無菌マウスでのプログレッシブ植民地時代に肝代謝変化を評価する 1 H NMR分光法
December 15th, 2011
プログレッシブ植民地化の手順は、さらにホストの肝代謝への影響を評価するために記述されています。肝代謝が高分解能マジック角スピニング（人事MAS）無傷の生検のNMRプロファイリングによって評価されている間植民地化は、NMRベースの代謝プロファイリングによる共同代謝微生物の尿中排泄を評価することにより、侵襲的、非監視されます。
この手順の目的は、宿主の肝代謝に対する進行性のコロニー形成の影響を評価することです。これは、最初に無菌マウスを徐々にコロニー化することによって達成されます。コロニー形成プロセスは、NMR分光法を通じて微生物の共代謝産物の尿中排泄を評価することによって監視されます。
コロニー形成プロセスのモニタリングに続いて、マウスから肝生検を採取し、代謝プロファイリングの準備をします。その後、肝臓の代謝プロファイルは、非破壊高分解能マジックアングルスピニングNMR分光法を使用して、無傷の生検から取得できます。最終的に、このプロトンNMR分光法の使用により、エネルギー経路や酸化ストレス経路などの代謝経路に関与するさまざまな代謝物が明らかになります。
したがって、この実験は、コロニー形成中の肝機能についての洞察を提供することができます。また、腎臓などのシステムを通じて適用することもできます。動物をコロニー化するには、無菌マウスをアイソレーターから取り出し、従来の飼育室でケージに入れ、従来の動物の前にフィルターが装備され、コントロールとして機能します。
次に、対照の従来のケージから採取した生後3日後のごみの半分を無菌動物のごみと混合し、マウスをチューブの上に動かして1.5ミリリットルのマイクロチューブに尿を収集し、腸を優しくマッサージして助けます。5mmNMRプローブでの取得には最低20マイクロリットルが必要ですが、代謝プロファイリングの品質を向上させるためには30マイクロリットルを使用することをお勧めします。NMR分析まで、少なくともマイナス40°Cの液体窒素貯蔵庫で尿をすぐに凍結します。
NMR取得に先立ち、重水に0.2モルのリン酸ナトリウム緩衝液を調製します。pH 7.4には、1ミリモルのTSPが含まれており、尿中30マイクロリットルとリン酸ナトリウム緩衝液30マイクロリットルを混合します。金属針を備えた50マイクロリットルのガラスシリンジを使用して、混合溶液50マイクロリットルを1.7ミリメートルNMRキャピラリーチューブに移します。
気泡が出ないように注意してください。尿サンプルが入ったキャピラリーの上にキャピラリーアダプターを取り付け、5mmNMRプローブ用の2.5mmNMRマイクロチューブに入れます。このチューブの組み合わせは、スペクトル取得用の標準的な5mmNMRチューブとして使用できます。
このデモンストレーションでは、ブルアーの先進的な3つの700メガヘルツNMR分光計を使用してデータを収集します。書かれたプロトコルで説明されているパラメータを使用して、1次元のプロトンNMRスペクトルを取得します。NMR取得後、抽出ロッドを使用して、キャピラリーアダプターを優しくねじ込み、書面によるプロトコルで説明されているように動物の安楽死後にキャピラリーを引き抜くことにより、2.5ミリメートルNMRチューブからキャピラリーを取り外します。
肝生検の準備をします。汚染を避けるためにアルコールを含む製品を使用したり、水や生理食塩水を使用して工具を洗ったりしないでください。再現可能な生検のために、左葉から肝生検を採取します。
組織が薄い周辺領域を避けて、左葉の中央に一貫して収集します。胆汁漏れの場合に備えて胆嚢に穴を開けないように注意してください。ティッシュペーパーはすぐに水または生理食塩水で洗ってください。
生検を液体窒素ですぐに凍結し、NMR分析まで摂氏マイナス80度で保存します H-R-M-A-S-N-M-Rを設定するには、3回目の生検をジルコニウムローターに挿入し、残りのボリュームを純粋な重水で満たしてNMRをロックします。気泡は、その後のシムやデータ取得の品質を損なう可能性があるため、気泡を作らないように注意してください。円筒形のネジを使用して50マイクロリットルのテフロンスペーサーを挿入します。
ネジを緩め、短辺の深度ゲージを使用して校正します。ネジピンをスペーサーに置き、ドライバーで優しくねじ込みます。ドライハウス、ティッシュペーパー付きの残留水。
次に、キャップをローターの上部に置き、ローターパッカーに挿入します。キャップが所定の位置に収まるまでしっかりと押します。ローターとローターの底の半分のキャップマークとの間にスペースが残らないようにし、光学スピンレート検出を可能にするために黒のマーカーペンを使用します。
ローターが十分に詰め込まれたら、NMR分光計の中に入れ、5キロヘルツの回転を開始します。ここは。500メガヘルツの3メガヘルツの分光器が使用されています。CP MGパルスシーケンスを使用してプロトンNMRスペクトルを取得します。
メーカーのガイドラインによると、5.22ppmの豊富なアルファおよび数値グルコースダブレットピークを使用して、結果として得られるNMRスペクトルを較正できます。ローターを開梱するには、キャップリムーバーを使用してキャップを取り外し、ネジピンを緩め、テフロンスペーサーを取り外します。円筒形のネジを使用して、装置を水と洗剤で十分に洗浄できます。
コロニー形成プロセスにおける腸内微生物の共代謝産物の出現は、20日間コロニーを形成した動物の尿中代謝プロファイルのこのプロトンスペクトルに明確に示されています。この動物は、無菌状態で従順な硫酸塩と非常に少量のフェニルアセチルグリシン(略称PAG、およびque細胞硫酸塩)を排泄しませんでした。コロニー形成が進むにつれて、腸内細菌叢によるタンパク質代謝のこれら3つのマーカーは大幅に増加し、20日目に平衡に達します。
特定のPAGトリプレットピークを波形解析することにより、この特定のマーカーの経時的な増加を定量化することができました。この図は、プロトンH-R-M-A-S-N-M-R分光法を用いて、7匹の動物のコロニー形成中の平均PAG濃度を表しており、コロニー形成前後の2匹のマウスの肝臓代謝プロファイルが得られた。この図は、A-M-A-S-N-M-Rベースの代謝プロファイルから導き出される情報をよく示しています。
エネルギー代謝に由来する多数のアミノ酸や代謝物を可視化することができます。これらのプロファイルには、酸化ストレス、ヌクレオチド代謝、およびメチルアミン代謝に関連する情報も含まれています。この例では、無菌マウスがグリコーゲンをほとんど示さず、グルコースとトリグリセリドの量が非常に少ないことは非常に明らかです。
したがって、この手順に従うと、化学療法などの複数の統計ツールを適用して、代謝プロファイルに従って論理サンプルをクラスター化し、代謝状態に関連するバイオマーカーを強調することができます。
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概要
この研究は、宿主の肝代謝への影響を評価するための段階的なコロナイゼーション手順を説明します。コロナイゼーションは、NMRベースの代謝プロファイリングを用いた微生物代謝物質の尿中排泄を通じて非侵襲的にモニタリングされます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 代謝
- 微生物学
背景
- 宿主代謝に対する腸内細菌叢の影響を理解することは重要です。
- 正確な評価には非侵襲的モニタリング技術が不可欠です。
- NMR分光法は詳細な代謝プロファイリングを提供します。
- 段階的なコロナイゼーションは代謝経路への洞察を明らかにできます。
研究目的
- 段階的なコロナイゼーションが肝代謝に与える影響を評価すること。
- 尿中の微生物代謝物質排泄をモニタリングすること。
- NMRを用いて肝生検を代謝プロファイリング分析すること。
使用された方法
- 無菌マウスの段階的なコロナイゼーション。
- NMR分光法を用いた微生物代謝物質の尿中排泄の評価。
- 代謝プロファイリングのための肝生検の収集。
- 生検の完全な分析のための高分解能魔法角スピニング（HR MAS）NMR分光法。
主な結果
- エネルギーおよび酸化ストレス経路に関与する様々な代謝物の同定。
- 尿中代謝物分析を通じたコロナイゼーションの成功したモニタリング。
- 腸内細菌叢と肝代謝の関係に関する洞察。
- 代謝研究のための非破壊的プロファイリング技術の実証。
結論
- 段階的なコロナイゼーション手順は肝代謝に効果的な影響を与えます。
- NMRベースの技術は代謝相互作用を研究する上で有用です。
- 腸内細菌叢と代謝の治療的意味を探るためのさらなる研究が可能です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding host-microbiota metabolic interactions is critical for de-risking therapeutic targets in metabolic disease. This method enables non-destructive, longitudinal assessment of hepatic metabolic shifts during progressive gut colonization, providing mechanistic insights for target validation. It supports predictive confidence in early discovery by linking microbial activity to host pathway modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by tracking microbial co-metabolite excretion as a functional readout of gut microbiota activity.
- Operational Value: Enables biological de-risking through longitudinal monitoring of colonization impact on hepatic energy and oxidative stress pathways.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating microbial establishment with measurable shifts in glucose, glycogen, and triglyceride levels in intact liver tissue.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares standardized biological systems for downstream screening by establishing reproducible colonization models with quantifiable urinary biomarkers.
- Quantitative Output: Provides semi-quantitative metabolic profiling of intact liver biopsies via HR MAS NMR, enabling detection of key metabolites in energy and stress pathways.
- Platform Reuse: The NMR-based approach can be applied to other tissues (e.g., kidney), supporting cross-organ metabolic profiling in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models metabolic syndrome risk by revealing how progressive colonization alters hepatic metabolism in germ-free mice.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase microbial metabolite tracking to preclinical validation of host metabolic responses.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway-level interactions between gut microbiota and host hepatic function, reducing ambiguity in target selection.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling iterative assessment of microbiota-host metabolic interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by monitoring urinary excretion of microbial co-metabolites (e.g., phenyl acetyl glycine) as colonization progresses.
- Screening: Ensures assay readiness through standardized, non-invasive monitoring of colonization using NMR-based urinary metabolic profiling.
- Analytics: Delivers quantitative metabolic readouts from intact liver biopsies, including glucose, glycogen, triglycerides, and oxidative stress markers, to compare metabolic states.
- Translational Research: Links microbial metabolic activity to hepatic pathway modulation, supporting preclinical continuity in metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reproducible, non-destructive NMR workflow applicable across tissue types for metabolic profiling in discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in host-microbiota metabolic interactions.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through non-invasive colonization monitoring and intact tissue profiling.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-linked biomarkers of metabolic pathway engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated hepatic metabolic responses to colonization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in NMR spectroscopy, germ-free animal handling, and metabolic profiling techniques.
- Dependent on HR MAS NMR instrumentation, capillary sample preparation tools, and cryogenic storage for urine and tissue samples.
- Necessitates cross-team standardization between microbiology, metabolomics, and pathology teams for consistent sample collection and analysis.
- Must account for variability in coprophagic behavior and environmental colonization when adapting to different model systems or facilities.
- Limited by the semi-quantitative nature of HR MAS NMR and the need for careful bubble-free sample preparation to ensure spectral quality.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Colonization of Germ-free Animals and Sample Collection
2:07
1H NMR Acquisition of Urine Microvolume
3:25
Collection of Liver Biopsy
4:09
1H High Resolution Magic Angle Spinning (HR MAS) NMR of Liver Tissue Biopsy: Sample Preparation
5:55
Urinary and Hepatic Metabolic Profiling through 1H NMR and 1H HR MAS NMR Spectra
7:32
Conclusion
