Name: 脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流の定量的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: 学ぶ脾臓の生体顕微鏡検査法。マラリア原虫の動態と血流をGFPトランスジェニック寄生虫を用いて定量的に解析し、赤脾髄における寄生虫の移動性と血管血流を測定する手法を解説します。

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私たちはA.ボッシュ（コンフォーカルユニット、CCIT - UB、IDIBAPS）に、GFPトランスジェニック原虫の寄付のためにJ.バーンズに、マラリア原虫の生体顕微鏡で初期訓練と継続的な入力のためのS. GraeweとV. Heusslerに特に感謝しています画像解析と技術支援のための定量化とP. Astolaへの支援のための。我々は、R.のトウスとビデオ制作のためのI.のCaraltに感謝。 MFは、カタルーニャの一般性から大学院生フェローシップの受賞者です。 HAPはICREAの研究教授である。 HAPの実験室での作業は、民間財団セレックス（カタルーニャ、スペイン）により、科学とイノベーションのスペイン省が、補助金協定Nの下で欧州共同体のセブンス枠組み計画（FP7/2007-2013）° 242095によって資金を供給される（ SAF2009 - 07760）。

<ol><li>Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+malaria+parasites--recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of malaria parasites--recent advances and future directions.</a> Curr. Opin. Microbiol. 8, 407-414 (2005).</li>
<li>Heussler, V., Doerig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+enters+parasitology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging enters parasitology.</a> Trends. Parasitol. 22, 192-195 (2006).</li>
<li>Amino, R., Thiberge, S., Blazquez, S., Baldacci, P., Renaud, O., Shorte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+malaria+sporozoites%5BTitle%5D)+AND+%22in+the+dermis+of+the+mammalian%22%5BJournal%5D)">Imaging malaria sporozoites.</a> in the dermis of the mammalian. 2, 1705-1712 (2007).</li>
<li>Gueirard, P., Tavares, J., Thiberge, S., Bernex, F., Ishino, T., Milon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+malaria+parasite+in+the+skin+of+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Development of the malaria parasite in the skin of the mammalian host.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 18640-18645 (2010).</li>
<li>Sturm, A., Amino, R., van de Sand, C., Regen, T., Retzlaff, S., Rennenberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+host+hepatocytes+by+the+malaria+parasite+for+delivery+into+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Manipulation of host hepatocytes by the malaria parasite for delivery into liver sinusoids.</a> Science. 313, 1287-1290 (2006).</li>
<li>Gruring, C., Heiber, A., Kruse, F., Ungefehr, J., Gilberger, T. W., Spielmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+host+cell+modifications+of+Plasmodium+falciparum+blood+stages+in+four+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Development and host cell modifications of Plasmodium falciparum blood stages in four dimensions.</a> Nat. Commun. 2, 165-165 (2011).</li>
<li>Martin-Jaular, L., Ferrer, M., Calvo, M., Rosanas-Urgell, A., Kalko, S., Graewe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-specific+spleen+remodelling+in+Plasmodium+yoelii+infections+in+Balb%2Fc+mice+facilitates+adherence+and+spleen+macrophage-clearance+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strain-specific spleen remodelling in Plasmodium yoelii infections in Balb/c mice facilitates adherence and spleen macrophage-clearance escape.</a> Cell. Microbiol. 13, 109-122 (2011).</li>
<li>Linden, M. vander, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Plasmodium+berghei+reference+line+that+constitutively+expresses+GFP+at+a+high+level+throughout+the+complete+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">A Plasmodium berghei reference line that constitutively expresses GFP at a high level throughout the complete life cycle.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 137, 23-33 (2004).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein.</a> 173, 33-38 (1996).</li>
<li>Dunn, K. W., Sandoval, R. M., Kelly, K. J., Dagher, P. C., Tanner, G. A., Atkinson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+studies+of+the+kidney+of+living+animals+using+multicolor+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional studies of the kidney of living animals using multicolor two-photon microscopy.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 283, C905-C916 (2002).</li>
<li>Zhong, Z., Petrig, B. L., Qi, X., Burns, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+erythrocyte+velocity+and+retinal+blood+flow+using+adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of erythrocyte velocity and retinal blood flow using adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Opt. Express. 16, 12746-12756 (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Bowdler, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBowdler%2C+AJ+%22The+complete+spleen%22">The complete spleen</a>. , Totowa. Humana Press. (2002).</li>
<li>Grayson, M. H., Hotchkiss, R. S., Karl, I. E., Holtzman, M. J., Chaplin, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+comparing+T+lymphocyte+trafficking+to+the+spleen+and+the+mesenteric+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart.+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy comparing T lymphocyte trafficking to the spleen and the mesenteric lymph node.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 284, H2213-H2226 (2003).</li>
<li>Khandoga, A. G., Khandoga, A., Reichel, C. A., Bihari, P., Rehberg, M., Krombach, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+quantitative+analysis+of+leukocyte+directional+migration+and+polarization+in+inflamed+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and quantitative analysis of leukocyte directional migration and polarization in inflamed tissue.</a> PLoS. One. 4, 4693-4693 (2009).</li>
<li>Weiss, L., Geduldig, U., Weidanz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+splenic+control+of+murine+malaria%3A+reticular+cell+activation+and+the+development+of+a+blood-spleen+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of splenic control of murine malaria: reticular cell activation and the development of a blood-spleen barrier.</a> Am. J. Anat. 176, 251-285 (1986).</li>
<li>Swirski, F. K., Nahrendorf, M., Etzrodt, M., Wildgruber, M., Cortez-Retamozo, V., Panizzi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li>
<li>Grayson, M. H., Chaplin, D. D., Karl, I. E., Hotchkiss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+fluorescent+intravital+microscopy+of+the+murine+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Confocal fluorescent intravital microscopy of the murine spleen.</a> J. Immunol. Methods. 256, 55-63 (2001).</li>
<li>Bajenoff, M., Glaichenhaus, N., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblastic+reticular+cells+guide+T+lymphocyte+entry+into+and+migration+within+the+splenic+T+cell+zone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone.</a> J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されません。

このげっ歯類のマラリアモデルにおける脾臓の生体顕微鏡検査の実装は、これまで技術的な考慮事項に&quot;ブラックボックス&quot;が原因と考えられているこの器官を通じて寄生虫の動的な経過を調査の可能性を開いた。ここでは、主要な努力は、単一および人口のレベルで異なる寄生虫の行の比較分析を可能にする定量的手法を適応する置かれた。マラリア3,5の前にイメージングされていた他の組織や細胞とは対照的に、イメージング脾臓を通じてpRBCsの通過が考慮臓器の三次元性と区分を取る必要がある、高速および低速の異なる循環の存在フラックス13と同様に急速な赤血球速度。この目的で、オンラインで利用可能なImageJのソフトウェアを使用して、特定の方法論はpopulatioで線間の単一の寄生虫のトラッキング、モビリティの分析と比較を可能にするために開発されたn個のレベル。しかし、このコンテキストで単一の寄生虫の同定と追跡を解決する自動ソフトウェアのアプリケーションはまだ必要です。注目すべきは、寄生虫のモビリティを記述するために使用されるパラメータは、以前はリンパ球動員およびin vivoで <sup...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ライカTCS - SP5共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ、ハイデルベルク、ドイツ</td><td> TCS - SP5シリアル番号。 5100000419 </td><td></td></tr><tr><td>ケタミン（Ketolar 50 mg / ml）を</td><td>ファイザー</td><td> 631028 </td><td></td></tr><tr><td>ミダゾラムの15 mg / 3ミリリットル</td><td> Normon </td><td> 838193 </td><td></td></tr><tr><td>テキサスレッドコンジュゲートさ7万MWデキストラン、 </td><td>分子プローブ</td><td> D1830 </td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート、異性体I（FITC） </td><td>シグマ</td><td> F7250 </td><td></td></tr><tr><td>ヘキスト33342 </td><td>シグマ</td><td> H1399 </td><td></td></tr><tr><td>ギムザ染色</td><td>シグマ</td><td> GS1 </td><td>ワーキングソリューションは、蒸留水で10％です。 </td></tr><tr><td>スーパー接着剤- 3ロックタイト</td><td>ロックタイト</td><td> 9975-0880 </td><td></td></tr></tbody></table>

脾臓の生体顕微鏡検査：寄生虫モビリティと血流​​の定量的解析

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

実験的なげっ歯類のマラリアモデルにおける生体顕微鏡の出現は、寄生虫-宿主相互作用の1,2の知見に大きな進歩を可能にした。このように、前赤血球段階でマラリア原虫のin vivoイメージングで皮膚のリンパ節3、皮膚の4の寄生虫の完全な開発、および移行を確保するために、肝細胞由来のmerosomeの形成に寄生虫のアクティブな入り口を明らかにしたと血流5にメロゾイト放出。また、赤血球内の個々の寄生虫の開発は、最近の4Dイメージングを使用して文書化し、マラリア6のタンパク質輸送上の私たちの現在のビューに挑戦されています。従って、生体内イメージングは根本的にマラリア原虫の開発における重要なイベントに関する我々の見解を変更しました。残念なことに、脾臓、主要なリンパ器官を通じて、マラリア原虫のダイナミックなパッセージの研究は、絶妙に感染した赤のBをクリアするように適応lood細胞は、技術的な制約のために不足している。 Balb / cマウスにおけるマラリア原虫yoeliiのマウスモデルを用いて、我々は、脾臓の生体内イメージングを実施し、中に赤い果肉の繊維芽細胞由来の障壁の細胞にそれと寄生された赤血球の付着（pRBCs）の差動リモデリングを報告している非致死的な寄生虫ラインP.yoelii 17倍の感染は、P.yoelii 17XL致死寄生虫の7行目で感染することに反対した。これらの結論に到達するには、ImageJのフリーソフトを使用して、特定の方法論は、シングルpRBCsの高速三次元運動の特性評価を可能にするために開発されました。このプロトコルを用いて得られた結果は、脾臓の寄生虫の速度、方向性と滞留時間を決定する生体内での遵守に取り組むすべてのパラメータを許可する。さらに、我々は、血流の生体顕微鏡を用いて定量化し、差を使用するための方法論を報告する脾臓の複雑な微小構造への洞察を得るためにferent着色剤。 倫理の文 すべての動物実験は、バルセロナCEEA - UB（：5429プロトコルなしDMAH）の大学の動物実験のために倫理委員会で承認されたガイドラインとプロトコルに準拠して、バルセロナ大学の動物施設で実施した。年齢の6-8週の雌BALB / cマウスはチャールズリバー研究所から入手した。

我々は、GFPトランスジェニックマラリア原虫を用いて脾臓の生体顕微鏡検査を実施するための方法およびこの器官内の寄生虫のモビリティと血流​​の定量化を示す。

実験的なげっ歯類マラリアモデルにおける生体内イメージング（イントラバイタル顕微鏡法）の登場により、寄生虫と宿主の相互作用に関する知見が大きく進展した 1,2。

本手順では、脾臓を通過する寄生虫のダイナミクスを評価するための定量的生体内顕微鏡アプローチについて解説します。げっ歯類マラリアモデルにおいて、GFP導入トランスジェニック寄生虫に感染させたマウスを準備し、脾臓の生体内顕微鏡観察を行います。脾静脈へのカニュレーションにより、生体内染色の注入が可能になります。実験中、脾臓のさまざまな領域を移動する蛍光細胞をイメージングします。赤脾髄の三次元的な緩徐区画における寄生虫の移動性を記述する理論モデルを提供し、血管の血流を算出します。これらのパラメータを用いて、2つのPULE系統における脾臓のダイナミクスを比較しました。皆さん、こんにちは。私の名前はNando El Portilloです。私の研究室における主要な研究課題の一つは、マラリアにおける脾臓の役割を解明することです。脾腫はこの疾患の顕著な特徴の一つですが、技術的および倫理的な問題があるため、この器官の研究に取り組むことは非常に困難です。そこで私たちは、寄生虫の動的な通過を観察し、この現象を定量化することを可能にする技術を導入しました。これがLorenaとMIがこれらのプロトコルで説明する内容です。この研究は、ドイツのハンブルク大学のDr.LerのグループおよびここHospital ClinicのDr.Maria Kboのグループとの共同研究として一部実施されており、found fion Cellexおよびministerial CIAからの一般助成を受けています。感染は、致死性または非致死性のGFP寄生虫を10%の寄生率でドナーMに感染させることで開始します。寄生虫を確認するには、マウスの尾静脈から少量の血液を採取し、顕微鏡標本として展延させます。GIMsを用いた染色用スライドを作成します。溶液を用いることで、乾燥後に感染した赤血球を可視化できます。血液塗抹標本をMethanolで2分間固定し、GIMs溶液を滴下して20分間インキュベートします。スライドを水道水で洗浄して乾燥させ、100倍油浸対物レンズを備えた光学顕微鏡を用いて、全赤血球に対する感染赤血球（pbcs）の割合を算出します。ドナーマウスの尾静脈血から得た致死性または非致死性の寄生虫をPBSで希釈し、マウスに感染させます。感染後3日目に末梢血寄生率が1%に達するように、マウス1匹あたり50万個の寄生虫を腹腔内に注入して投与量を調整します。あるいは、コントロールとしてFITC標識赤血球を使用することも可能です。マウスから1 mLの動脈血を採取し、EDTA含有PBSで遠心分離してペレットを洗浄する。その後、FITC溶液で再懸濁し、穏やかに攪拌しながら暗所で2時間インキュベートする。その後、遠心分離によって上清を除去し、十分に洗浄する。これをコントロールマウスに注入して末梢血中の平均濃度を1%にし、in v

intravital-microscopy-spleen-quantitative-analysis-parasite-mobility

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免疫学と感染症

ライブホストのトランスジェニックリーシュマニア原虫のin vivoイメージング

軟膜微小循環の時間的空間的血行動態および炎症性イベントに追従するように生体顕微鏡。...

クローズ頭蓋窓を使用してマウス脳の微小循環の生体顕微鏡

このビデオは、骨髄由来マクロファージ(BMM)の寄生虫の細胞内増殖を定量化するアッセイを示しています。マクロファージ細胞は、リーシュマニアの運動性侵襲期と非運動性の浸潤期にそれぞれ感染し、メタサイクリック前胸茎と無形成性に浸潤します。寄生虫はマクロファージに侵入し、寄生虫の液胞に内在化され、内部で増殖します。細胞内寄生虫の増殖は、マクロファージと寄生虫核を蛍光染色した上で顕微鏡を用いて定量化されます。...

マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

の脳血管から付着炎症性白血球を単離するための方法...

脳から隔離された白血球の単離と解析<em&gt;マラリアベルゲイ</em&gt; ANKA感染マウス

この記事では、画像取得と分析のための特定の方法論と組み合わせて、生体内顕微鏡イメージングを使用して、マウスの肝臓血管系の個々の血管内の血流速度の動的測定と定量化の詳細な方法について報告します。...

以下の肝臓の生体顕微鏡イメージング<em&gt;リーシュマニア</em&gt;感染症：肝血行動態の評価

マラリア原虫が侵入し、赤血球内で複製する。メロゾイトの侵入および寄生虫の正確な評価は、マラリア感染の経過を評価するので、非常に重要です。ここでは、マラリアのマウスモデルにおいて、これらのパラメータを測定するためのフローサイトメトリーベースのプロトコルを説明する。...

フローサイトメトリーによるげっ歯類マラリア原虫のin vivo評価とメロゾイト侵略で

この簡略化されたマウスの腸間膜静脈の生体内顕微鏡検査は、白血球-内皮および血小板-白血球の相互作用を観察するためのさまざまな炎症モデルで使用できます。...

マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用

私たちは、実験的な脳マラリアのマウスモデルを記述し、磁気共鳴画像法を用いて生体内で炎症性および微小血管の病理をどのように追跡できるかを示します。...

磁気共鳴映像法を用いた実験的大脳マラリアモデルにおける浮腫発生と微小血管病変のin vivo追跡

ヒトマラリア寄生虫に対するげっ歯類マラリア寄生虫のライフサイクルと生物学の顕著な類似性により、げっ歯類マラリアモデルはマラリア研究に欠かせないものとなっています。ここでは、野生型およびトランスジェニックげっ歯類マラリア種の表現型分析に用いられる最も重要な技術のいくつかを標準化した。...

げっ歯類マラリア寄生虫の現象分析無性および性的血液段階と蚊の段階

すべての病原性リーシュ マニア原虫種に存在し、脊椎動物のホストのマクロファージ内で複製。ここでは、リーシュ マニア、続いて細胞増殖動態の正確な定量培養マウス骨髄由来マクロファージに感染するプロトコルを提案する.このメソッドは、リーシュ マニアの病原性と宿主-病原体相互作用に影響を与える個々...

細胞内マクロファージの内部成長の定量化は高速とリーシュ マニア原虫の病原性を評価するための信頼性の高い方法です。

学ぶ脾臓の生体顕微鏡検査法。マラリア原虫の動態と血流をGFPトランスジェニック寄生虫を用いて定量的に解析し、赤脾髄における寄生虫の移動性と血管血流を測定する手法を解説します。

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