スルー代謝経路の確認と発見 ^{13 C標識}

本プロトコルの目的は、炭素13を用いた代謝解析により細菌の代謝を研究することです。まず、標識炭素基質が存在する条件下で微生物を培養し、標識炭素を微生物タンパク質に取り込ませます。その後、微生物を回収し、アミノ酸の抽出、加水分解、および誘導体化を行います。

サンプルをガスクロマトグラフ質量分析計（GCMS）に導入します。生化学ネットワークにおける代謝物間の原子遷移経路を追跡することで、微生物が利用している機能的代謝経路を特定できます。私はバート・バーラです。

ここで提示する手法は、微生物の代謝経路を決定するためのトランスクリプトミクスおよびプロテオミクスの補完として利用できます。我々はこの技術を用いて、シアノバクテリアなどの光合成微生物におけるマイオトロフィックまたはヘテロトロフィックな炭素利用を調査してきました。本ビデオでは、標識炭素基質を用いて新しい酵素機能を探索する方法を示すため、モデル株としてANOTHE 5 1 1 42を使用します。

本手順の実演は、私、li Yu、およびChu Yang Fangが行います。まず、ラベルなし培地でcyana thesei細菌を培養します。細菌が対数増殖期の中期に達したら、これを体積比3%で炭素13標識培地に接種します。

次に、初期接種源の継代培養から由来する非標識炭素が、対数増殖期中期の同一の標識培地へ混入することを避けます。$^{13}\text{C}$標識したCy Thesei菌が対数増殖期中期に達したら、遠心分離により10 millilitersを回収します。ペレットを6 molar塩酸1.5 millilitersに再懸濁し、透明なガラス製のネジ蓋付きガスクロマトグラフィー（GC）バイアルに移します。

バイアルにキャップをし、100 °Cのオーブンに24時間置いて、バイオマス蛋白質をアミノ酸に加水分解します。バイオマスペレットの加水分解により、20種類の一般的なアミノ酸のうち16種類が得られます。加水分解後、アミノ酸溶液を2 mLマイクロ遠心チューブに移し、20,000 ×gで5分間遠心分離します。加水分解後、アミノ酸溶液を2 mLマイクロ遠心チューブに移し、20,000 ×gで5分間遠心分離して固形粒子を沈殿させます。

遠心分離後、加水分解液中の固体粒子がGCカラムに流入しないよう、上清を新しいGCバイアルに移します。次に、アミノ酸を誘導体化して、ガスクロマトグラフィーで分離可能な揮発性を持たせます。乾燥させたサンプルに、150 µLのテトラヒドロフラン（THF）と150 µLのN,O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミドを加えて溶解させます。

アセトアミドおよび T-B-D-M-S 誘導体化試薬を加え、すべてのサンプルを 65 から 80 °C のオーブンで1時間インキュベートします。バイアル内の代謝物が完全に溶解するように、時々ボルテックス mixes します。サンプルを 20,000 ×g で10分間遠心分離し、上清を新しい GC バイアルに移します。

上澄み液は透明な黄色色の溶液であるはずです。GC温度は次のように設定します。150 °Cで2分間保持します。その後、1分あたり3 °Cの速度で280 °Cまで昇温させます。

1分あたり20 °Cの速度で300 °Cまで昇温し、その後5分間保持します。次に、30 mのGCカラムを使用する場合、溶媒遅延時間を約5分に設定し、質量電荷比の範囲を60から500の間に設定します。分析はGCMSを用いて行い、スプリット比1:5または1:10、注入量1 µL、キャリアガスにヘリウムを1.2 mL/minの流量で使用してサンプルを分析します。

Microsoft Excelを用いてGCMSデータを分析します。各アミノ酸のGC保持時間と固有の質量電荷比ピークを図に示しています。T-B-D-M-S誘導体化アミノ酸は、通常、MSによって2つの荷電フラグメントに明確に分割されます。ロイシンおよびイソロイシンについては、アミノ酸全体を含むフラグメントM-57と、アミノ酸のα-カルボキシル基を欠くフラグメントM-159です。

M-57ピークは、他の質量ピーク断片と重複していました。N-15は、アミノ酸ラベリング全体の分析に使用できます。また、F 3 0 2グループはほとんどのアミノ酸で検出され、これはアミノ酸主鎖の最初のα-カルボキシル基と2番目の炭素のみを含んでいます。

しかし、このMs.Peakは多くの場合、信号対雑音比が高いため、代謝フラックスの定量分析にF 3 0 2を使用することは推奨されません。アミノ酸や中心代謝物の誘導体化により、carbon 13、oxygen 18、silicon 29、およびsilicon 30を含む、自然界に存在する大量の標識同位体が導入されます。未加工の質量同位体またはスペクトルにおける自然同位体由来の測定ノイズは、公開されているソフトウェアを用いて補正することが可能です。

最終的な同位体標識データは質量分率として報告されます。例えば、0から4個の13C標識炭素を含むフラグメントを表すM0、M1、M2、M3、およびM4が挙げられます。この5 1 1 2には、典型的なイソロイシン合成経路においてトレオニンから2-ケト酪酸への変換を触媒する酵素であるトレオニンアンモニアリアーゼは含まれていません。

したがって、この生物におけるイソロイシン経路を解明するため、Cyana Thesei 5 1 1 42を54 millimolarのグリセロールを含むASP two培地で培養し、本ビデオで説明するようにGCMSを用いて分析しました。ここで示されているように、Cyana Thesei 5 1 1 42は2位にラベルされたグリセロールを主要な炭素源として利用しており、ピルビン酸を前駆体とするトレオニンとアラニンには1つのラベル化された炭素が認められた一方で、イソロイシンには3つの炭素がラベル化されていることが観察されました。したがって、Cyana Thesei 5 1 1 42におけるイソロイシンの合成は、ほとんどの生物が採用しているトレオニン経路に由来するものではないと考えられます。一方で、ロイシンとイソロイシンは、フラグメントM-15およびフラグメントM-159に基づいた同一のラベル化パターンを示しました。

例えば、断片化されていないアミノ酸を含む$^{15}\text{N}$の同位体またはデータでは、ロイシンとイソロイシンの標識が同一であることが示されました。したがって、ロイシンとイソロイシンは同じ前駆体であるピルビン酸およびアセチルCoAから合成される必要があります。この観察結果は、イソロイシン合成におけるクエン酸・リンゴ酸経路での標識炭素の転移と一致しています。

この手法は、多種多様な微生物の代謝を調査するために使用でき、習得すれば、開始から完了まで約1週間で実施することが可能です。