における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル

心臓由来細胞を細胞培養プレートに配置し、擬似的な虚血状態を作製します。再灌流モデルにおける虚血は、酸素濃度を0.5%以下に維持した状態で、グルコースフリー培地で150分間保持することで実現されます。この虚血期間により、ほとんどの細胞で収縮および水疱形成が起こります。その後、通常の培地と酸素レベルを再導入し、再灌流をシミュレートします。

間葉系幹細胞を添加し、損傷細胞とともに共培養します。24時間の共培養後、細胞をカルシウムおよびEthidium homodimerで染色します。生細胞と死細胞を区別するため共焦点顕微鏡を用いて観察すると、2つの細胞集団とその相互作用が明確に示されます。フローサイトメトリー分析により、損傷細胞の3つのクラスターが明らかになり、これらはグラフにプロットして統計的に分析することができます。幹細胞移植のプロトコルは臨床応用に導入されつつあります。最近の研究では、より優れた結果を得ること、プロトコルの堅牢性を高めること、および移植可能な細胞の新たな供給源を探索することに焦点が当てられています。

細胞療法の有効性を調査することは容易ではなく、治療プロセスに関与するメカニズムを研究するための新しいツールが必要です。私たちは、虚血、灌流障害、および幹細胞移植時における細胞間接続やサブ細胞レベルのメカニズムまでも観察可能にするための実験プロトコルを設計しました。設計基準として、完全なin vitroシステムを採用し、ホスト細胞とドナー細胞のみが存在するようにしています。

これにより、周囲の組織から隔離されます。損傷前、損傷中、および損傷後から最大24時間にわたって、細胞生存率を連続的に測定します。また、両方の細胞集団を明確に識別することで、移植細胞の運命を追跡することが可能です。

この目的を達成するために、一般にOGDと略される酸素・グルコース剥奪プロトコルを確立し、それに続いて再酸素化期間を設けました。宿主細胞には、既知のラット心筋芽細胞株であるC2細胞（9代）を選択しました。OGD後、骨髄由来間葉系幹細胞を培養液に添加して移植し、損傷した細胞をサポートしました。

このセットアップにより、共焦点顕微鏡を用いて細胞間接続を調査し、フローサイトメトリーによって損傷細胞の生存率を定量化することが可能になりました。それでは、実際にどのように行うか見ていきましょう。H nine C two 細胞から培地を除去します。

細胞をPBSで2回洗浄し、0.05% trypsin EDTAを用いてペトリ皿内で5分間消化させます。37°Cのインキュベーター内で、DMEM培地を加えてトリプシンを不活化します。細胞を1200 RPMで8分間遠心分離します。

上清を除去した後、細胞を1 mLのDMEM培地で再懸濁します。トリパンブルー染色を用いてサイトメーターで細胞数を計測し、12ウェルプレートの1ウェルあたり30,000個のH9C2細胞を播種します。プレートを37 °CのCO₂インキュベーターに入れ、24時間培養します。吸引によって培地を除去し、PBSで細胞を2回洗浄します。

グルコースを含まない培地を3 mL加えます。プレートを細胞インキュベーションシステムに入れます。窒素ガスを導入し、インキュベーションシステム内の酸素をパージします。

酸素レベルが0.5%に達するまで待ちます。その後、タイマーを開始してください。0.5%の酸素は、約3 mmHgの酸素分圧に相当します。対象となる細胞を150分間の擬似虚血状態に置きます。虚血の間、細胞は表面から剥離し、細胞膜に水疱形成（ブラビング）が始まります。各細胞集団によって必要とされる時間はわずかに異なり、細胞の剥離率が60～80%に達することを確認しました。

そのため、まずは2回目の再灌流（R）培養から始めることを推奨します。もし不十分な場合は、酸素・糖欠乏（OGD）の時間を延長してください。当研究の場合、9世代のC2細胞では、模擬虚血の終末に通常150～170分間のOGDが必要となります。

細胞からグルコース不含培地を除去し、ウェルに通常の培養培地をピペッティングします。12ウェルプレートを37°Cの二酸化炭素インキュベーター内で30分間静置します。これが再灌流期間となります。

模擬虚血の間、移植用のレスキュー細胞を調製します。蛍光色素のVibrant DIDをDMEM培地で1:200の比率で希釈します。レスキュー細胞から培地を吸引し、Vibrant DIDを含むDMEMを300 µL添加し、37 °CのCO₂インキュベーター内で30分間静置します。

再灌流終了後の30分後に、虚血後のH9c2心筋芽細胞に対し、1ウェルあたり1,000個の間葉系幹細胞を添加します。初期の手順は、H9c2の播種、PBSによる2回の洗浄、トリプシン処理、および細胞数カウントまでと同様です。共培養した細胞を37°CのCO₂インキュベーター内に24時間静置します。

24時間後、ピペッティングによってウェルから培養液と接着細胞を回収します。24時間のインキュベーション中に一部の死細胞が培養皿の表面から剥離している可能性があるため、培養液も合わせて回収することが非常に重要です。

細胞を500 µLのLive/Dead染料溶液（5 µMのCalcein AMおよび400 nMのEthidium homodimer-1を含むPBS）に懸濁し、5×10⁴ cells/mLとします。共培養の場合、間葉系幹細胞は、それぞれの蛍光細胞標識によってH9C2細胞と区別されます。これにより、細胞融合や細胞間接触部位を検出することが可能になります。

死細胞の割合は、各培養物について10倍の対物レンズを用いて、ブラインド方式で独立した4つの視野で評価し、再現性のある細胞計数結果を得ます。細胞をフローサイトメトリー用チューブに移します。Cell Quest Proソフトウェアを起動し、測定のためにフローサイトメーターの設定を行います。

生細胞および死細胞のコントロールサンプルを調製します。生細胞は、通常条件で同密度に培養し、カルシウムで染色します。死細胞は、10 µMの過酸化水素で1時間処理し、Ethereum homodimerで染色した後、同様の方法で回収します。装置の設定は、生細胞がカルシウム陽性かつEthereum homodimer陰性となるように調整してください。

死細胞がカルシウム陰性かつEthereumホモダイマー陽性である一方で、これらの集団の割合はグラフ上のバーとして表現でき、これらの値を用いて統計解析を行うことができます。健康な幹細胞を添加することで、集団内の生存細胞の比率が高まることが分かりました。興味深いことに、損傷後に救済された細胞は、死細胞だけでなく、生存し続けていた細胞からもゲート分けして抽出できることが観察されました。

本集団はさらなる調査に値すると考えられます。このビデオを視聴することで、標準化された方法で、in vitro幹細胞移植を用いた模擬虚血実験を実施する方法について十分な理解が得られたはずです。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。技術的なご質問がある場合は、お気軽にお問い合わせください。サポートさせていただきます。