幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築

このプロトコルは、キトサンマイクロスフェアから幹細胞をコラーゲンゲル足場に送達し、収穫し、培養するためのin vitro戦略を提供します。次に、初代脂肪細胞幹細胞が乳化してキトサンマイクロスフェアの調製物を回収します。次に、幹細胞をキトサンマイクロスフェアに播種し、8ミクロンの細孔サイズの膜培養プレートインサートで培養してCSを充填したCSMを生成し、最後にマイクロスフェアデリバリーシステムを3次元コラーゲンゲルスキャフォールドと混合します。

最終的に、このCSMシステムは、再生医療や薬物送達に利用できる可能性を提供します。この手法は、細胞注入やマイクロカプセル化などの既存の方法と比較した場合の主な利点として、細胞がキャリア材料に付着し、初期適用後も持続する能力があります。一般に、この方法に不慣れな個人は、esan マイクロスフェアが固有の静電荷を持っているため、苦労します。

また、マイクロスフェアベッド上に細胞をロードすることは、細胞を邪魔することなく行うことが難しくなります。ラップから会陰脂肪組織と表皮脂肪組織を切除して洗浄し、組織をミンチにし、1〜2グラムを1%FBSを含む25ミリリットルのHBSSに移します。遠心分離後、浮遊脂肪組織層を125ミリリットルの三角フラスコに集めます。

25ミリリットルのコラゲナーゼ2型を加え、オービタルシェーカーで反応をインキュベートします。次に、油層と脂肪層の下の液体画分を慎重に取り除き、170ミクロンのナイロンメッシュフィルターで順番にろ過します。25ミリリットルで2回洗浄した後、遠心分離により細胞を回収します。

HBSS Resusは、30ミリリットルのサプリメントを添加したmesen pro成長培地にペレットを懸濁します。精製した脂肪由来幹細胞を2つのT 75培養フラスコに分割し、5%二酸化炭素加湿インキュベーターで37°CのA SC調製物を増幅します。このCSMプロトコルは、イオン性コア技術を利用した油中水乳化プロセスです。

安定な水と油のエマルジョンに、100ミリリットルの油相混合物に6ミリリットルのキトサン水溶液を、オーバーヘッドと磁気攪拌を同時に反対方向に1時間かけて乳化し、1.5ミリリットルの1%水酸化カリウムをnオクタルに15分ごとに4時間加えます。イオン性架橋反応の終了後、油相をゆっくりとデカントし、すぐに球体を100ミリリットルのアセトンに加えます。油相が完全に除去されるまで、球体をアセトンで洗います。

次に、回収した球体を真空中で乾燥させます。乾燥剤は、粒度アナライザーを使用して、ミリグラムあたりの平均CSM粒子サイズ表面積と単位立方体体積を決定します。CSMを滅菌水で3回洗浄し、残留塩分を除去します。

次に、50ミリリットルのガラス管内で細胞実験に使用するためにCSM調製物を無水アルコールで滅菌し、5ミリグラムのマイクロスフェアを1ミリリットルの0.5%TNBS溶液と混合し、摂氏40度で4時間インキュベートします。次に、6つの正常塩酸を3ミリリットル加え、摂氏60度で2時間インキュベートします。サンプルを室温に冷却した後、5ミリリットルの脱イオン水と10ミリリットルのエセルエーテルを加えます。

遊離TNBSを抽出するには、水相の5ミリリットルのアリコートを取り出し、水浴で摂氏40度まで15分間温め、周囲温度まで冷却した後、残留エーテルを蒸発させます。分光光度計で15ミリリットルの水で希釈します。TNBSをブランクとして使用して、調製したキトサン微小球の吸光度を345ナノメートルで測定します。

また、CSM調製に用いるキトサンも測定します。次に、キトサンのアミノ基の総数に対するCSMの遊離アミノ基の数を計算します。滅菌したCSMの5ミリグラムを滅菌HBSSで一晩平衡化します。

CSMを24ウェル培養プレート用の8ミクロンメンブレンインサートに移します。CSMが落ち着いたら、HBSSを慎重に吸引します。次に、インサートの内側に300マイクロリットルの成長培地を追加し、インサートの外側に700マイクロリットルの成長培地を追加します。レザス。

脂肪由来幹細胞を200マイクロリットルの成長、培地、およびシードに培養プレート内のCSM上に懸濁します。5%二酸化炭素加湿インキュベーターに37°Cで24時間インキュベートします。SCを装填したCSMを、インサートメンブレンに転移した細胞を乱さずに滅菌マイクロ遠心チューブに移します。

次に、残留培地を取り出し、各チューブに250マイクロリットルの新鮮な成長培地を追加します。MTT溶液1ミリリットルあたり5ミリグラムの25マイクロリットルを加え、4時間インキュベートします。媒体を取り出し、250マイクロリットルのジメチルスルフオキシドボルテックスを加えて、2,700GのCSMを5分間のアサンコンプレックス遠心分離機に溶化します。

630ナノメートルを基準として、570ナノメートルで上清吸光度を測定します。生存可能なA SCの既知の数から得られた吸光度値に対するCSMに関連付けられた細胞数の決定に進む。SCを充填したCSMを5ミリグラムと7.5ミリグラム/ミリリットルを混合します。ラットから抽出した1種類のコラーゲン。

尾腱、2つの正常水酸化ナトリウムを使用してpHを6.8に調整し、培養プレートに注ぎます。フィブリル化するために挿入し、12ウェルプレートに移し、30分間インキュベートします。インキュベーション期間中は、コラーゲンA-S-C-C-S-Mゲルの培地を1日おきにリフレッシュし続けます。

また、標準的な顕微鏡技術を使用して、CSMからゲルへの細胞の放出、および移動をモニターします。以下の例では、キトサン微小球から脂肪由来幹細胞をコラーゲンゲル足場に送達するin vitro戦略について説明します。SEMおよびTEM画像は、均一なサイズの多孔質CSMの調製を示しています。

初代脂肪由来幹細胞とのミクロスフェアのインキュベーションは、CSMカルシウムamのミリグラムあたり4, 000細胞を示しています。SCの染色は、フィロポディアをミクロスフェアの多孔質の隙間に伸ばしてCSM上に広がることを示しています。細胞をロードしたCSMをコラーゲンゲルと混合すると、細胞はゲル内に移動し、経時的に追跡することができます。

この技術の意味は、大規模で慢性的な組織喪失の治療にすぐに広がります。しかし、この治療レジメンは、さまざまなレベルの軟部組織や心臓組織の損失を治療するために使用されるさまざまな細胞や生体材料と統合できる汎用性があるため、はるかに多くの可能性を秘めています。この方法が宿主細胞の送達に関する洞察を提供できるかどうかは疑問です。

また、注射剤、治療薬の送達、細胞と治療薬の両方を一緒に送達するハイブリッドシステムの開発など、他のシステムにも適用できます。