Name: 幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶ キトサンミクロスフェアを用いた脂肪由来幹細胞のコラーゲンハイドロゲルへの効率的な送達法。多能性を維持しながら細胞を担体に付着させ、再生医療や薬物送達への応用可能性を示す革新的な手法です。

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DOZは、ジュネーブ財団から授与の助成金によってサポートされています。 SNは、ピッツバーグ·ティッシュエンジニアリング·イニシアティブからポストドクトラルフェローシップ·グラントによってサポートされていました。

1。の単離脂肪由来幹細胞（ASC） 注：特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。 <ol><li>ラット腎周囲および副睾丸脂肪を分離し、前述の6、1％ウシ胎児血清（FBS）を含有する滅菌ハンクス緩衝塩溶液（HBSS）で洗浄する。 </li><li>組織をミンチし、室温で8分間500グラムで50 mLのチューブと遠心分離機に1％FBSを含むHBSS 25 mLに1〜2グラムを転送します。 </li><li>浮遊脂肪組織の層と125 mLの三角フラスコへの転送を収集し、37℃で45分間HBSSでコラゲナーゼII型（200 U / mL）を25 mLで扱う°オービタルシェーカー（125 rpm）でのC。 </li><li>慎重に液体画分（油と脂肪層の下）を削除し、100μmと70μmのナイロンメッシュフィルターを順次フィルタリングします。室温で10分間500gで濾液を遠心し、supernatanを吸引tと25 mLのHBSSでペレットを2回洗浄する。 </li><li> MesenPRO RS成長サプリメントを添加した増殖培地50 mLの細胞ペレット（MesenPRO RS基礎培地）、抗生物質抗真菌剤（ペニシリンG、100μg/ mLの硫酸ストレプトマイシン、および0.25μg/ mLのアムホテリシンBの100 U / mL）を懸濁し、2 mM L-グルタミンとピペットセル2 T75フラスコ（25 / mLのフラスコ）に変換します。 </li><li>文化37°C（ASCは、すべての実験に使用されているパッセージ2-4）で5％CO 2の加湿インキュベーター中でASC。 </li></ol> 2。キトサンマイクロスフェア（CSM）を準備 注：特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。 <ol><li> CSMは、当社の以前のプロトコル6を使用してイオンコアセルベーション技術とともに油中水型乳化プロセスによって調製される。大豆から成る油相混合液100 mLにキトサンの水溶液（0.5 M酢酸の3％（w / v）のキトサンの6 mL）を乳化油、n-オクタノール（1:2 v / v）で、5％ソルビタンモノオレエート（スパン80）、乳化剤、反対方向に、オーバーヘッド（1700 rpm）と同時に磁気攪拌（1000回転）を使用します。初期の架橋が発生する前に上に形成されたミセル溶液中に残っていると底に沈殿することはできませんミ​​キシングを保証し、この二重の方法。さらに、デ集約ミセル形成とrigidization中にキトサンをで磁気攪拌棒を支援します。 </li><li>混合物を連続的に安定した油中水型エマルションが得られるまで約1時間撹拌する。イオン架橋は4時間（24 mLの合計）のn-オクタノール15分毎に1％（w / v）の水酸化カリウムを1.5 mLの添加で開始されます。 </li><li>架橋反応の完了後、徐々に混合物を含むCSMの油相をデカントし、直ちにアセトン100mLに球を追加します。油相が完全に除去されるまで、アセトンで球を洗浄します。 </li><li>真空デシケーターと肛門に回復した球体を乾燥させさらなる処理なしyze。平均CSMの粒径、ミリグラム当たりの表面積と単位体積は、粒子サイズアナライザーを用いて決定した。 </li><li>その後の実験では、残留塩を除去し、無水アルコールで滅菌する滅菌水でCSM 3回洗浄します。 </li></ol> 3。 CSMの遊離アミノ基の数を決定する 注：特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。 <ol><li> BubinsとOfner 7トリニトロベンゼン（TNBS）酸アッセイを用いてイオン架橋後のCSMに存在する遊離アミノ基の数を決定します。 40°Cで4時間、50 mLのガラス管に0.5％TNBS溶液1mLをマイクロスフェアの5mgをインキュベートすると2h、60℃で6N塩酸3 mLを加えて加水分解する。 </li><li>室温にサンプルを冷却し、脱イオン水5mLを追加することによって、自由にTNBSを抽出し、酢酸エチル10 mLのエーテル。 </li><li> ℃で15分間水浴中で室温まで冷却し、残留エーテルを蒸発させ、水15 mLで希釈して40に水相5 mLを温める。 </li><li>ブランクとキトサンのアミノ基の合計数を決定するためにCSMの準備のために使用されるキトサンなく、TNBS溶液を用いて、分光光度計で345 nmの吸光度を測定します。キトサンへの相対的なCSMの遊離アミノ基の数を推定する。 </li></ol> 4。 CSMの読み込みASC 注：特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。 <ol><li>一晩滅菌HBSSでセクション2.5から滅菌CSMの5mgを平衡化し、8μmの細孔径の膜培養プレートインサート（24ウェルプレート）に追加します。 </li><li> CSMはメンブレンに定住した後、慎重にHBSSを吸引し、目に増殖培地の挿入、700μLの内部に増殖培地300μLを追加インサートの外側の電子。 </li><li>培養プレートのインサート内部CSM上の成長培地と種子の200μLの適切な濃度で再懸濁し、ASC（1×10 4から4×10 4）。カルチャーインサート内の培地の最終量は、播種後、500μLです。 </li><li> 37℃5％CO 2の加湿インキュベーター内で24時間CSM上でASCシードをインキュベート℃に</li></ol> 5。 CSMでのASCの読み込みと細胞生存率の割合を決定する 注：特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。 <ol><li>インキュベーション後、インサート膜に移行した細胞を乱すことなく滅菌1.5 mlのマイクロ遠心チューブにASCにロードされたCSMを収集します。 </li><li>残留培地を除去し、チューブに新鮮な増殖培地250μLを追加します。 </li><li>各チューブに[3 - （4,5 - dimethylthiozole -2 - イル）-2,5 - ジフェニルテトラゾリウムブロマイド]を25μLMTTを追加する溶液（5 mg / ml）と37℃5％CO 2の加湿インキュベーター中で4時間インキュベート℃、 </li><li>インキュベーション後、培地を除去し、ジメチルスルホキシドの250μLを追加し、ホルマザンの複合体を可溶化するために2から5分間ボルテックス混合物を。 </li><li> 5分間2700×gでCSMを遠心し、その基準として630 nmを用いて570 nmで測定した上清の吸光度を決定します。 </li><li>実行可​​能なASCの知られている番号から得られた吸光度値からの相対CSMに関連付けられている細胞数を決定します。 </li></ol> 6。 ASC-CSM-組み込みコラーゲンゲルを特徴付ける 注：特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。 <ol><li> 2 N NaOHを用いて6.8にpHを調整した後、Bornstein 8とフィブリル化の方法に従って、ラットの尾の腱から抽出された1型コラーゲン（7.5 mg / ml）と混合ASCにロードされたCSM（5 mgを≈2×10 4細胞を含む）。 </lI&gt; <li> 12ウェルプレートにフィブリル化コラーゲン-ASC-CSM混合物を追加し、37℃5％CO 2の加湿インキュベーター中で30分間インキュベート℃、 </li><li>完全に心房細動の後、37℃で最大5％CO 2の加湿インキュベーター内で14日間のためにコラーゲン-ASC-CSMゲルをインキュベート</li><li>ゲルにCSMからの細胞の放出と移行は、標準的な顕微鏡技術を用いて観察した。 </li></ol> 7。代表的な結果本研究では、コラーゲンゲル足場にキトサンミクロスフェア（CSM）から幹細胞を提供するためにin vitroでの戦略を開発しました。均一な大きさ（直径175から225μm）と組成の多孔CSMは、細胞のキャリア（ 図2）として調製し使用しました。 CSMとASCをインキュベートすると、細胞は、CSMの2×10 4 cells/5mgの濃度で接続されている。糸状仮足を延長しながら細胞は、マイクロスフェアを介して拡散することができましたミクロスフェア（ 図3）の多孔質の隙間に。セルにロードされたCSMは、コラーゲンゲルと混合した後、細胞はすぐにゲル（ 図4）に移行し始めました。 <img alt="表1に" src="/files/ftp_upload/3624/3624table1.jpg" /> 表1。幹細胞デリバリーシステムのキトサンとコラーゲンの使用のための生物学的利点があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig1.jpg" /> 図1回路図は、ASC-CSMロードされたコラーゲンの足場の二重使用のための全体的な戦略を描いた。 図2、3、4、画像の解釈を支援するための回路図内で注釈が付けられています。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig2.jpg" /> 図2の模式図では、キトサンミクロスフェアに幹細胞を播種の過程を描いた。 PROCμmの孔径の膜培養プレートインサート - ESSは8 CSMと共培養ASCが含まれます。 24時間後、微小球は、挿入から削除され、生体マトリックス中に埋め込むための準備が整いました。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig3.jpg" /> 図3。ASCとCSM-ロードされた形態学的特性。パネルBは共焦点蛍光顕微鏡によって得られた画像を重ね合わせたビューの同じフィールドを示しているパネルは、ASCにロードされたのCSMの光顕微鏡写真を示しています。 ASCは、カルセインAM（緑色）がプリロードされた。パネルDは、ミクロスフェア（アスタリスク）にロードされた細胞を示しているパネルCは、無負荷時のマイクロスフェアのSEM像のイメージを示しています。パネルEのTEMイメージがアンロードされたミクロスフェアの断面を示しています。毛穴や割れ目の多数は、フェア全体に配置されています。パネルFは、細胞とのクロス切片ミクロスフェア（矢印）を接続し、CREに糸状仮足を延長を示しています。悪徳。オリジナル倍率：A＆B = 70X、C = 500分の1、D = 2,000×、E＆F = 2,500 X。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig4.jpg" /> 図4三次元コラーゲンスキャフォールドにCSMからASCの移行。パネルAおよびBは、細胞が離れてミクロスフェアからの移行で、3日目にコラーゲンマトリックス（矢印）にCSMを描いています。パネルBは、12日後に同様の文化を示しています。透過型電子顕微鏡（TEM）画像は、ミクロスフェア（矢印）からの移行細胞とのクロス切片であったミクロスフェアを表示CとDにC、D、およびEアスタリスクで示されている。パネルDの高倍率は、パネルEに示すように、コラーゲン線維（挿入図）に接続されているセルの糸状仮足を示しています。オリジナル倍率：A＆B = 100倍、C＆D = 6,000 X; E = 20,000、はめ込み= 150,000 X。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig5.jpg" /> 図5。回路図は、再生医療とドラッグデリバリーにおけるCSMの広大な使用方法を描いた。

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なし競合する経済的利益は存在しません。 免責事項ここに記載されている意見やアサーションは、作者の私的見解であり、公式、または国防省、または米国政府の部門の意見を反映して解釈されるべきではありません。著者らは、米国政府の従業員であり、この作品は、その職務の一部として作成されました。すべての作業は、米陸軍医学研究および資材コマンドでサポートされていました。本研究では、米陸軍医学研究および資材コマンド機関審査委員会によって審査、承認されたプロトコルの下で実施され、承認されたプロトコルに準拠していた。

幹細胞ベースの治療の主要なハードルは、修理のために指定された領域への細胞の送達のための効率的な方法を開発しています。患者変動への患者の、組織の種類、損傷の大きさと深さのために、幹細胞を提供する方法論は、ケースバイケースで決定する必要があります。マトリックス内の幹細胞を埋め込み、創傷部位にそれらを提供する組織工学のための次の論理的なアプローチであるように見えますが、いくつかの技術的なハードルが残っています。これは、マトリックスに接続し、細胞は、添付増殖アノイキス9月10日の前に適した微小環境を再確立することができる周囲の生体適合性を提供するために埋め込 ​​まれた細胞の機能が含まれています。このプロセスは、細胞は、幹細胞の増殖、遊走、分化、所望の細胞プロセスの前に達成するために数日かかることができるプロセスを彼らのマトリックスのリモデリング機構をアップレギュレートする必要があります。これらの問題を回避するため、我々はHAVEは、損傷組織の修復するために適切な行列にそれらを埋め込む前にキトサンミクロスフェアにプリロード幹細胞への方法を開発しました。当社独自のイオン架橋ミクロスフェアを調製するためのメソッドを使用して、プ...

<table border="1" ><tbody><tr><td> 試薬/装置の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ハンクスBalancedSalt溶液（HBSS） </td><td>ギブコ</td><td> 14175 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ハイクローン</td><td> SH30071.03 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>コラゲナーゼタイプII </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> C6685 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> 70μmのナイロンメッシュフィルター</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352350 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> 100μmのナイロンメッシュフィルター</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 352360 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> MesenPRO増殖培地システム</td><td>インビトロジェン</td><td> 12746-012 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>ギブコ</td><td> 25030 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> T75組織培養フラスコ</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 137787 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>キトサン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 448869 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>酢酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 320099 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> n-オクタノール</td><td>アクロスオーガニック</td><td> 150630025 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ソルビタン、モノオレイン酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> S6760 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P1767 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> L-4859 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>エタノール</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 270741 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>トリニトロベンゼンスルホン酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P2297 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>塩酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 320331 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>エチルエーテル</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 472から484 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> 8μmの組織培養プレートインサート</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 353097 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 05-408-129 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> MTT試薬</td><td>インビトロジェン</td><td> M6494 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> D8779 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> Qtracker細胞標識キット（Qトラッカー655） </td><td>分子プローブ</td><td> Q2502PMP </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> 1型コラーゲン</td><td> Travigen </td><td> 3447-020-01 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> S8045 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td> 12ウェル組織培養プレート</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 353043 </td><td>消耗品</td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5417R </td><td>機器</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>ニューブランズウィック州Scienctific </td><td> C24 </td><td>機器</tD&gt; </tr><tr><td>空気-5％CO 2の加湿インキュベータ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> 370 </td><td>機器</td></tr><tr><td>オーバーヘッドスターラー</td><td> IKA </td><td> Visc6000 </td><td>機器</td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>コー​​ニング</td><td> PC-210 </td><td>機器</td></tr><tr><td>減圧デシケーター</td><td> - </td><td> - </td><td>機器</td></tr><tr><td>粒径分析器</td><td>マルバーン</td><td> STP2000 Spraytec </td><td>機器</td></tr><tr><td>水浴</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> Isotemp210 </td><td>機器</TD&gt; </tr><tr><td>分光光度計</td><td>ベックマン</td><td>ベックマン·コールターDU800UV/Visible分光光度計</td><td>機器</td></tr><tr><td>渦</td><td> Diagger </td><td> 3030a </td><td>機器</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>モレキュラーデバイス</td><td> SpectraMax M2 </td><td>機器</td></tr><tr><td>光/蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> IX71 </td><td>機器</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> FV-500レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>機器</td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>カールツァイスマイクroImaging </td><td>レオ435 VP </td><td>機器</td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡</td><td> JEOL </td><td> JEOL 1230 </td><td>機器</td></tr></tbody></table>

幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築

Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

多能性幹細胞は再生医療1-3の分野で非常に有用であることが示されている。しかし、組織再生に効果的にこれらの細胞を使用するためには、変数の数を考慮する必要があります。これらの変数が含まれます：総体積と移植部位の表面積、組織の機械的性質および血管新生の量と細胞外マトリックスのコンポーネントが含まれています。組織の微小環境を、。宿主組織を模倣した機械的強度を維持しながら、したがって、これらの細胞を提供するために使用される材料は、定義された化学組成を持つ生体適合性でなければなりません。これらの材料はまた、酸素と栄養細胞が付着し、増殖するための有利な微小環境を提供するために透過性でなければなりません。キトサン、優れた生体適合性を有するカチオン性多糖類は、容易に化学的に修飾されたおよび in vivo Mac でと結合する高親和性を持つことができますromolecules 4-5。キトサンは、細胞接着、遊走および増殖のための基質として機能できるように、細胞外マトリックスのグリコサミノグリカン部分を模倣しています。本研究では、三次元足場6ベースのコラーゲンに脂肪由来幹細胞（ASC）を提供するミクロスフェアの形でキトサンを利用しています。理想的な細胞へのミクロス比はインキュベーション時間とロードすることができましたセルの最大数を達成するために、細胞密度を基準にして決定した。 ASCは、キトサンマイクロスフェア（CSM）に播種されると、それらはコラーゲン足場に埋め込まれており、長期間の培養で維持することができます。要約すると、この研究では、正確に三次元生体材料足場内で幹細胞を提供するメソッドを提供します。

現在の幹細胞治療の主要なハードルは、ホスト組織にこれらの細胞を提供するための最も効果的な方法を決定しています。ここでは、その多能性を維持するために、脂肪由来幹細胞を可能にしながら、アプローチの効率的かつ単純であるキトサンベースの配信方法について説明します。

多能性幹細胞は、再生医療の分野において極めて有用であることが示されています1-3。しかし、これらの細胞を効果的に利用するためには...

本プロトコルでは、キトサンマイクロスフィアからコラーゲンゲルスキャフォールドへの幹細胞の導入、回収、および培養を行うためのin vitro戦略について解説します。まず、初代脂肪細胞幹細胞を乳化させ、キトサンマイクロスフィアの調製物を回収します。次に、幹細胞をキトサンマイクロスフィアに播種し、孔径8 µmのメンブレン培養プレートインサートで培養して、CS担持CSMを作製します。最後に、このマイクロスフィアデリバリーシステムを3次元コラーゲンゲルスキャフォールドと混合します。最終的に、このCSMシステムは再生医療およびドラッグデリバリーへの応用の可能性を秘めています。細胞注入やマイクロカプセル化などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、細胞がキャリア材料に付着し、初期適用後も持続的に存在できる点にあります。一般的に、この方法に不慣れな方は、esanマイクロスフィアが本来的に静電荷を帯びているため、操作に苦労することがあります。また、マイクロスフィア層の上に細胞を播種する際、細胞を乱さずに配置することは困難です。会陰部および表皮の脂肪組織を切り出し、洗浄して細切します。次に、1～2 gの組織を1% FBS含有HBSS 25 mLに移します。遠心分離後、遊離して浮遊している脂肪組織層を125 mLのエルレンマイヤーフラスコに回収します。25 millilitersのコラゲナーゼ type twoを加え、オービタルシェーカーで反応液をインキュベートします。次に、オイル層および脂肪層の下にある液分を注意深く取り除き、170 micronsのナイロンメッシュフィルターで順次ろ過します。25 millilitersで2回洗浄した後、遠心分離によって細胞を回収します。HBSSでの再懸濁後、ペレットを30 millilitersのサプリメント添加mesen pro成長培地に懸濁させます。精製した脂肪由来幹細胞を2本のT 75培養フラスコに分注し、37 degrees Celsius、5%carbon dioxideの加湿インキュベーター内でASC調製物を増殖させます。このCSMプロトコルは、イオン的コア技術を利用した水中油エマルションプロセスです。6 mLのキトサン水溶液を100 mLの油相混合物に加え、オーバーヘッドスターラーとマグネチックスターラーを用いて1時間、互いに逆方向に同時に攪拌して乳化させ、安定した水中油型エマルションを作成する。その後、4時間にわたり15分ごとに1%水酸化カリウム n-オクタノール溶液を1.5 mLずつ添加する。イオン架橋反応の完了後、油相をゆっくりとデカンテーションで除き、速やかに球体を100 mLのアセトンに加える。油相が完全に除去されるまで、球体をアセトンで洗浄する。その後、回収した球体を真空中で乾燥させます。粒度分析計を用いて、脱水処理を行い、CSM粒子サイズの平均、1 mgあたりの表面積、および単位立方体積を測定します。続いて、残留塩を除去するために、CSMを滅菌水で3回洗浄します。次に、細胞実験に使用するため、CSM調製物を無水エタノールで滅菌します。50 mLのガラスチューブ内で、5 mgのマイクロスフィアを1 mLの0.5% TNBS溶液と混合し、40 °Cで4時間インキュベートします。その後、3 mLの6 N塩酸を加え、60 °Cで2時間インキュベートします。サンプルを室温まで冷却した後、5 mLの脱イオン水と10 mLのジエチルエーテルを加えます。遊離TNBSを抽出するには、水相を5 mL分取し、ウォーターバスで40 °Cに15分間加熱して残留エーテルを蒸発させた後、室温まで冷却します。15 mLの水で希釈し、分光光度計を用いて測定します。TNBSをブランクとして、調製したキトサンマイクロスフィアの345 nmにおける吸光度を測定してください。また、CSM調製に使用したキトサンの量を測定します。次に、キトサンの全アミノ基数に対するCSMの遊離アミノ基数を算出します。滅菌したCSM 5 mgを滅菌HBSS中で一晩平衡化させます。CSMを24ウェル培養プレート用の8 µmメンブレンインサートに移します。CSMが沈殿した後、HBSSを慎重に吸引します。次に、インサートの内側に300 µLの増殖培地を、インサートの外側に700 µLの増殖培地を加えます。再懸濁します。脂肪由来幹細胞を200 µLの増殖培地に懸濁し、培養プレート内のCSM上に播種します。インサートを37 °C、5% CO2加湿インキュベーター内で24時間インキュベートします。インサート膜内に遊走した細胞を乱さないように注意しながら、ASCをロードしたCSMを滅菌マイクロ遠心チューブに移します。次に、残存している培地を除去し、各チューブに250 µLの新鮮な増殖培地を加えます。5 mg/mLのMTT溶液を25 µL加え、4時間インキュベートします。培地を除去し、250 µLのジメチルスルホキシドを加えてボルテックスし、フォルマザン複合体を可溶化させます。その後、CSMを2,700 ×gで5分間遠心分離します。630 nmをリファレンスとして、570 nmにおける上清の吸光度を測定します。既知数の生存A SCから得られた吸光度値に基づき、CSMに関連する細胞数を決定します。A SCをロードしたCSM 5 mgを、ラット由来のタイプIコラーゲン 7.5 mg/mLと混合します。尾腱のpHを2N水酸化ナトリウムを用いて6.8に調整し、培養プレートに注ぎます。繊維状にするために挿入し、その後12ウェルプレートに移して30分間インキュベートします。インキュベーション期間中は、1日おきにcollagen A-S-C-C-S-Mゲルの培地を更新し続けてください。また、標準的な顕微鏡技術を用いて、CSMからゲルへの細胞の放出および遊走をモニタリングします。以下の例では、キトサンマイクロスフィアからコラーゲンゲルスキャフォールドへ脂肪由来幹細胞をデリバリーするためのin vitro戦略について説明します。SEMおよびTEM画像は、均一なサイズの多孔質CSMが調製されていることを示しています。マイクロスフェアと脂肪由来間葉系幹細胞を共培養した結果、CSMカルシウムアミド1 mgあたり4,000個の細胞が認められました。SCの染色により、細胞がCSM上で伸展し、マイクロスフェアの多孔質な隙間にフィロポディアを伸ばしていることが示されました。細胞を播種したCSMをコラーゲンゲルと混合すると、細胞がゲル内へと遊走し、その経過を追跡することが可能です。この手法の意義は、広範囲かつ慢性的な組織欠損の治療へと即座に展開されます。さらに、この治療レジメンは、軟組織や心組織のさまざまなレベルの欠損治療に用いられる多種多様な細胞やバイオマテリアルと統合できる汎用性を備えているため、より大きな可能性を秘めています。本手法がホスト細胞のデリバリーに関する知見を提供し得ることが期待されます。また、注射剤などの他のシステムにも適用可能であり、治療薬の送達や、細胞と治療薬の両方を同時に送達するハイブリッドシステムの開発にも利用できます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

埋め込まれた細胞とその表面を含むモジュールと呼ばれる円筒状のコラーゲンゲルを、使用して、ミクロ組織の作成は、内皮細胞で被覆されている。...

コラーゲンゲル含有する細胞のモジュールを使用してマイクロ組織の作製

このプロトコルは、その周囲の細胞外マトリックスからヒントを得るために、複数の表現型に分化するよう誘導される幹細胞の固有の能力を活用に焦点を当てています。このメソッドの原稿は、同時に脂肪由来幹細胞を共区別するために、PEG-フィブリンおよびコラーゲンから成る二層ハイドロゲルを利用したモデルでは、我々の説明とその特性を拡張する...

ASCの分化を制御するための二層ゲルをエンジニアリング

この研究では、コラーゲン、平滑筋細胞、内皮細胞を直接培養することにより、生体血管組織を迅速に作製する技術を紹介します。さらに、人工血管組織の機械的特性評価のための新しいプロトコルについて説明します。...

エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

軟骨修復は満たされていない医学的課題であり、ヒトの関節軟骨を操作するための細胞ベースのアプローチは有望な解決策です。ここでは、ヒト関節軟骨細胞の拡大と成熟のための理想的なツールとして、3次元(3D)生体模倣ハイドロゲルについて説明します。...

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

コラーゲンは、ECMのコアコンポーネントであり、移行からの分化・増殖に至るまで、いくつかの細胞プロセスに不可欠な手がかりを提供します。 3Dコラーゲンハイドロゲル内の細胞を埋め込むためのプロトコル、およびPDMSマイクロチャネルを使用して、ランダム化または整列コラーゲンマトリックスを生成するための、より高度な技術がここに提供します。...

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

ここで動的イミン化学を用いたキトサン ベース注射ゲルの作製について述べる。ハイドロゲルの機械的強度と 3 D...

キトサンを用いた注射ゲルおよび 3 D 細胞培養への応用の準備

この記事では、同軸流集束装置を用いたヒト多能性幹細胞(hPSC)のカプセル化について説明する。我々は、このマイクロ流体封止技術がhPSCスフェロイドの効率的な形成を可能にすることを実証する。...

ヒト多能性幹細胞スフェロイドを担持したコアシェル型マイクロカプセルのマイクロ流体作製

本プロトコールは、キトサン−ゲニピンミクロゲルの作製のための非エマルジョンベースの方法を記載する。これらのミクロゲルのサイズは正確に制御することができ、pH依存性の腫脹を示し、...

組織工学用途のためのサイズ制御およびエマルジョンフリーのキトサン-ジェニピンミクロゲルの製造

このプロトコルは、流体の流れ方向に沿って形状を変化させるマイクロ流体チャネルを使用して、3Dコラーゲンヒドロゲル(厚さ&lt;250 μm)内の繊維を整列させるための伸長ひずみ(伸張)を生成する方法を示します。結果として得られるアライメントは数ミリメートルにまたがり、伸張ひずみ速度の影響を受けます。...

長距離繊維配向によるマイクロエンジニアリング3Dコラーゲンヒドロゲル

間葉系幹細胞から作製した人工軟骨組織を移植して軟骨内骨化術を行う骨治療は、従来の治療法の欠点を回避できる可能性があります。ヒアルロン酸ハイドロゲルは、均一に分化した軟骨移植片のスケールアップや、 in...

間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

学ぶ キトサンミクロスフェアを用いた脂肪由来幹細胞のコラーゲンハイドロゲルへの効率的な送達法。多能性を維持しながら細胞を担体に付着させ、再生医療や薬物送達への応用可能性を示す革新的な手法です。

幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築

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