Name: における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 学ぶin vitro虚血再灌流モデルで心筋細胞の幹細胞治療効果を評価する方法。共培養とフローサイトメトリーにより細胞生存率を定量的に解析し、虚血後の細胞回復メカニズムを解明します。

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この作品は、OTKA（ハンガリー科学研究費）D45933、T049621、TET（ハンガリー科学技術振興財団）A4/04、Arg-17/2006とSIN、Bolyai、ÖvegesのフェローシップとTÁMOPによってサポートされていました4.2.2-08 / 1 / KMR - 2008 - 0004および4.2.1 / B 09/1/KMR-2010-0001。 OTKA 83803。我々は、Voice overを提供するためにウィリアムのGesztesに感謝します。

1。 H9c2 cardiomyoblast細胞の準備 H9c2ラットcardiomyoblastsは、ATCC（ヴェーゼル、ドイツ）から入手し、高グルコース（4.5 g / L）のDMEM、10％ウシ胎児血清、4mMのL -グルタミン、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを含むで増殖させた。 H9c2筋芽細胞株は、ラット胚の心臓に由来する、それが骨格と心筋8,9の両方のin vitroモデルとして使用されます。 H9c2細胞の12ウェルプレートを準備します。 <ol><li> H9c2細胞のペトリ皿から培地を削除します。 </li><li> 2〜3ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTAを5mlのPBSとダイジェストで細胞を2回洗浄する。 </li><li> 37℃インキュベーター内で5分間、ペトリ皿を置きます。 </li><li> 10ミリリットルのDMEM培地とトリプシンを阻害する。 </li><li> 8分間1200rpmで細胞をスピンダウン。 </li><li> 1ミリリットルDMEM培地とトリパンブルー染色を用いて血球計算板でカウント細胞上清、再懸濁し、細胞を除去した後。</li><li> 12ウェルプレートにウェル当たり2ミリリットルDMEMでシード3万H9c2細胞を。 </li><li> 24時間37℃のCO 2インキュベーター内にプレートを置きます。 </li></ol> 2。シミュレートされた虚血/再灌流虚血/再灌流はH9c2細胞培養で酸素グルコース欠乏（OGD）を実行することにより、in vitroでシミュレートされました。この手順は、OGD中の細胞の観察を可能にPeCon細胞培養系（Erbach、ドイツ）とツァイス共焦点顕微鏡のステージで行われました。 <ol><li> H9c2細胞の12ウェルプレートから吸引して培養液を除去。 </li><li> PBSで2回細胞を洗浄する。 </li><li>ウェルあたり3 mlのグルコースフリー培地を追加。 </li><li>細胞の培養系にプレートを置きます。 </li><li>インキュベーションシステムのうち、酸素をパージするために窒素ガスを開始します。 </li><li>その後、タイマーを開始する酸素のレベルが0.5％に達するまで待ちます。 0.5％の酸素が約3 mmHgの部分的な緊張を意味します。 1〜対象セルシミュレートされた虚血の50分。 </li><li>シミュレートされた虚血の終わりには、細胞からグルコース培地を取り除く。 </li><li>ウェルにピペット2ミリリットル通常の培養培地。 </li><li> 37℃CO 2インキュベーターで30分間、12ウェルプレートを置きますが、これは&quot;再灌流の期間&quot;です。 </li></ol> 3。準備救助間葉系幹細胞ヒト由来の骨髄は、4 mM L -グルタミン、T75フラスコに入れ、10％ウシ胎児血清（FCS）、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlのストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）培地で希釈し、 1g /リットルのグルコース。フラスコは、3日間、5％CO 2の完全な加湿雰囲気中で37℃でインキュベートした。潜伏期間の後にフラスコや骨髄の残りのコンポーネントの表面に付着したBMSCを、PBSで洗浄することにより排除された。使用されるBMSCを、実験1と5の通路の間であった。 IDEN細胞のティティは、フローサイトメトリーによる系統特異的細胞表面マーカーの存在によって確認された。造血LINAGE -特異的表面マーカー（CD34、CD45）と間葉の表面マーカー（CD73、CD90、CD105およびCD166）を調べた。 シミュレートされた虚血時には、移植用間葉系幹細胞を救う準備。 <ol><li> VybrantはDMEM培地で1:200の割合で、DID蛍光色素を希釈する。 </li><li>救助の細胞から培地を吸引除去し、Vybrantがやったと300μlのDMEMを加える。 </li><li> 37℃CO 2インキュベーターで30分間場所ペトリ皿。 </li><li>間葉系幹細胞のペトリ皿から培地を削除します。 </li><li> 2〜3ミリリットル0.05％トリプシン/ EDTAを5mlのPBSとダイジェストで細胞を2回洗浄する。 </li><li> 37℃インキュベーター内で5分間、ペトリ皿を置きます。 </li><li> 10ミリリットルのDMEM培地とトリプシンを阻害する。 </li><li> 8分間1200rpmで細胞をスピンダウン。 </li><li>スーパを除去した後1ミリリットルDMEM培地およびトリパンブルー染色を用いて血球計算板でカウント細胞におけるrnatant、再懸細胞。 </li><li>再灌流の最後の30分後に虚血後のH9c2心筋芽細胞にも当たり20,000の間葉系幹細胞を加える。 </li><li> 24時間37℃CO 2インキュベーターに場所細胞の共培養。 </li></ol> 4。共焦点顕微鏡による解析シミュレートされた虚血/再灌流障害の後、細胞を24時間、通常の培養培地中でインキュベートされる。 <ol><li> 24時間は、PBSで細胞を2回洗浄した後。 </li><li> 30分間、500μlのLIVE / DEAD色素溶液（5 nMのカルセインと400nmのPBSでエチジウム-ホモ二量体-2）（5 × 10 4細胞/ ml）で細胞を染色。 </li></ol>形態と蛍光によって選択された生細胞と死細胞のための共焦点画像の評価は、ImageJのソフトウェア（国立衛生研究所、米国）で行うことができます。 cの場合にO -文化、MSCはそのVybrantのDID細胞標識のためにH9c2細胞と区別することができます。死細胞の割合は、盲検10の各カルチャのビューの4つの独立した分野（10倍目標）で評価することができます。 42 mmのガラス製カバースリップ上で培養H9c2 cardiomyoblastsはまた共焦点顕微鏡の細胞の培養系を用いて虚血/再灌流障害中および後の時間経過ビデオ顕微鏡で調べることができる。このような細胞融合と細胞間のナノチューブの形成などの細胞間相互作用は、時間をかけて研究することができる。 5。フローサイトメトリーによる解析シミュレートされた虚血/再灌流障害の後、細胞を24時間、通常の培養培地中でインキュベートされる。 <ol><li> 24時間後、培地を収穫。いくつかの死んだ細胞が24時間のインキュベーション中に、培養皿の表面から剥離している可能性があるため、また、培地を収集することは非常に重要です。る。 </li><li> 0.05％トリプシン- EDTAを含むPBSとダイジェストで細胞を2回洗浄する。 </li><li> DMEM培地とトリプシンを阻害する。 </li><li> 8分、1200 RPM（約150〜200グラム）で、細胞と収穫された培養液をスピンダウン。 </li><li>上清を捨てる。 </li><li> 30分間500μLデッド/ライブ色素溶液（5 nMのカルセインと400nmのPBSでエチジウム-ホモ二量体-2）（5 × 10 4細胞/ ml）で細胞を懸濁する。 </li><li>フローサイトメトリーチューブに細胞を移す。 </li><li> CellQuest Proソフトウェアを起動します。 </li><li>測定のためのフローサイトメーターを設定するには、生細胞と死細胞のコントロールサンプルを準備する。 <ol class="lalpha"><li>ポイント1で説明したように12ウェルプレートに3 × 4の密度でプレートH9c2細胞。 </li><li>ポイント1で説明したように、単一のトリプシン処理で細胞のコントロールを生きて準備。 </li><li> 1時間に10μMH 2 O 2で処理することにより、死細胞のコントロールを準備します。 </li><li>トリプシン処理後、resuspen500μlのLIVE / DEAD染料溶液（5 nMのカルセイン- AMおよび400nmのPBSでエチジウム-ホモ二量体A - 2）のd生と死細胞のコントロール。 </li></ol></li><li>死んだ細胞は正のカルセイン負とエチジウムホモ二量体である間、生きている細胞は、負のカルセイン正とエチジウムホモ二量体になるように機器設定を調整する必要があります。 </li><li>グラフと統計分析上のバーが、これらの値に対して実行できるようにこれらの人口の割合を表現することができる。 </li><li>別の実験群を測定する。 </li></ol> 6。代表的な結果： 我々の結果は、追加された間葉系幹細胞は虚血後の心筋細胞の生存率を改善できることを示した。共焦点顕微鏡画像は、おそらく観察保護10で重要な役割を果たしているような部分的な膜の接続や細胞間のナノチューブのような直接的な細胞間相互作用を、明らかになった。これらのナノチューブは、いくつかのセルdの距離にまたがっている場合iameters、およびそれらの直径は200〜500 nmの（白い矢印）の間であった。 <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。セル間のナノチューブ形成。ナノチューブの形成（白矢印）はVybrant DIOラベル付けcardiomyoblastsとVybrant DIDのラベルが付いた葉系幹細胞との間で観察された。 フローサイトメトリー分析は、生存と壊死cardiomyoblastsと間​​葉系幹細胞の集団を示した。興味深いことに、我々はまた、カルセインが含まれている第三に、&quot;負傷&quot;cardiomyoblastの細胞集団を観察しただけでなく、死んだ細胞、エチジウムホモ二量体（図2）の指標が含まれていました。 <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。シミュレートされた虚血後の異なる細胞集団の代表は、ドットプロット。 いくつかの実験の評価翔虚血後のH9c2のcardiomyoblastに間葉系幹細胞の添加は虚血後に単独で培養した心筋芽細胞（図3）と比較して有意に生きている細胞の割合を増加させることを結婚する。 <img src="/files/ftp_upload/3575/3575fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。虚血後のcardiomyoblasts上に幹細胞治療の効果は生きている細胞の割合が大幅にシミュレートされた虚血後に減少した対照と比較して（制御対IRモデル：90.36 ± 2.60対10.52 ± 0.48、*** P&gt; 0.001）。、添加後の増加間葉系幹細胞の（IRモデル対IR + BMSC：10.52 ± 0.48対25.21 ± 2.13、*** P&gt; 0.001）。データは平均値± SEMを表す。データの統計解析は、Tukeyの多重比較の事後検定と一元配置分散分析を用いて行った。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

実証プロトコルはそのようなモデルのすべての利点と欠点と心筋梗塞の幹細胞治療、のはるかに複雑な問題へのin vitroでのアプローチになります。もちろん、それが心筋梗塞の間と後に起きている複雑な（例えば、免疫学）のイベントを反映することはできませんが、虚血後の細胞で追加された細胞の直接的な効果に焦点を当てることができます。 H9c2 cardiomyoblasts上でシミュレートされた虚血の影響は非常に使用される細胞の継代の数とO 2濃度で、OGDの時間に依存する。一つは、正確にこれらのパラメータを調整し、標準化されたプロトコルを持つために、特定の細胞型に最適な条件を見つける必要があります。その後、プロトコルは、誘導多能性幹細胞や成体幹細胞は、そのような胚性幹細胞など、さまざまな追加の細胞型の効果を調べるために多くの方法（腎、肝または脳虚血/再灌流11,12,13,14）で使用することができます。 15、E馴化培地を16または様々な前処理を17,18または関心の焦点に任意のパラメータのffectiveness。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>カルセイン- AM </td><td>分子プローブ</td><td> L3224、C3099 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td>エチジウムホモ二量体A - 2 </td><td>分子プローブ</td><td> L3224、E3599 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr><tr><td> Vybrantは、DID </td><td>分子プローブ</td><td> V22887 </td><td> <a href="http://www.invitrogen.com">http://www.invitrogen.com</a> </td></tr></tbody></table> 表1。試薬。 <table border="1"><tbody><tr><td> 機器の名前 </td><td> 会社 </td><td> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td>ツァイス顕微鏡用PeCon細胞培養システム</td><td> PeCon社</td><td> <a href="http://www.pecon.biz/">www.pecon.biz/</a> </td></tr></tbody></table> 表2。機器。

における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

幹細胞移植のプロトコルは、臨床実践1,2,3への道を模索しています。 、より良い結果を得るためのプロトコルは、より堅牢な作り、そして埋め込 ​​み型細胞の新しい源を見つけることは4,5最近の研究の焦点です。細胞治療の有効性を調査することは容易ではないとの新しいツールは、処理工程6に関与するメカニズムを調査するために必要とされる。我々は、虚血/再灌流傷害時に、幹細胞移植後の携帯電話接続、さらには細胞内メカニズムの観察を可能にすると細胞療法の有効性を評価するために、虚血/再灌流の実験的なプロトコルを設計した。 H9c2 cardiomyoblast細胞は、細胞培養プレート7,8の上に置かれた。虚血は0.5％以下の酸素レベルとグルコースを含まない培地で150分でシミュレートされました。その後、通常のメディアと酸素レベルは、再灌流をシミュレートするために再導入されました。酸素グルコース欠乏後に、損傷した細胞を培養するためにそれらを追加することにより、間葉系幹細胞由来の標識されたヒトの骨髄の移植で治療された。彼らは簡単に拡張および自家、最小侵襲手術で簡単にアクセス可能であるため、間葉系幹細胞が臨床試験で好ましい。共培養の24時間後、細胞は生細胞と死細胞を区別するためカルセインとエチ-ホモ二量体で染色した。このセットアップでは、私たちは共焦点蛍光顕微鏡を用いて細胞間の接続を調査し、フローサイトメトリーによる虚血後の細胞の生存率を定量化することができました。共焦点顕微鏡は、細胞融合と細胞間のナノチューブの形成などの2つの細胞集団の相互作用を示した。フローサイトメトリー分析は、グラフ上にプロットし、統計的に分析することができる損傷した細胞の3つのクラスタを明らかにした。これらの集団が別々に調べることができると結論は、シミュレートの有効性にこれらのデータを描画することができます治療的アプローチ。

我々は、セットアップする方法を示しています<em&gt; in vitroで</em&gt;虚血/再灌流モデルとどのように虚血後の心筋細胞の幹細胞治療の効果を評価する。

幹細胞移植プロトコルが臨床現場に導入されつつあります1,2,3。より優れた結果を得て、プロトコルの堅牢性を高め、そして...

心臓由来細胞を細胞培養プレートに配置し、擬似的な虚血状態を作製します。再灌流モデルにおける虚血は、酸素濃度を0.5%以下に維持した状態で、グルコースフリー培地で150分間保持することで実現されます。この虚血期間により、ほとんどの細胞で収縮および水疱形成が起こります。その後、通常の培地と酸素レベルを再導入し、再灌流をシミュレートします。間葉系幹細胞を添加し、損傷細胞とともに共培養します。24時間の共培養後、細胞をカルシウムおよびEthidium homodimerで染色します。生細胞と死細胞を区別するため共焦点顕微鏡を用いて観察すると、2つの細胞集団とその相互作用が明確に示されます。フローサイトメトリー分析により、損傷細胞の3つのクラスターが明らかになり、これらはグラフにプロットして統計的に分析することができます。幹細胞移植のプロトコルは臨床応用に導入されつつあります。最近の研究では、より優れた結果を得ること、プロトコルの堅牢性を高めること、および移植可能な細胞の新たな供給源を探索することに焦点が当てられています。細胞療法の有効性を調査することは容易ではなく、治療プロセスに関与するメカニズムを研究するための新しいツールが必要です。私たちは、虚血、灌流障害、および幹細胞移植時における細胞間接続やサブ細胞レベルのメカニズムまでも観察可能にするための実験プロトコルを設計しました。設計基準として、完全なin vitroシステムを採用し、ホスト細胞とドナー細胞のみが存在するようにしています。これにより、周囲の組織から隔離されます。損傷前、損傷中、および損傷後から最大24時間にわたって、細胞生存率を連続的に測定します。また、両方の細胞集団を明確に識別することで、移植細胞の運命を追跡することが可能です。この目的を達成するために、一般にOGDと略される酸素・グルコース剥奪プロトコルを確立し、それに続いて再酸素化期間を設けました。宿主細胞には、既知のラット心筋芽細胞株であるC2細胞（9代）を選択しました。OGD後、骨髄由来間葉系幹細胞を培養液に添加して移植し、損傷した細胞をサポートしました。このセットアップにより、共焦点顕微鏡を用いて細胞間接続を調査し、フローサイトメトリーによって損傷細胞の生存率を定量化することが可能になりました。それでは、実際にどのように行うか見ていきましょう。H nine C two 細胞から培地を除去します。細胞をPBSで2回洗浄し、0.05% trypsin EDTAを用いてペトリ皿内で5分間消化させます。37°Cのインキュベーター内で、DMEM培地を加えてトリプシンを不活化します。細胞を1200 RPMで8分間遠心分離します。上清を除去した後、細胞を1 mLのDMEM培地で再懸濁します。トリパンブルー染色を用いてサイトメーターで細胞数を計測し、12ウェルプレートの1ウェルあたり30,000個のH9C2細胞を播種します。プレートを37 °CのCO₂インキュベーターに入れ、24時間培養します。吸引によって培地を除去し、PBSで細胞を2回洗浄します。グルコースを含まない培地を3 mL加えます。プレートを細胞インキュベーションシステムに入れます。窒素ガスを導入し、インキュベーションシステム内の酸素をパージします。酸素レベルが0.5%に達するまで待ちます。その後、タイマーを開始してください。0.5%の酸素は、約3 mmHgの酸素分圧に相当します。対象となる細胞を150分間の擬似虚血状態に置きます。虚血の間、細胞は表面から剥離し、細胞膜に水疱形成（ブラビング）が始まります。各細胞集団によって必要とされる時間はわずかに異なり、細胞の剥離率が60～80%に達することを確認しました。そのため、まずは2回目の再灌流（R）培養から始めることを推奨します。もし不十分な場合は、酸素・糖欠乏（OGD）の時間を延長してください。当研究の場合、9世代のC2細胞では、模擬虚血の終末に通常150～170分間のOGDが必要となります。細胞からグルコース不含培地を除去し、ウェルに通常の培養培地をピペッティングします。12ウェルプレートを37°Cの二酸化炭素インキュベーター内で30分間静置します。これが再灌流期間となります。模擬虚血の間、移植用のレスキュー細胞を調製します。蛍光色素のVibrant DIDをDMEM培地で1:200の比率で希釈します。レスキュー細胞から培地を吸引し、Vibrant DIDを含むDMEMを300 µL添加し、37 °CのCO₂インキュベーター内で30分間静置します。再灌流終了後の30分後に、虚血後のH9c2心筋芽細胞に対し、1ウェルあたり1,000個の間葉系幹細胞を添加します。初期の手順は、H9c2の播種、PBSによる2回の洗浄、トリプシン処理、および細胞数カウントまでと同様です。共培養した細胞を37°CのCO₂インキュベーター内に24時間静置します。24時間後、ピペッティングによってウェルから培養液と接着細胞を回収します。24時間のインキュベーション中に一部の死細胞が培養皿の表面から剥離している可能性があるため、培養液も合わせて回収することが非常に重要です。細胞を500 µLのLive/Dead染料溶液（5 µMのCalcein AMおよび400 nMのEthidium homodimer-1を含むPBS）に懸濁し、5×10⁴ cells/mLとします。共培養の場合、間葉系幹細胞は、それぞれの蛍光細胞標識によってH9C2細胞と区別されます。これにより、細胞融合や細胞間接触部位を検出することが可能になります。死細胞の割合は、各培養物について10倍の対物レンズを用いて、ブラインド方式で独立した4つの視野で評価し、再現性のある細胞計数結果を得ます。細胞をフローサイトメトリー用チューブに移します。Cell Quest Proソフトウェアを起動し、測定のためにフローサイトメーターの設定を行います。生細胞および死細胞のコントロールサンプルを調製します。生細胞は、通常条件で同密度に培養し、カルシウムで染色します。死細胞は、10 µMの過酸化水素で1時間処理し、Ethereum homodimerで染色した後、同様の方法で回収します。装置の設定は、生細胞がカルシウム陽性かつEthereum homodimer陰性となるように調整してください。死細胞がカルシウム陰性かつEthereumホモダイマー陽性である一方で、これらの集団の割合はグラフ上のバーとして表現でき、これらの値を用いて統計解析を行うことができます。健康な幹細胞を添加することで、集団内の生存細胞の比率が高まることが分かりました。興味深いことに、損傷後に救済された細胞は、死細胞だけでなく、生存し続けていた細胞からもゲート分けして抽出できることが観察されました。本集団はさらなる調査に値すると考えられます。このビデオを視聴することで、標準化された方法で、in vitro幹細胞移植を用いた模擬虚血実験を実施する方法について十分な理解が得られたはずです。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。技術的なご質問がある場合は、お気軽にお問い合わせください。サポートさせていただきます。

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における幹細胞移植 in vitroで模擬虚血/再灌流モデル

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