメラノマ細胞を示しています。

本手法は、がん検出分野の研究者が転移現象を探索し、がん検出の向上および最終的に致命的な転移を根治させるための道を開くものです。