ソリッドステートナノ細孔を持つ監視タンパク質吸着
2011年12月2日
無機表面へのタンパク質の非特異的吸着を監視するための固体ナノ細孔を用いる方法が説明されています。方法は、リアルタイムで、単一分子レベルで検出対象にする吸着を可能に、抵抗パルスの原理を採用しています。単一タンパク質吸着のプロセスがはるかに平衡からなので、我々は同様にタンパク質吸着の定数見かけ一次反応速度の定量測定と一定のラングミュア吸着のために可能にする、合成ナノ細孔の並列配列の雇用を提案する。
この手順の全体的な目標は、タンパク質吸収研究で使用するためのナノポアを人工膜に作成することです。これは、ステムを使用して窒化物膜にナノ細孔を穿孔することによって達成されます。次に、ナノポアをチャンバーに装填し、イオン溶液で湿らせます。
これにより、流体がナノポアの一方の側からもう一方の側に橋を形成し、ナノポアを実験の準備が整います。電圧が印加され、イオンの電流が通過するのを観察できます。最後のステップは、ナノポアチャンバーにタンパク質を追加することです。
最終的に、ナノポアを横切るイオン電流の長寿命のブロッキングを観察すると、ナノポアの側面へのタンパク質の吸収が明らかになります。こんにちは、デイブ・ウィッキです。私はシラキュース大学の物理学科の大学院生です。
ただし、この方法は、無機表面でのタンパク質の吸収に関する洞察を提供できます。また、タンパク質、核酸相互作用、分光法用の単一分子、限られた空間での分子の研究など、他のシステムにも適用できます。まず、ステムを加速電圧まで上げます。
次に、SPI窒化ケイ素ウィンドウグリッドをTEMサンプルホルダーにロードします。グリッドを酸素プラズマで30秒間清掃し、破片を取り除きます。サンプルをロードする前に、サンプルホルダーをTEMにロードし、真空がポンプダウンするのを待ちます。
明視野TEMモードを使用して、生のログラム上の明るい正方形である窒化物ウィンドウを見つけます。TEMが正しく位置合わせされていることを確認してください。次に、サンプルを位置合わせして焦点を合わせます。
次に、システムをSTEMモードにし、ホットオフ検出器を使用してサンプルをイメージングし、そのアライメントを確認します。モノクロメーターが存在する場合は低い値に設定し、ドリルに使用できる電子の電流を高くします。電子プローブの直径に基づいてナノポアをドリルするための適切なスポットサイズを選択します。
ステムを揃えた状態。BROGRAMを使用して、必要な倍率で窒化物膜に完全に焦点を合わせます。サンプルの動きがある場合は、空白、電子ビーム、およびサンプルが安定するのを待ちます。
これには最大で 1 時間かかる場合があります。安定化したら、電子プローブをサンプルに置き、ナノポアの掘削を開始します。TMでナノポアを穿孔するには、患者の不誠実さが必要です。
これは、電子ビームプローブの下で窒化物が徐々に散逸するプロセスです。電子プローブを穴あけ部位の真上に置き、ナノポアが完全に穴あけされていることを確認することが重要です。サンプルをTEMから取り出す前に、定期的にチェックしてくださいampホットオフ検出器でスキャンすることにより、サンプル
。サンプルがわずかにドリフトする場合は、電子プローブの位置をナノポア上になるように調整します。ROIグラムにピントが合うと、きらめく窒化膜は消えます。ロッキーグラムの焦点が合っていない状態でナノポアが形成されると、ほつれた爪のフリンジが見えます。
ホットオフでナノポアを画像化し、画像の強度プロファイルを作成します。ナノポアの直径は、プロファイルの最も暗い領域によって推定できます。電子プローブは、必要に応じてナノポアを拡大するために使用できます。
必要な直径がある場合。モノクロメーターを標準設定にしてTEMモードに切り替えます。明視野TEMを使用して、細孔サイズを確認します。
まず、生理食塩水のデガスを準備します。溶液を真空下に入れ、浴中で20分間超音波処理します繊細に、窒化ケイ素チップを含む壊れやすいナノポアを10ミリリットルのパイレックスくちばしに入れます。次に、ドラフトでビーカーをホットプレートに置きます。
ナノポアチップをピラニア溶液で非常に慎重に洗浄します。まず、ガラスピペットを使用して容器に3ミリリットルの硫酸を加えます。次に、硫酸に1ミリリットルの高過酸化水素を慎重に加えます。
万全の注意を払ってください。ナノポアチップを10分間浸します。次に、ガラスピペットを使用して、ビーカーからピラニア溶液を取り出し、適切に廃棄します。
次に、ビーカーにデガガス脱イオン水を入れます。清潔なガラスピペットを使用して、ビーカーの水を空にし、この洗浄を少なくとも5回繰り返します。清潔なピンセットでナノポアチップを取り除き、光吸引で乾燥させます。
乾いたら、すぐにナノポアチップをチャンバーに密封します。チップは、Oリングまたはシリコンシーラントによってチャンバーに固定できます。チャンバーに塩化カリウム溶液を入れます。
銀、塩化銀電極をチャンバーに接続します。電極は、銀線を漂白剤に一晩浸すことによって作ることができます。電極に膜貫通電位を印加し、パッチクランプアンプを使用して電流応答をモニターします。
電圧クランプ・モードでは、測定値から電流電圧曲線を作成します。曲線は高度に線形である必要があります。1モルの塩化カリウムを使用する場合、ナノポアのコンダクタンスはその直径に対応する必要があります。
ナノポアが線形IVカーブを示さない場合、コンダクタンスが低すぎるか、ナノポアの開電流が安定していません。これは、ナノポアが適切に結合されていないことを示しており、ピハ洗浄を繰り返す必要があります。液体がナノポアの内側にあることを確認することが不可欠です。
このステップを適切に行わないと、ナノポアを流れるイオン電流が非常に大きなノイズを示し、ナノポアへのタンパク質の分配が大幅に減少します。まず、目的のタンパク質の精製サンプルをチャンバーの接地槽に加えます。サンプルが完全に拡散するのを待ちます。
研究対象のタンパク質の総電荷と反対の極性を持つ膜貫通電位バイアスを適用します。200ミリボルトの印加電位は、観測するのに十分な大きさである必要があります。ほとんどのタンパク質分析種イベントは、ベースラインからの一時的な電流偏向として現れます。
シグナルが観察されない場合は、チャンバー内のタンパク質の濃度を上げます。電圧が高いほど、信号対雑音比と窒化物が改善されます。ナノポアは数ボルトに耐えることができます。
タンパク質の吸収は、ナノポアのベースライン電流の長期にわたる変化として現れます。固体ナノポアの典型的な結果は以下の通りです。開孔電流は非常に安定している必要があります。
ナノポアのIV特性は、高度に直線的である必要があります。1モル塩化カリウム、10モルリン酸カリウムpH 7.4では、IV曲線への線形適合の傾きがナノポアのユニタリーコンダクタンスを提供します。コンダクタンスはナノ細孔の直径と直接的な関係があり、方程式と一致する必要があります。
この値は30%以内に一致する必要があります値が小さすぎると、毛穴がタンパク質の添加と結びついていない可能性があります。急速なイベントは、タンパク質の吸収が長寿命の電流低下であるはずです。一部のタンパク質は非常に不安定で、細孔内部で構造変化を起こします。
この場合、長寿命の電圧降下には急激な変動が伴います。このビデオを見れば、走査型透過電子顕微鏡を使用して固体ナノポアを製造する方法と、その態勢を整えたSAタンパク質吸収を使用する方法について十分に理解できるはずです。ピラニア溶液での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、手袋、白衣、化学エプロンを着用してヒュームフードで作業するなどの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。
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概要
この記事では、固体ナノポアを使用して無機表面上のタンパク質吸着をモニタリングする方法について説明しています。この技術は、抵抗パルス原理を利用して、単分子レベルでのリアルタイム観察を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- ナノテクノロジー
- 生物物理学
- タンパク質化学
背景
- ナノポアは、分子間相互作用を研究するために使用できる小さな穴です。
- タンパク質吸着の理解は、様々な生物学的応用にとって重要です。
- 抵抗パルス原理により、単分子を検出することができます。
- リアルタイムのモニタリングは、動的プロセスへの洞察を提供します。
研究の目的
- 固体ナノポアを使用してタンパク質吸着を研究する方法を開発すること。
- 単分子レベルでの吸着プロセスを定量化すること。
- タンパク質吸着に関連する反応速度定数を決定すること。
使用された方法
- 人工膜にナノポアの作成。
- 窒化物膜にナノポアをドリルすること。
- イオン溶液を含むチャンバーにナノポアをロードすること。
- イオン電流を観察するために電圧を加え、タンパク質を実験用に追加すること。
主要な結果
- リアルタイムでのタンパク質吸着のモニタリングに成功。
- 吸着定数の定量的決定。
- 表面とのタンパク質相互作用の動態に関する洞察。
- ナノポアの並列アレイの有効性の実証。
結論
- この方法は、タンパク質吸着を研究するための強力なツールを提供します。
- 単分子レベルでのリアルタイムモニタリングは、吸着ダイナミクスの理解を深めます。
- 将来の応用には、生物物理学やナノテクノロジーの様々な分野が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Solid-state nanopore assays enable direct, label-free monitoring of protein adsorption at the single-molecule level, addressing critical challenges in understanding protein-surface interactions for biopharma R&D. This capability is increasingly vital as device miniaturization amplifies the impact of protein adsorption on microfluidic and analytical platforms. Integrating nanopore-based analytics supports predictive confidence and mechanistic de-risking in early discovery and assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of protein-surface interactions relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports mechanistic de-risking by revealing adsorption dynamics under diverse solution conditions.
- Facilitates functional validation of protein behavior on inorganic and functionalized surfaces.
Screening & Assay Development
- Provides a rapid, quantitative assay for protein binding to nitride and other thin films.
- Delivers reproducible, label-free readouts suitable for standardization across platforms.
- Prepares validated systems for downstream compound screening and analytical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Enables exploration of protein stability and adsorption in confined environments relevant to device development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by characterizing protein-material interactions.
- Offers predictive insights into protein behavior in microfluidic and diagnostic systems.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore-based assay fits within the early discovery to assay development continuum, providing foundational data for lead identification and preclinical device design.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic clarification of protein-surface interactions.
- Screening: Enables reproducible, quantitative assessment of protein adsorption for assay readiness.
- Analytics: Provides single-molecule current measurements and adsorption event signatures for comparative analysis.
- Translational Research: Aligns with preclinical device development by modeling protein behavior in confined, device-relevant environments.
- Enterprise Reuse: Adaptable to a range of proteins, surfaces, and experimental conditions for broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in protein-material studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible single-molecule assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage risk in device and assay development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of protein candidates and device platforms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanopore fabrication and single-molecule current analysis.
- Needs access to electron microscopy and patch clamp instrumentation.
- Demands rigorous cleaning and standardization protocols for reproducibility.
- Adaptable to various thin films and functionalized surfaces as supported by nanopore drilling.
- Safety precautions are critical when handling hazardous cleaning reagents.
