脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

本手順では、脾臓を通過する寄生虫のダイナミクスを評価するための定量的生体内顕微鏡アプローチについて説明します。齧歯類マラリアモデルにおいて、GFP転移遺伝子寄生虫に感染させたマウスを準備し、脾静脈へのカニューレ挿入により生体内染料の注入を可能にして、脾臓の生体内顕微鏡観察を行います。実験中、脾臓のさまざまな領域を移動する蛍光細胞をイメージングします。

赤脾髄の三次元的な低速コンパートメントにおける寄生虫の移動性を記述し、血管血流を算出するための理論体系を提示します。これらのパラメータを用いて、2つのPULE系統における脾臓のダイナミクスを比較しました。皆様、こんにちは。

私の名前はNando El Portilloです。私の研究室における主要な研究課題の一つは、マラリアにおける脾臓の役割を解明することです。脾腫はこの疾患の顕著な特徴の一つですが、技術的および倫理的な問題があるため、この臓器の研究に取り組むことは非常に困難です。そこで私たちは、寄生虫の動的な通過を観察し、この現象を定量化することを可能にする技術を導入しました。

これらが、LorenaとMIが本プロトコルで説明する内容です。本研究は、ドイツのハンブルク大学のDr.Lerのグループおよび、ここHospital ClinicのDr.Maria Kboのグループとの共同研究として一部実施されており、found fion Cellexおよびministerial CIA In Espanolからの一般助成を受けています。感染は、致死性または非致死性のGFP寄生虫を10% parasiteで導入したドナーMから開始します。寄生虫を確認するには、マウスの尾静脈から少量の血液を採取し、顕微鏡スライド上で展延させます。

GIMsを用いた染色により、スライド上で染色を行います。乾燥後、感染した赤血球を可視化できるようになります。血液塗抹標本をメタノールで2分間固定し、GIMs溶液を塗布して20分間インキュベートします。スライドを水道水で洗浄し、乾燥させます。100倍の油浸対物レンズを備えた光学顕微鏡を用いて、全赤血球に対するpbcsの割合を算出します。

ドナーマウスの尾血から採取しPBSで希釈した致死性または非致死性の寄生虫をマウスに感染させます。感染後3日目に末梢血寄生率1%に達するように、1匹あたり50万個の寄生虫を投与量として調整し、腹腔内注射します。あるいは、コントロールとしてFITC標識赤血球を使用することも可能です。

マウスから1 mLの動脈血を採取し、EDTAを含むPBSで遠心分離してペレットを洗浄し、FITC溶液で再懸濁させ、穏やかな撹拌を行いながら暗所で2時間インキュベートします。その後、遠心分離によって上清を除去し、十分に洗浄します。末梢血中濃度が平均1%になるようにコントロールマウスに注射し、in vivo実験に進みます。

こんにちは、mijaです。脾臓を生体内でイメージングするためには、動物に小さな外科的手術を施して脾臓を露出させる必要があります。この手法は、Worker Heislerの研究室のStephanie GRから学びました。彼女に感謝するとともに、ここからはその具体的な手順について説明します。

感染マウスのイメージングは、両系統においてパラサイト率が1%となる感染後3日目に実施しました。手順の間、マウスは麻酔状態を維持し、温度管理を行ってください。眼を乾燥から保護し、物質の静脈内投与を円滑に行うため、開始前に足底を刺激してマウスが完全に麻酔状態にあることを確認してください。

実験の過程で、マウスの尾静脈にカニューレを留置し、カニューレを構築します。チューブの一端に小さな針を挿入し、もう一端にアプリケーターを装着します。カニューレに生理食塩水を充填して気泡を取り除き、溶液がカニューレ内を正しく流れることを確認してください。

尾の側静脈を清潔にカニュレーションします。尾の基部を軽く圧迫して、静脈の視認性を高めてください。カニューレの先端を静脈内に挿入します。

血液が現れたことで、針が適切に配置されたことがわかります。適切でない場合は、静脈の上流でカニュレーションをやり直し、その後、接着剤とテープを用いてカニューレを尾に固定します。動物の左背側の皮膚と筋肉を小さく切開し、脾臓の下部を露出させます。

呼吸による動きが少ない場所に脾臓を配置し、マウスの毛を取り除いて清潔に保ち、また脱水を防ぐために、露出した表面にPBSを塗布します。可視化できるように、カバースリーブで脾臓を密封します。こんにちは、Lorenaです。

本プロトコルでは、GFP導入遺伝子組み換え寄生虫を用いることで、脾臓内におけるPULI寄生虫の移動を可視化します。なお、本寄生虫はドレクセル大学のJames Burnes氏より分譲されたものです。

蛍光標識した寄生虫の移動をイメージングすることで、致死性株と非致死性株の間で行動に違いがあるかを確認できます。生体顕微鏡実験は、温度制御機能付きインキュベーションシステムと63xグリセロール浸漬対物レンズを備えたLeicaマルチフォト顕微鏡を用いて実施しました。動物を顕微鏡のステージ上に配置し、カバーガラスで押さえ、脾臓を対物レンズ側に向けて設置します。

低倍率で脾臓を可視化することで、この器官の微小循環構造の全体像を把握することができます。自家蛍光組織を用いて脾臓に焦点を合わせると、GFP陽性寄生虫が脾臓の異なる領域を通過する様子が観察されます。こんにちは、バルセロナ大学科学技術センターのMaria Alboです。今回は脾臓の生体イメージングを行います。

感染した赤血球の血流と可動性を研究するため、臓器の動きを回避するのに非常に有用な高速イメージングが可能な、共焦点共鳴スキャン顕微鏡を使用します。これは、視野範囲を選択できるスペクトル顕微鏡です。超高速でイメージングを行うため、2つのフルオレセイン標識と反射光の同時取得を行います。

RBC、反射、コントラスト、およびVidal染料を用いて異なる領域を選択し、脾臓の微小血管系を可視化します。次に、Vidal顕微鏡とImage Jソフトウェアを使用して、赤脾髄の三次元的な網状構造における寄生虫の移動を追跡し、血管血流中の寄生虫の運動性を測定する方法について説明します。高速スキャンモードを用いて、5つのZ深度で画像を撮影してください。

単一の蛍光細胞の追跡を容易にするため、イメージスタックをZコード化されたカラー動画に変換します。詳細な情報はテキストに記載されており、X、Y、ZおよびT座標を用いて、各ビデオの深度におけるさまざまな粒子の経時的な追跡を行います。方向性、平均速度、滞留時間などの移動パラメータを算出し、分布図として表示することで、菌株集団間の比較解析が可能になります。脾臓における血管流は、デキストリンなど、サポートテーブルに記載されているいくつかの蛍光分子を全身投与することでイメージングできます。

次に、内因性赤血球の反射コントラストを用いて、血管をレーザースキャンの方向と水平に配置し、強化ライン平均（enhanced Line average）を適用して中心線の血流をスキャンします。これらの画像において、移動する細胞から生じるストリークを利用して血流を算出します。変動を補正するため、異なる直径の血管および心周期全体にわたって画像を撮影します。脾臓は長らくマラリア研究におけるブラックボックスと考えられてきましたが、本研究では、この臓器における寄生虫感染と血流のダイナミクスに関する知見を得るために、定量的な生体顕微鏡アプローチを開発しました。これにより、感染赤血球の脾臓へのin vivoでの接着といった、重要な生物学的課題への取り組みが可能になります。

ありがとうございました。