mass squirmプロトコルは、同位体メチル化およびマルディ質量分析を使用してリジンデメチラーゼ活性を定量化することを目的としており、最初にメチル化リジンを含むペプチド上で酵素触媒による脱メチル化反応を行います。次に、残基は、重水素化ホルムアルデヒドとのデメチラーゼ反応のペプチド生成物を化学的にメチル化して、マルジによって同じようにイオン化する均一にメチル化されたペプチドを生成し、マルチから質量への分析で各ペプチド種を定量し、同位体の重複を説明します。un mono dye and trim methylated peptides の相対量を同定するために、mass squirm の結果は、質量の変化に基づいて各デメチラーゼ反応生成物の相対量を決定します。

この手法が、ルーチンのカビ付き質量分析などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、質量スコアが異なるメチル化ペプチド間のイオン化の違いを説明できることです。このアプローチのアイデアを最初に思いついたのは、同位体重無水酢酸を使用してヒストンのアセチル化レベルを測定する方法を開発したときでした。この手法の課題は、ピーク面積データの抽出であり、ペプチド同位体エンベロープのオーバーラップによって複雑になる可能性があります。

デメチラーゼ反応では、125ナノグラムの組換えリジン特異的デメチラーゼ1つの酵素と0.25マイクログラムのビオチン化ジメチルヒソンH 3ペプチドを、最終容量20マイクロリットルのデメチラーゼ緩衝液に組み合わせました。また、LSD1酵素を含まない0.25μgのペプチドを含むコントロールサンプルを調製し、反応チューブとコントロールチューブを摂氏37度で2時間インキュベートします。次に、Rを調製するために、2つの20ミクロンの多孔質ビーズを等量のビーズとメタノールを混合します。

次に、10容量のTFAギ酸を加え、各サンプルに8マイクロリットルの多孔質ビーズを加え、室温で15分間撹拌します。その間、2つのC 18ジップチップをコンディショニングします。0.1%TFAの20マイクロリットルで2回、70%アセトニトリル0.1%TFAで4回、0.1%TFAで再度4回ピペッティングします。

次に、2つのサンプルをコンディショニングされたジッパーチップにロードします。ピペッターで、ボリュームをC 18レジンに押し込みます。両方のサンプルの合計量がジッパーチップに押し込まれるまで繰り返します。

次に、40マイクロリットルの錯覚バッファーに0.1%TFA溶出サンプルを20マイクロリットルで2回洗浄し、スピード真空濃縮器で完全に乾燥させます。まず、サンプルを100マイクロリットルの50ミリモルリン酸緩衝液pH 7.4に再懸濁します。次に、8マイクロリットルのボアジメチルアミンと16マイクロリットルのディレートホルムアルデヒドを追加します。

摂氏4度で2時間インキュベートします。ボーリングジメチルラミンと重水素化ホルムアルデヒドを添加して還元的メチル化を繰り返し、2時間インキュベートします。3回目は、ボーリングジメチルラミンを加え、摂氏4度で15時間インキュベートします。

12.5マイクロリットルの1モルトリスで反応を急冷し、pH 7.4のスピード真空濃縮器で完全に乾燥させます。まず、コントロールおよびデメチラーゼ反応サンプルを100マイクロリットルの50ミリモルリン酸緩衝液pH 7.4に懸濁します。

次に、8マイクロリットルの多孔質ビーズをコントロールおよびデメチラーゼ反応サンプルに加え、前に示したようにジッパーチップに収集します。MALDIサンプルプレートに2マイクロリットルの容量で浸し、室温で乾燥させて結晶化させます。質量分析によるサンプルの分析に進みます。

spectroファイルを開いて作業ソフトウェアを作成し、M over Zソフトウェアにエクスポートします。タンデム質量分析により、反応生成物をさらに検証します。まず、コントロールサンプルのモノ同位体ピークに対する炭素 13 C 2 同位体と炭素 13 C 4 同位体のピーク面積比を決定します。

これらの計算された比率を使用して、各修飾に存在するペプチドの相対量を定量化します。デメチラーゼ反応サンプルの状態。LSD one酵素は、リジン脱メチル化の質量スクワーム定量に効果的に使用できます。

コントロール反応は還元的メチル化を受けないため、このペプチドの典型的な同位体エンベロープを示します結果として生じるピーク面積は、炭素13C2および炭素13C4に存在するペプチドのバックグラウンド比を決定します。同位体状態、コントロール反応の質量スペクトルからのピーク面積により、各修飾状態に存在するペプチドの相対量の定量が可能になります。デメチラーゼ反応では、これらのコントロール反応とデメチラーゼ反応のピーク面積により、33.7%ジメチルリジン4 4 42 0.3%モノメチルリジン4と24%非メチル化リジン4が決定されます。

このマススクアムアプローチは、ヒストンリジン残基の脱メチル化がさまざまな疾患にどのように寄与するかなど、ヒストンエピジェネティクスの分野に関する重要な洞察を提供します。このメチル化アッセイは、脱メチル化酵素の研究に適用されていますが、メチルトランスフェラーゼの研究にも使用できます。

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概要

本研究では、MALDI質量分析法と還元的なメチル化化学を用いて、リシン脱メチル化酵素の活性を定量する方法を提示します。この手法により、同位体標識を通じてリシンメチル化レベルの変化を測定することが可能になります。

研究の主要構成要素

科学分野

神経科学
生化学
質量分析法

背景

リシンメチル化は重要な翻訳後修飾である。
脱メチル化酵素の活性を理解することは、エピジェネティクス研究において重要である。
既存の手法では、メチル化ペプチドのイオン化効率の差を考慮できていない可能性がある。
本研究は、ヒストンアセチル化の測定に関する先行研究に基づいている。

研究目的

リシン脱メチル化酵素活性を定量化するための信頼性の高い方法を開発すること。
メチル化の変化を検出する際の質量分析の精度を向上させること。
生物学的システムにおけるリシンメチル化のダイナミクスに関する知見を提供すること。

使用した手法

メチル化リジンペプチドにおける酵素触媒による脱メチル化反応。
重水素化ホルムアルデヒドを用いた脱メチル化反応生成物の化学的メチル化。
定量を目的としたMALDI質量分析法の活用。
相対的なペプチド量を決定するための同位体オーバーラップ分析。

主な結果

非修飾およびメチル化ペプチド種の定量化に成功。
従来の質量分析法に対する本手法の優位性を実証。
ピーク面積データの抽出に関連する課題を特定。
比較分析によるアプローチの妥当性を検証。

結論

本手法は、リシンメチル化ダイナミクスを研究するための新しいアプローチを提供します。
これにより、生物学的コンテキストにおける脱メチル化酵素活性の理解が深まります。
今後の応用により、エピジェネティクスやプロテオミクスの様々な分野へと展開される可能性があります。

よくある質問

リシンメチル化とは何ですか？

リシンメチル化は、タンパク質の機能および遺伝子発現に影響を与える翻訳後修飾です。

MALDI質量分析の原理はどのようなものですか？

MALDI質量分析法は、レーザーを用いて試料をイオン化し、イオンの質量電荷比を分析します。

脱メチル化酵素とは何ですか？

脱メチル化酵素とは、タンパク質のリジン残基からメチル基を除去する酵素のことです。

なぜ同位体標識が用いられるのですか？

同位体標識により、質量分析において異なるメチル化状態を区別することが可能になります。

この手法にはどのような課題がありますか？

課題としては、同位体エンベロープの重複によりデータの抽出が困難になることが挙げられます。

この研究にはどのような意義があるのでしょうか？

この研究は、エピジェネティックな制御およびそれが細胞プロセスに与える影響について、より深い理解につながる可能性があります。

産業界への実用的意義

リシン脱メチル化酵素活性の定量的な測定は、エピジェネティックな標的のバリデーションおよび創薬におけるリード化合物の同定において極めて重要です。MassSQUIRM法は、アイソトピック標準化を通じてメチル化状態の直接比較を可能にすることで、既存のアッセイにおける主要な制限を解消し、エピジェネティック標的のメカニズム的なリスク低減における予測的な信頼性を向上させます。これにより、標的結合およびパスウェイ調節に関する再現性のある定量的なリードアウトが提供され、早期の創薬意思決定を支援します。

バイオ医薬品研究開発における戦略的応用

初期発見およびターゲットバリデーション

科学的価値： 定義されたペプチド基質における脱メチル化活性を定量化することで、治療仮説の検証を可能にする。
実用的価値： 非メチル化、モノメチル化、ジメチル化、およびトリメチル化されたリシン状態を比較するための標準化された方法を提供し、ターゲットバリデーションにおけるメカニズム的な曖昧さを軽減する。
予測的価値： ターゲットへの結合能やパスウェイ調節と相関する定量的な活性データを提供することで、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。

スクリーニングおよびアッセイ開発

アッセイの準備：還元的メチル化により一様にイオン化可能なペプチドを生成し、メチル化状態に関わらず信頼性の高いMALDI-MS定量を可能にします。
拡張性：プレート形式への適応が可能であり、脱メチル化酵素標的に対する化合物ライブラリーの中スループットスクリーニングに対応しています。
再現性：メチル化ペプチドのイオン化効率の差を補正し、実験間および施設間での一貫した定量出力を保証します。

トランスレーショナル・前臨床研究

翻訳上の連続性： ヒストンおよび非ヒストンタンパク質のコンテキストにおける脱メチル化活性を定量化することで、疾患に関連するシステムとの整合性をサポートします。
メカニズム的なリスク低減： 定量的なメチル化状態の解析を通じて、前臨床モデルにおける標的修飾の経時的な追跡を可能にします。
バイオマーカーの整合性： 標的結合研究において、メチル化の変化を潜在的な薬力学的バイオマーカーとして評価することを容易にします。

パイプラインおよびワークフローの統合

MassSQUIRM法は、定量的生化学アッセイによるターゲットバリデーションから、リード化合物の同定および前臨床評価までを、スケーラブルで再現性のある活性測定によってつなぐ、初期探索のコンティニュアムに適合する手法です。

基礎生物学： 合成ペプチド基質における酵素特異的な脱メチル化活性を定量化することで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
スクリーニング： リシン脱メチル化酵素を標的とした化合物スクリーニングキャンペーンにおいて、アッセイの標準化と定量的なリードアウトを可能にします。
分析： 修飾状態の直接比較を可能にする同位体ピーク面積比を提供し、ヒット化合物からリード化合物への最適化におけるデータ駆動型の意思決定を促進します。
トランスレーショナルリサーチ： 疾患に関連するペプチドおよびタンパク質基質における脱メチル化酵素活性の測定を可能にし、前臨床研究へと繋げます。
企業における再利用： 複数のプロジェクトや治療領域にわたるエピジェネティックな標的特性解析のための、再利用可能なプラットフォームを構築します。

運用および企業への影響

科学的価値： 脱メチラーゼ活性の定量的な評価、メチル化状態の比較におけるイオン化バイアスの低減、およびターゲットに対する信頼性の向上。
運用上の価値： ペプチドイオン化の標準化、MALDI-MSプラットフォーム間での再現性、および高スループット形式への拡張性。
戦略的価値： 定量的なターゲット変調データに基づく根拠あるgo/no-go判断が可能となり、エピジェネティックプログラムにおける生物学的リスクを低減。
ポートフォリオへの影響： 信頼性の高い活性プロファイリングとメカニズム的知見を通じて、リスク調整済みのエピジェネティックターゲットの優先順位付けを実現。

実施上の注意点

酵素学、ペプチド化学、およびMALDI質量分析データの解析における専門知識が必要です。
MALDI-MS装置、および同位体還元メチル化用試薬（重水素化ホルムアルデヒド、ボランジメチルアミン）へのアクセスに依存します。
ペプチド合成、酵素反応のセットアップ、およびチーム間での同位体標識の整合性を確保するための標準化されたプロトコルが必要です。
適応上の検討事項として、基質特異性およびヒストンH3以外の多様なペプチド配列との適合性が挙げられます。
実用的な制限として、同位体エンベロープの重複によるピーク面積のデコンボリューションの困難さがあり、慎重なスペクトル解析とソフトウェアツールが必要となります。

バイオファーマ FAQ

脱メチル化酵素アッセイにおいて、イオン化効率の差を考慮することがなぜ重要なのですか？

既存の質量分析アッセイでは、メチル化の状態が異なるペプチドが異なるイオン化挙動を示すかどうかが解決されておらず、メチル化状態の定量的な比較が信頼性に欠けていました。MassSQUIRMは、同位体還元メチル化を用いてすべてのリシンを均一な化学状態に変換することで、同等のイオン化を保証し、非メチル化、一メチル化、二メチル化、および三メチル化種の正確な定量を可能にします。

アイソトープ還元メチル化により、どのようにして脱メチル化酵素の定量測定が可能になるのでしょうか？

この手法では、重水素化ホルムアルデヒドを用いてアミノ基を化学的にメチル化し、すべてのリシンをジメチル化させます。これにより、リシンは水素と重水素以外の点では化学的に同一となり、MALDIイオン化への影響を排除できます。その結果、ピーク面積の変化から、基質に対する脱メチル化酵素の活性を直接的に反映させることが可能になります。

MassSQUIRMは、リジンメチル化状態でどのような定量的出力を提供しますか？

MassSQUIRMは、還元的メチル化の前後の同位体ピークのピーク面積比を測定することにより、未修飾、モノメチル化、およびジメチル化されたリシン残基の相対量を決定します。LSD1の例では、これにより、未メチル化が24%、モノメチル化が0.3%、ジメチル化リシンが33.7%という結果が得られました。

機能横断的なコラボレーションにおいて、MassSQUIRMに複製要件が重要であるのはなぜですか？

正確な定量には、ペプチド種間のアイソトピックオーバーラップ（同位体重複）の補正が必要であり、そのためには対照反応による一貫したピーク面積の測定とバックグラウンド比の決定が不可欠です。繰り返し測定を行うことで、実験間におけるアイソトピック補正因子の信頼性が確保され、探索、アッセイ開発、および前臨床チーム間での比較可能性が維持されます。

MassSQUIRMを導入する前に、どのような統計解析能力が必要ですか？

本手法の実施には、背景となる同位体エンベロープを定量化するため、モノアイソトピックピークに対する炭素13同位体のピーク面積比を決定できる能力が必要です。これらの比率を脱メチル化反応スペクトルに適用し、各メチル化状態における相対的なペプチド量を算出するため、質量分析データの処理および同位体デコンボリューションに関する習熟が求められます。