根こぶ線虫、高および低スループット画面サツマイモ属。

本手順の全体的な目的は、ネコブセンチュウに寄生した植物をスクリーニングすることである。まず、砂質土壌または育成ポーチで健全な苗を育成する。次に、高度に感染したネコブセンチュウの2期幼虫の接種源を作成する。

次に、苗に適切に接種し、感染させます。最後に、宿主の根系における線虫の卵塊の発達を評価します。ここでは、線虫ではなく、根を持つ植物の高スループットおよび低スループットスクリーニングについて実演します。

このハイスループットシステムの主な利点は、植物の育成に必要なスペースを限定でき、感染の評価が容易であることです。したがって、これらの手法によって、植物の根への線虫感染を再現可能かつ均一に行うことができ、その結果、植物の宿主状態をより正確に評価することが可能になります。一般的に、根結線虫を用いた植物評価に不慣れな方は、根に線虫を接種させる際の適切な成長段階を選択していないため、困難に直面する傾向があります。

また、通常は感染力の低い、数日経過した感染期幼虫を用いることで、学部生や大学院生に向けた手順のデモンストレーションを行います。私の研究室では、ポット試験用の育成ポーチを用いたスクリーニングの手順を実演します。発芽後、22～28 °Cに維持された温室にて、サSunshine Mixなどの有機質に富んだ土を満たした単一のポットにトマトの種子を播種してください。

発芽から約2週間後、本葉が2枚になった段階で、1週間に1回Miracle-Groで施肥します。個々の苗を、滅菌した砂質土（砂90％、有機物10％）で満たしたポットに移植してください。OsmoCoat緩効性肥料を加え、温室内で22から28 °Cの温度で2週間維持します。その後も、1週間に1回Miracle-Groによる施肥を継続してください。

ハイスループットスクリーニングを行う場合は、砂質土壌を入れたトレイに種子を直接播種します。発芽するまでプラスチックラップで覆い、前述の方法で管理します。発芽後、Osmo coats緩効性肥料を添加し、週に1回Miracle-Groで施肥します。種子を数層のKimwipeでライニングしたペトリ皿に播種し、インキュベーター内で25 to 28 °Cに維持して発芽させた後、苗を個別のポーチに移植します。

あるいは、種子をペーパーグルーブ（紙製の溝）に配置し、個別のポーチ内で直接発芽させます。ポーチをプラスチック製の吊り下げファイルフォルダーに入れ、フォルダーをラック上に垂直に配置します。

ラックを、温度25～28°C、明期16時間および暗期8時間のサイクルに維持された環境制御チャンバー内に設置します。播種から約10～14日後、逆浸透水を用いて1日1～2回、ポーチに潅水します。三次根の先端を持つ十分な根系が発達した時点で、苗の接種準備が整ったことになります。卵の抽出を開始する前に、汚染を防ぐため、作業エリアとすべての器具を温水で十分に洗浄してください。

回収用のバケツをシンクに置き、溶液を流し込み、その上にワイヤーメッシュのサポートを設置します。卵が25µmのふるいに回収されるよう、孔径の大きい順に3つのふるいを上から順に重ねます。感染した植物の上部を切り取り、慎重に廃棄してください。

植物をポットから取り出し、水で満たしたプラスチックバケツに浸して根を洗浄します。さらに、土粒子が洗い流されるまで流水で根をすすぎます。その後、感染したトマトの根からネコメセンチュウの卵を抽出します。

まず、ハサミを用いて根を細かく切り、主根は廃棄します。1株分の細かく切った根を蓋付きの大きなプラスチック容器に入れ、根が浸かる分だけの10%次亜塩素酸ナトリウム溶液を加えます。蓋を閉め、容器を2分間振ります。

ジャーを開け、根を上部のふるいに注ぎ、ミストノズルを取り付けたホースで洗浄します。漂白剤の臭いが完全になくなるまで十分に洗浄してください。また、ふるいの目詰まりを防ぐため、マレットでふるいの側面を叩いてください。

一旦停止し、上のふるいを取り出して残渣を洗い流します。次に2番目のふるいを取り出し、水ボトルの緩やかな水流を用いて、前のふるいから落ちた卵を含む微細な残渣を回収します。

デブリをふるいの端に寄せます。デブリと卵を、最小限の水とともに清潔なビーカーに回収します。バケットに溜まった水を25 micronのふるいでろ過し、漏れた可能性のある卵をすべて回収します。

水で十分にすすぎ、同じビーカーに回収します。清潔な金属バスケットにキムワイプを数枚重ねて敷き、ガラス製シャーレにセットします。この際、バスケットの底とシャーレの底との間に1 cmの隙間を空けてください。

抽出した線虫の卵を、ワイヤーバスケット内のペーパー上に注ぎます。ワイヤーバスケットの底が水面に接するが、水に浸からない程度の液体を加えます。

毎日、上部をプラスチック製の蓋で覆います。水の蒸発を確認し、バスケットの底が水に触れるように、ペトリ皿に水を補充してください。卵の乾燥を防ぐため、6〜8日間にわたって1日おきに、J2（第2段階幼虫）を含むペトリ皿の中の水をビーカーに回収します。

すぐに使用しない場合は、ラボの空気供給装置またはアクアリウムポンプで生成された空気を用いて、回収した接種物を室温で直ちにエアレーションしてください。次のステップでは、マグネチックスターラーを用いて接種物を低速で攪拌し始めてください。回収した線虫を3つの分注量で使用します。

会計におけるJ twosの数を数えるため、スライドまたはディッシュを用いて平均値を算出し、接種に必要な液量を決定します。これらは顕微鏡下で観察したJ twosです。

通常、ポット栽培の植物には1株あたり3000 J twosを、苗トレーで育てた植物には500 J twosを使用します。植物に接種する前に、土壌が湿っているが濡れすぎていないことを確認してください。ポットへの接種では、各トマトの根系周囲の砂に、ポットの深さの約半分程度の穴を3か所開けます。

鉛筆を用いて、ピペットでJ twosを3つの穴に注入し、各植物に接種します。その後、トレイ内のハイスループットスクリーニング用の穴を塞ぎます。5 mLピペットに側面に穴のある改造密封チップニードルを接着して使用してください。

ピペッターを傾け、J2を土壌に注入します。植物を温室内の24 to 27 °Cで6から8週間維持します。月2回、Miracle-Groを用いて追肥を継続します。

感染の評価を行う。上部を切り取り、慎重にポットから植物を取り出して根を洗浄する。その後、根を1 mg/Lの溶液に浸し、卵塊を青色に染色する。

15分間、Aerioでグロッシングを行う。根を水で洗浄し、個々の根系にある染色された卵塊を数えて評価する。卵塊の可視化には照明付き実体顕微鏡を使用でき、線虫の計数、接種源の調製、および前述の磁気攪拌機による攪拌を行う。

吊り下げフォルダからポーチを取り出し、水平な面に置きます。各ポーチに、5 mL中の1,500匹のJ2を接種します。ポーチのプラスチックカバーを持ち上げ、線虫を根の表面に均等に分散させます。

接種後、遮光のため黒い紙で覆い、ポーチを24時間水平に保持します。その後、ポーチを成長チャンバー内の水の中にある吊り下げフォルダに戻します。肥料に対する反応が見られるまで、約3日間にわたり、1日1〜2回、0.5倍濃度のHoagland溶液で植物に灌水します。

通常、葉の緑色が濃くなり、シュートの成長がより旺盛になります。3日後、ポーチを水で湿らせた状態に保ちます。接種から約30日後、各ポーチに 75 milligrams liter の溶液を約 10 to 20 milliliters 注入します。

エアログロッシング。ポーチ内を染料で満たした状態で水平に保ち、一晩静置します。翌日、ポーチ内の液を排出し、照明付きデスクの下で卵塊数を数えて根系を評価します。

ここに拡大して示されているのは、広範囲にわたって青色に染色された卵塊が見られる、高度に感染したトマトの根です。トレイを使用することで、狭い育成スペースで数百本の植物のスクリーニングが可能になります。また、育成ポーチを用いることで、根を洗浄することなく、根の状態や線虫感染の非破壊的な評価を迅速かつ効率的に行うことができます。

本手法により、限られた育成スペースで数千株の植物の高スループットスクリーニングを行うことが可能です。ここでは、ポーチ内で育成したcow P植物の根系に、接種後の青染された卵塊が認められます。線虫を用いた植物アッセイでは、感染のタイミングが極めて重要です。

したがって、感染をわずか数日遅らせるだけでも、感染レベルが著しく低下する可能性があります。このビデオを視聴したことで、根結線虫を用いた植物への接種方法および評価方法について十分に理解できたはずです。線虫に感染した根は適切に取り扱う必要があることを忘れないでください。

根を廃棄する前にオートクレーブで滅菌することで、線虫の拡散を制限できます。また、エアリアルグリシンは高用量で発がん性があるため、使用には注意してください。

したがって、この化学物質を用いて感染させた根の取り扱いおよびこの化学物質の調製には、手袋を着用する必要があります。