Name: 齧歯類のために全体の動物灌流固定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶ齧歯類の全身灌流固定法。生理的圧力を用いてラット脳組織を適切に保存し、免疫組織化学のためのサンプル調製を可能にします。この再現性の高い手法は神経科学研究に有用です。

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この作業は神経通信技術センター（CNCT）、生物医学イメージングとバイオの国立研究所（NIBIB、P41 EB002030）によって資金を供給され、国立衛生研究所（NIH）でサポートされているP41リソースセンターによって資金を供給された。

1。固定液を準備する （テーブルの固定液とバッファを参照してください。） 2。灌流バッファを準備します。 （テーブルの固定液とバッファを参照してください。） 3。装置および麻酔を準備します。 <ol><li> 37水浴、暖かい血バッファを使用し℃、バッファーを満たしたビーカー中で出口弁を配置します。バッファー50 mlシリンジを記入し、固定チューブに接続します。バッファを追放し、撤退によって繰り返しチューブをフラッシュします。 </li><li>チューブ内のすべての気泡が除去されるまで、バッファの行をクリアします。それは、行のいずれかに気泡を持っていないように血流の成功のために重要である。 </li><li>シリンジを取り外し、4％パラホルムアルデヒド固定（室温）容器を接続します。容器にチューブを配置しながら、チューブ端で空気の泡を避けるために、チューブを絞るように、エンドトンからバッファ突出のドロップ容器内の液体表面に接触O。 </li><li>出口ポート（ニードルの端）を閉じます。固定バルブ（白）と同じ位置にバッファーバルブ（青）を回します。これは、バッファラインからの流れをできるようになります。 </li><li>出口ポートを開くとバッファラインを充填するためのA3 A1からステップを繰り返します。すべての気泡がチューブに気泡を導入しないように注意しながら、注射器を削除し、バッファー容器を接続し、出口ポートを閉じて排除された後。 </li><li>ゴム製の圧力計のブラブをポンプで圧力を保持する能力のためのシステムをテストします。システム内の空気の圧縮性に起因するいくつかの抵抗が通常あります。 </li><li>アクセスの容易なために、手術ツールをセットアップします。気泡の可能性を排除するために緩衝液を灌流針を記入してください。 </li><li>手術前に、キシラジン/ケタミン混合物（最大80 mg / kg体重のケタミンおよび10 mg / kg体重のキシラジン）腹腔内注射（27ゲージ針と1ccの注射器）を介して投与され。麻酔薬の追加投与は、麻酔の外科的平面を維持するために、各操作の過程で必要に応じて実行されます。 </li></ol> 4。血流外科<ol><li>動物が麻酔の外科的平面に達すると、砕いた氷で満たされた浅いトレイの上に置きます。 （麻酔の深さを決定するためにつま先ピンチ応答メソッドを使用します。続行する前に動物が応答しなければなりません）。 </li><li>ちょうど肋骨の下の外皮と腹壁を介して5〜6センチメートル横切開を行います。横隔膜から肝臓を慎重に分離します。 </li><li>湾曲した、鈍いはさみを使って横隔膜に小切開を行います。指の位置と圧力がダイアフラムを削減するための能力を支援することができます。 </li><li>胸膜腔を公開するために肋骨の全長に沿って横隔膜切開を続行します。 </li><li>注意深く肺を変位、肋骨の片側に沿って湾曲した、鈍いはさみを配置し、cuを作るアップ鎖骨に肋骨を介してT。反対側も同様のカットを行います。 </li><li>離れて胸骨を持ち上げ、慎重に心臓に接続する任意の組織をトリミングします。止血剤と胸骨の先端をクランプし、頭の上に止血剤を配置します。正常に完了したら、胸腺は、主要な血管の明確なビューを提供し、胸骨と一緒に中心から離れて持ち上げる。 </li><li>アイリスのはさみを使用して左心室の後端に小さな切開を行います。 </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3564/3564step7.jpg" /> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3564/3564step7large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <ol start="8"><li>上行大動脈にカット心室を通して15ゲージ平滑末端またはオリーブ先端灌流針を渡します。先端が大動脈の壁を通して見えるようにする必要があり、上腕動脈と頸動脈動脈が分岐する大動脈弓に到達してはいけません。 </li><li>心をクランプするために止血剤を使用して、これは、針を固定し、漏出を防ぐことができます。必要に応じて、変更された止血剤（これらのhemostatsは解剖が始まるまでの場所に残りますが、明確にするために、将来のイラストから省略されています）針の先端の周りに大動脈をクランプするために使用することができます。 </li><li>最後に、下行大動脈を損傷することなくできるだけ大きな口を作成するにはアイリスのはさみを使って動物の右心房に切開を行います。この時点で、動物は灌流する準備ができました。 </li></ol> 5。かん流<ol><li>気泡を導入しないように注意しながら針をベースに、出口ポートを開いて、添付してください。 </li><li>迅速＆均等に80ミリメートルHgの圧力に圧力計の電球を上げる。バッファ注入期間を通して、この圧力を維持します。タイマーを開始します。 </li><li>針の角度を調整します。針の角度は最大流量（角度調整付流量の変化に注意してください）​​の達成に重要である。 </li><li>バフを切り替えるERバルブ（青色）バッファがほぼ完成された後（200ミリリットル）。流体は、明確な実行する必要があります。肝臓のクリアは良い灌流の指標である。肝臓はこの時点で明確にする必要があります。あなたの記録のための時間を示しています。 </li><li>固定の震えは、数秒以内に観察する必要があり、これは固定の真の時間を考慮する必要があります。あなたの記録のための時間を示しています。 </li><li>圧力は徐々に安定した流量を維持するために130ミリメートルHgの2の最大値まで増加することができます。 </li><li>固定がほぼ終了した後、出口バルブを閉じます。あなたの記録の終了時間を示します。 </li><li>ラットは、この段階では硬い必要があります。 </li><li>使用されるホルムアルデヒドは、あなたの機関の規制に従って廃棄を収集し、保管する必要があります。 </li></ol> 6。解剖4,11 <ol><li>はさみのペアを使用してヘッドを取り外します。 </li><li>首から鼻まで外皮に沿って正中切開を行い、公開頭蓋骨。 </li><li>頭蓋底が露出されるように残っている首の筋肉を切り落とす、はさみまたはrongeursを使用して、任意の残留筋肉を削除します。 </li><li>慎重に頭蓋骨の内面に沿ってハサミをスライドさせ、一方の側に大後頭孔にアイリスはさみのペアの鋭い端に配置します。 </li><li>次に、後頭蓋表面の遠位端まで延びる切断してください。反対側で同じカットを行います。小脳の周りに頭蓋骨を片付けrongeursを使用しています。 </li><li>先端は、脳への損傷を防ぐために切断されるブレードを持ち上げ、背側遠位後方隅から頭蓋骨の先端の正面の端に移動するよう慎重に頭蓋骨の内面に沿ってハサミをスライドさせます。反対側に対して、この手順を繰り返します。 </li><li>脳から離れて、頭蓋骨の背面皮rongeursを使用します。同様rongeursを使用して、頭蓋骨の両側を切り落とす。 </li><li>スパチュラを用いて、嗅球と神経接続を切断脳の腹側表面に沿ってtions。 </li><li>優しく、まだアイリスはさみを使って頭蓋骨に脳を接続し、任意の硬膜をトリミング、離れて頭から脳をいじめる。 </li><li>脳を除去し、固定液を含有する流体脳自体の体積の少なくとも10倍のバイアルに入れてください。バイアル時折渦。 </li></ol> 7。ポスト固定＆ストレージ<ol><li>時折渦巻く、4°Cで24時間固定の脳を保つ。 </li><li> 24時間後、培地を3回交換し、それぞれの時間を渦巻くことによりリン酸緩衝化生理食塩と脳を洗ってください。 </li><li>脳は、その後リン酸塩に格納することができますアジ化ナトリウムを含む生理食塩水またはHBHSバッファと4℃に保った</li></ol> 8。代表的な結果灌流の成功の最初の指標は、鼻など四肢、耳、足など胸腺および肝臓（IHCワールド）などの内部器官のクリアです。脳の肉眼検査は、血液（淡黄色の外観に白）の血管voidを明らかにする。これは、染色と免疫組織化学のために運命づける組織切片内でもtrueになります。灌流の結果の最終的な指標は、組織内の微細構造の状態である。1,6,7,8 <table border="1"><tbody><tr><td> 固定液の準備： </td></tr><tr><td> 8％のパラホルムアルデヒドの在庫を準備します。 </td></tr><tr><td><ol><li> 500ミリリットルのdH 2 Oに40グラムのパラホルムアルデヒドを追加します。 60〜ソリューションを加熱 - 65°C（65を超えないようにしてください°C、そう悪影響を免疫組織化学的手順の成功に影響を与える可能性）を攪拌しながら。 </li><li>ソリューションをクリアするには、熱を削減し、スポイトで1.0 M NaOHを2〜3 mlを加える。 </li><li>フィルタと最大1ヶ月から4℃で保存。 </li></ol></td></tr><tr><td> 0.2 Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.4を準備します。 </td></tr><tr><td><ol start="4"><li>リン酸ナトリウム一塩基の在庫については、1 LのdH 2 Oに27.8グラムのNaH 2 PO 4 * H 2 Oを追加する</li><li>リン酸ナトリウム二塩基株式については、1 LのdH 2 Oに28.4グラムのNa 2 HPO 4を追加</li><li>塩基株式の190ミリリットルに一塩基株式の810ミリリットルを追加します。 </li></ol></td></tr><tr><td> 4％パラホルムアルデヒド固定液を準備します。 </td></tr><tr><td><ol start="7"><li> 0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液に等量の8％パラホルムアルデヒドの在庫を追加します。 </li><li>注：この修正は最高のは、事前に72時間以上のものを新たに調製されていません。 </li></ol></td></tr><tr><td> 灌流およびストレージバッファを準備します。 </td></tr><tr><td> リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4のバッファの準備 </td></tr><tr><td><ol start="9"><li> 1 LのdH 2 O </li><li> 9グラムのNaCl </li><li> 144 mgのKH 2 PO &lt;サブ&gt; 4 </li><li> 795ミリグラムのNa 2 HPO 4 </li><li> pHをチェックする</li></ol></td></tr><tr><td> HEPESは、アジ化ナトリウムpH7.4でハンクス液（HBHS）をバッファ </td></tr><tr><td><ol start="14"><li> 990ミリリットルのdH 2 O </li><li> 7.5グラムのNaCl、 </li><li> 0.3グラムのKCl </li><li> 0.06グラムのKH 2 PO 4 </li><li> 0.13グラムのNa 2 HPO 4 </li><li> 2グラムのブドウ糖/グルコース</li><li> 2.4グラム10ミリメートルのHepes </li><li> 0.1グラムのMgCl 2 6部のdH 2 O </li><li> 0.05グラムのMgSO 4 7部のdH 2 O </li><li> 0.165グラムのCaCl 2 2部のdH 2 O </li><li> 90mgのNaN 3を </li><li> pHをチェックする</li></ol></td></tr></tbody></table> 表1固定液とバッファーの調製。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig1.jpg" /> 図1。 </stronG&gt;ラベルコンポーネントと灌流装置。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig2.jpg" /> 図2：灌流装置I.の準備は固定行で開始します。気泡のチューブをフラッシュし、急速に注射器にし、ラインを介してバッファを追放し、撤退することで、バッファに記入してください。針側のバルブを遮断してください。気泡を導入することなく、固定瓶に固定行を置きます。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig3.jpg" /> 図3：灌流装置IIの調製。 1。針の端にバルブを開きます。 2。フローに配置するバッファバルブ（青）を回します。 3。気泡のチューブをフラッシュし、急速に追放し、シリンジでバッファを引き出すことによってバッファを使用して記入してください。 4。針の端にあるバルブを閉じます。バッファのボトルにチューブを置きます。システムが正しい密封されていることを確認する試験圧力圧力計の電球を汲み上げ、ゲージを見ながらLY。装置は、現在灌流手続きの準備ができています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig4.jpg" /> 図4バッファの配信のための位置に灌流装置。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig5.jpg" /> 図5潅流手術I.）は、外皮と腹壁を介して横方向の切開を行います。 b）の横隔膜の切開を行い、心臓を露出させる横隔膜を横切る。アップ鎖骨にリブの両側に平行にカットします。 c）の止血剤と胸骨の先端をクランプし、頭の上に止血剤を配置します。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig6.jpg" /> 図6。灌流手術II。 1）上行大動脈にカット心室を通して灌流針を渡します。 b）に固定灌流針が心臓をクランプするhemostatsのいずれかのセットを使用します。変更された止血剤の2番目のセットはまた、漏れを防止するために針の先端の周りに大動脈をクランプするために使用することができます。アイリスのはさみを使用すると、左心室の後端に小さな切開を行います。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig7.jpg" /> 図7。ライン内の圧力を作成するためのバッファポンプ圧力計の電球と灌流。バルブ（1）を開くと、針ハブに接続します。それは空気の泡が導入されていないことを確認することが重要です。 80ミリメートルHgの圧力に圧力計バルブをポンプおよびバッファ注入期間を通して、この圧力を維持します。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig8.jpg" /> 図8。固定液で灌流バッファがほぼ完成されるとは（200ミリリットル）が流れるように固定を可能にするためにバッファバルブ（1）を切り替えます。圧力は徐々にまで増加することができます130ミリメートルHgの最大値。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig9.jpg" /> 図9。解剖I.）は、はさみのペアを使用してヘッドを取り外します。 b）の首から鼻まで正中線に沿って皮膚切開を行い、頭蓋骨を公開します。頭蓋底が露出されるように、c）の残りの首の筋肉を切り落とす。頭蓋表面の大開口部（大後頭孔）がアクセスできるように頭部を保持します。慎重に大後頭孔にアイリスはさみのペアの鋭い先端を挿入し、切断してください。反対側に同じ操作を繰り返します。小脳の周りに頭蓋骨を片付けrongeursを使用しています。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/3564/3564fig10.jpg" /> 図10。解剖II。 1）慎重に頭蓋骨の内面に沿ってハサミをスライドさせます。あなたは脳への損傷を防ぐために切断される先端を持ち上げます。のために同じことを繰り返す反対側。脳から離れ頭蓋骨皮rongeursを使用しています。 b）の頭蓋骨のイラストは削除され、脳が露出した。 c）の脳の最も前方の位置に嗅球神経接続を切断するヘラを使用しています。慎重に削除を容易にするために接続を切断するための脳の下面に沿ってヘラの先端をガイドします。脳を除去し、固定液のバイアルに入れてください。

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</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

手術の成功のために追加のメモ： <ol><li>ダイアフラムが破られると、低酸素症および高炭酸ガス血症は、その後の分析を混乱させることが不可逆的生理的変化を開始するとして急速に先行する。 </li><li>針を挿入し、所定の位置に固定されている場合、残圧は、ニードル（フラッシュバック）のベースに血液をプッシュします。実際には、大きな動物が精力的に血液を除名することができます。それは、血液が少なくとも灌流を完了するには、障害物を提示する気泡を導入することを避けるために針の根元に到達することが重要です。ない血液が針の基地で観測されていない場合は、灌流リグの出口ポートに接続することによってバッファを使用して針と詰め替えを削除します。バッファがチップを介して実行されると、針が心臓に再挿入することができます。 </li><li>大動脈内針の適切な配置が重要である、それは限り大動脈弓として到達してはいけません。 </li><li>複数perfusionsが行われている場合、それはトン必要はありません。毎回最初からoがセットアップ。ユーザは、各ボトル（200mls動物/溶液）内のバッファと固定の両方に適切なボリュームを持っている必要があります。必要に応じてボトルも補充することができます。考慮すべき最も重要な側面は、動物へのセットアップ（出力バルブ）から実行される灌流ラインをフラッシュしています。灌流終了後、この行は、その中に4％パラホルムアルデヒドを持っています。バッファボトルからチューブを外し、固定を洗い流すために水を満たした50 mlの注射器を使用しています。出口弁はホルムアルデヒドの適切な処分のための廃棄物収集ビーカーに入れていることを確認します。この3回繰り返します。 2.3に示すように、同じメソッドを使用してバッファを補給。 </li><li>固定のためにこの方法では、実験の要件に応じてバッファと固定その他の固定剤（例えば、EMに使用されるものなど）の両方を変更する能力を持つ高度に適応可能である。 </li><li>このシステムは、頻繁に生きている組織の抽出に使用されています。このためにプロセス1は、単にバッファの配信を使用するだけ（まだ全体のシステムに接続されている間にバッファーボトルをアイスバケットに配置され、固定ボトルが空ではなく密閉型として設定されています）。これは、最適な圧力で冷緩衝液灌流を保証します。ここからシステムがいずれか（量が問題にならない場合は）バッファに直接染料を追加したり、バッファ/バッファの間に染料溶液の最小限の量で注射器を使用することにより修正可能な染料の注入に適合させることができます - 固定ステップ。 </li><li>血管の鋳造の場合には、圧力監視バッファのステップは、50ミリリットル注射器のいずれかが（チューブ、バルブ、保持装置への直接配信や使い捨て二アタッチメントを使用する必要がありますしかし、粘度、鋳造ソリューションの本質を固めるために不可欠である現在のシステムとのインタフェースに加えられたコンテナ）を使用することができます。我々の研究室 &quot;血管のキャストは灌流装置の設計と製造を先行していた。したがって、我々は、stできません。圧力測定は、配信サイトで正確な測定であることを食べました。数字は、粘性流体の配信が成功を達成するために調整する必要があります。 </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> 機器 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 麻酔： </td></tr><tr><td>ケタミン/キシラジン混合物（麻酔が研究室/機関ごとに異なる​​場合があります） </td><td> Ketaset </td><td> NDC 0856-2013-01 </td><td> 10 mLのバイアル</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 手術： </td></tr><tr><td>針の先端、27 GA×1.25 &quot; </td><td>資材·サービス</td><td> 25251 </td><td></td></tr><tr><td>大鈍/鈍湾曲したハサミ（〜14.5センチメートル） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14519から14 </td><td></td></tr><tr><td>ストレートアイリスはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14058から11 </td><td></td></tr><tr><td&gt;標準ピンセット</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11027から12 </td><td></td></tr><tr><td>ファイン（グレーフェ）ピンセット</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11050から10 </td><td></td></tr><tr><td> 1つの大きな止血鉗子 - 曲線または直線（〜19センチ） </td><td> surgicaltools.com </td><td> 17.21.51 </td><td></td></tr><tr><td> 2標準止血鉗子 - ストレートセレーション（14センチ） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 13013から14 </td><td></td></tr><tr><td> 1変更された止血剤（チップを介して提出し、15ゲージ穴付） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 13013から14 </td><td></td></tr><tr><td> 15ゲージの鈍またはオリーブ先端が針（灌流針） </td><td> Fisnar </td><td> 5601137 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 灌流 ： </td></tr><tr><td> HyPerfusionシステムまたは同等の&lt;/ TD&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4の緩衝</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.1 Mリン酸緩衝液、pH7.4中4％パラホルムアルデヒド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>浅いガラスまたはプラスチックトレイ、約10 &quot;×10&quot; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クラッシュアイス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>水浴（37℃） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>タイマー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50mlの注射器</td><td> MEDLINE産業</td><td> NPMJD50LZ </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 解剖 ： </td></tr><tr><td>パ標準的な鋭い/鈍いストレートはさみのIR（〜12センチ） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14054から13 </td><td></td></tr><tr><td>培地曲線または直線rongeurs（14-16 cm）または頭蓋骨除去ペンチ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 16020から14 </td><td></td></tr><tr><td>ストレートアイリスはさみ（〜9センチ） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14058から11 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロスパチュラ（ダブル2 &quot;フラット終了すると、1を丸め、円すい1〜1/8&quot;） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 10091から12 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ポスト·ボール＆ストレージ： </td></tr><tr><td> 50 mlのガラスバイアル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム（90mg / l）を40ミリリットルHEPES緩衝ハンクス溶液（HBHS） </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbodY&gt; </table>

齧歯類のために全体の動物灌流固定

Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents

固定の目的は、急速にかつ均一に生きているような状態で組織を維持することです。固定は、同じレート5,7で組織のすべての領域に到達しないため組織の小さな断片は、無傷の脳の浸漬固定のために問題を引き起こすような大きな試料でも固定の作品に直接組織を配置しながら。組織が ​​保存される前に、多くの場合、低酸素への応答の変化は、12を開始します 。直接循環系を介して固定液を灌流することの利点は、化学物質がすぐに自然な血管網を用いた生物の隅々に到達することができるということです。最も効果的に循環系を利用するためには、注意が生理的な圧力を3と一致するように注意する必要があります。生理的な圧力が使用される種に依存していることに注意することが重要です。灌流固定するためのテクニックは、固定される組織によって異なり、どのように組織は、次の固定を処理されます。このビデオでラットの心臓を免疫組織化学のための脳の最良の保全を得るために：我々は、血管系を介して灌流を4％パラホルムアルデヒドを用いた低コスト、迅速な、制御された均一な固定手順を説明します。この技術の主な利点（対重力給電システム）は、循環器系が最も有効に活用されていることです。

ラットの心臓部を介して脳の最良の保全を取得するには：ここでは、血管系を介して灌流を4％パラホルムアルデヒドを用いた低コスト、迅速な、制御された均一な固定手順を説明します。

固定の目的は、組織を生体に近い状態で、迅速かつ均一に保存することである。小規模な組織の場合、固定液に直接浸漬させる方法が有効であるが、...

本手順の全体的な目的は、免疫組織化学的手法のためにラットの脳組織を適切に保存できるよう、生理学的圧力を重視した灌流固定技術を実演することです。まず、灌流装置の使用方法とセットアップについて説明します。次に、灌流手術および脳摘出に必要な器具を準備し、深く麻酔した動物を砕氷を満たした浅いトレイに配置します。肋骨弓の直下で、皮膚および腹壁に5〜6 cmの側切開を加えます。心臓を露出させ、動物に灌流を行います。最後に、脳を取り出し、脳自体の体積の少なくとも10倍の液量を含む固定液のバイアルに入れます。この手順の全体的な目的は、免疫組織化学染色に向けてラットの脳組織を適切に保存するために、生理学的圧力を重視した灌流固定法を実演することです。まず、灌流装置の準備から始めます。これには約10分かかります。50 mLのシリンジを使用し、すべての気泡が除去されるまで、固定液ラインをバッファーで繰り返し洗浄し、クリアにします。灌流を成功させるには、いずれのラインにも気泡が存在しないことが極めて重要です。これは、流出口バルブを緩衝液で満たしたビーカーの中に配置することで達成されます。次に、流出口バルブを閉じます。次に、チューブの端にバッファーが1滴垂れるようにチューブを絞りながら、シリンジからチューブを取り出します。充填されたチューブの固定液入口を、動物1匹あたり 200 milliliters のパラアルデヒド固定液が入ったボトルに入れます。この際、気泡が入らないように注意してください。シールが適切に密着していることを確認しながら、キャップを締めます。適切に密着していない場合、密閉系内の圧力が維持されません。ボトルを灌流装置にセットします。アウトレットポートを閉じ、バッファーバルブを固定液バルブと同じ位置に回して、バッファーラインのみからフローを設定します。アウトレットポートを開き、固定液ラインのときと同様にバッファーラインを洗浄します。ラインの洗浄が完了したら、チューブをバッファーボトルに入れます。次に、システムの耐圧性を確認します。ゴム製のマノメーターバルブをポンプすると、抵抗が感じられます。これで最終準備が完了です。気泡の混入を防ぐため、灌流針をバッファーで満たします。これで灌流の準備が整いました。つま先でのピンチテストにより手術麻酔面にあることを確認し、ケタミン・キシラジン混合液を投与した後、完全に麻酔したラットを砕氷を満たした浅いトレイの上に置きます。動物が完全に麻酔されたことを確認してから、次の工程に進んでください。肋骨縁の直下で、皮膚および腹壁に5〜6 cmの側方切開を加え、手術を開始します。横隔膜から肝臓を慎重に分離します。曲がった鈍端剪刀を用いて、横隔膜に小さな切開を加えます。指の位置と圧力を調整することで、横隔膜を切りやすくすることができます。胸腔を露出させるため、肋骨に沿って横隔膜の切開を全長にわたって継続します。湾曲した鈍端剪刀を肋骨の片側に沿わせ、肺を慎重にずらしながら、肋骨を切り開き、鎖骨まで切断します。次に、反対側でも同様に切断します。その後、胸骨を持ち上げ、心臓に接続している組織を慎重に切り離します。止血鉗子で胸骨の先端をクランプし、止血鉗子を頭側へ移動させます。これにより胸骨が持ち上がり、主要血管が明確に見えるようになります。アイリス剪刀を用いて、左心室の後端に小さな切開を加えます。15ゲージの鈍端またはオリーブチップの灌流針を、切開した心室から上行大動脈へと挿入します。針先は大動脈壁を通して視認できる必要がありますが、腕動脈と頸動脈が分岐する大動脈弓まで達してはいけません。針を固定し、漏れを防ぐために、止血鉗子で心臓をクランプします。最後に、アイリス剪刀を用いて右心房に大きな開口部を作ります。この際、下行大動脈を損傷しないよう注意してください。これで、動物の灌流準備が整いました。右心房にある灌流針を、気泡が入らないようにアウトルックポートに接続し、アウトルックポートを開きます。次に、マノメーターバルブを素早く均一にポンプし、圧力を 80 millimeters of mercury まで上げます。緩衝液の注入期間中、この圧力を維持してください。ここでタイマーを開始します。流量が最大になるように針の角度を調整し、バッファーがほぼ終了した時点でバッファーバルブを切り替えます。肝臓の灌流が完了すると、流出液が透明になり始めます。これは灌流が良好であることを示しており、肝臓の脱色時間を速やかに記録してください。この後、固定震顫（しゅしん）が観察されます。これを真の固定時間として記録してください。流量を一定に維持するため、圧力は最大130 millimeters of mercuryまで徐々に上げることができます。固定液がほぼ使い切られたところで、流出口のバルブを閉め、時間を記録します。この時点でラットの体は硬くなっているはずです。これでラットの臓器を採取することができます。脳を取り出すには、ギロチンを用いて頭部を切り離し、固定したラットの解剖を開始します。次に、頸部から鼻にかけて外皮に正中切開を加え、ハサミを用いて頭蓋骨を露出させます。頭蓋底が露出するように、残りの頸筋を切り取り除きます。アイリスシザーズの鋭い先端を片側の大後頭孔に入れ、頭蓋骨の内面に沿って慎重にハサミを滑らせます。次に、後頭蓋表面の遠位端まで切開します。反対側でも同様に切開します。その後、テロスを用いて小脳周囲の頭蓋骨を除去します。ハサミの先端を、頭蓋骨の内表面に沿って、背側遠位後方角から遠位前頭縁まで慎重に滑らせます。刃先を持ち上げて脳を傷つけないように注意してください。この操作の後、反対側でも同様に切開を繰り返します。次に、ピンセットを用いて、脳から頭蓋骨の背面を剥離します。同様にピンセットで頭蓋骨の側面を切り取り、取り除きます。続いて、スパチュラを用いて、脳の腹側にある嗅球と神経接続を切断し、脳を頭部から慎重に分離させます。アイリスシザーを用いて、脳と頭蓋骨を連結している硬膜を切断します。脳を取り出した後、脳自体の体積の少なくとも10倍以上の量の固定液が入ったバイアルに入れます。このバイアルを4°Cで24時間保存します。24時間後、脳をPBSで3回、緩やかに揺らしながら洗浄します。その後、脳はPBSまたはヘインクス液（Hanks' balanced salt solution）に保存できます。アジ化ナトリウムを加えた4°Cの条件下では、脳を3か月間保存することが可能です。切断せずに行います。習熟すれば、灌流全体を5〜8分で完了させることができます。

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