無菌マウスでのプログレッシブ植民地時代に肝代謝変化を評価する ¹ H NMR分光法

この手順の目的は、段階的なコロナイゼーションが宿主の肝代謝に及ぼす影響を評価することです。まず、無菌マウスに段階的なコロナイゼーションを行い、その後、NMR分光法を用いて微生物共代謝物の尿中排泄を評価することで、コロナイゼーションの過程をモニタリングします。

定着プロセスのモニタリング後、マウスから肝生検サンプルを採取し、代謝プロファイリングの準備を行います。その後、非破壊的な高分解能マジック角回転（MAS）NMR分光法を用いて、未処理の生検サンプルから肝臓の代謝プロファイルを取得できます。最終的に、このプロトンNMR分光法の活用により、エネルギー代謝や酸化ストレス経路などの代謝経路に関与するさまざまな代謝物が明らかになります。

本実験により、定着中の肝機能に関する知見を得ることができます。また、腎臓などの他の器官のシステムにも応用可能です。動物に菌を定着させるには、無菌マウスをアイソレーターから取り出し、コントロールとして使用する通常飼育動物の前面にフィルターを備えたケージに入れ、通常の飼育室で飼育してください。

次に、対照群の通常ケージから採取した生後3日のリッターの半分を、無菌動物のリッターと混合させます。マウスをマイクロチューブの上に保持し、腸を優しくマッサージして排尿を促すことで、1.5 mLのマイクロチューブに尿を回収します。5 mm NMRプローブでの測定には最低20 µLが必要ですが、メタボリックプロファイリングの品質を向上させるためには30 µLの使用が推奨されます。回収した尿は直ちに液体窒素で急凍結させ、NMR分析まで−40 °C以下で保存してください。

NMR測定に先立ち、重水を用いた0.2 molarのリン酸ナトリウム緩衝液を調製します。pH 7.4で1 millimolarのTSPを含むこの緩衝液を、尿試料30 µLに対して30 µLの割合で混合します。混合液50 µLを、金属針付きの50 µLガラスシリンジを用いて1.7 mm NMRキャピラリーチューブに移します。

気泡が入らないように注意してください。尿サンプルが入ったキャピラリーの上部にキャピラリーアダプターを装着し、それを5 mm NMRプローブ用の2.5 mm NMRマイクロチューブに挿入します。このチューブの組み合わせを、スペクトル収集用の標準的な5 mm NMRチューブとして使用できます。

このデモンストレーションでは、Bruker Advanced Three 700 MHz NMR 分光計を用いてデータを収集します。書面でのプロトコルに記載されているパラメータを使用して、1次元プロトン NMR スペクトルを取得してください。NMR 取得後、書面でのプロトコルに記載されている動物の安楽死の手順に従い、キャピラリーアダプターをゆっくりと回して、2.5 mm NMR チューブから抽出ロッドを用いてキャピラリーを取り出します。

肝生検の準備を行います。汚染を防ぐため、アルコールを含む製品は一切使用せず、器具は水または生理食塩水で洗浄してください。再現性を確保するため、肝生検検体は左葉から採取します。

組織が薄い周辺領域を避け、左葉の中心部から一貫して採取します。胆汁漏れを防ぐため、胆嚢を穿孔させないよう注意してください。採取した組織は、直ちに水または生理食塩水で洗浄します。

生検試料を直ちに液体窒素で急凍結し、NMR分析まで-80°Cで保存します。HR-MAS NMRの準備として、3つ目の生検試料をジルコニアローターに入れ、残りの容量をNMRロック用の純重水で満たします。気泡が入ると、その後のシミングやデータ収集の品質に影響を及ぼす可能性があるため、注意してください。円筒形ネジを用いて50 µLのテフロンスペーサーを挿入します。

ネジを緩め、短辺にあるデプスゲージを使用して校正します。スレッドピンをスペーサーの上に置き、ドライバーでゆっくりと締め付けます。ティッシュペーパーを用いて、残っている水分を拭き取ります。

次に、キャップをローターの上部に置き、ローターパッカーに挿入します。キャップが固定されるまでしっかりと押し込んでください。ローターとキャップの間に隙間がないことを確認します。光学的回転数検出を可能にするため、黒のマジックペンを使用してローター底部の半分に印を付けます。

ローターを十分に充填したら、NMR分光計に設置し、5 kHzでスピンを開始します。ここでは、Bruker Avance III 500 MHz分光計を使用しています。CPMGパルスシーケンスを用いて、1H NMRスペクトルを測定します。

製造元のガイドラインに従い、5.22 ppmに現れる豊富なαおよびβ-グルコースのダブレットピークを、得られたNMRスペクトルの校正に使用できます。ローターを取り出すには、キャップリムーバーを用いてキャップを取り外し、スレッドピンを緩めて外してから、テフロンスペーサーを取り除きます。円筒形ネジを使用することで、装置を水と洗剤で十分に洗浄することが可能です。

定着プロセスにおける腸内微生物共代謝物の出現は、定着から20日目の動物の尿中代謝プロファイルのこのプロトンスペクトルに明確に示されています。この動物は、無菌状態でインドキシル硫酸を全く排泄せず、フェニルアセチルグリシン（PAGと略記）およびキシル硫酸を極少量しか排泄していませんでした。定着が進むにつれて、腸内細菌叢によるタンパク質代謝のこれら3つのマーカーは大幅に増加し、20日目に平衡状態に達します。

特定のPAGトリプレットピークを積分することにより、この特定のマーカーの経時的な増加量を定量化することが可能となりました。この図は、プロトンH-R-M-A-S-N-M-R分光法を用いて得られた、7匹の動物グループにおける定着中の平均PAG濃度を表しており、定着前後のマウス2匹の肝代謝プロファイルが取得されました。この図は、A-M-A-S-N-M-Rに基づく代謝プロファイルから得られる情報を明確に示しています。

多数のアミノ酸およびエネルギー代謝由来の代謝物を可視化することができます。これらのプロファイルには、酸化ストレス、ヌクレオチド代謝、およびメチルアミン代謝に関連する情報も含まれています。この例では、無菌マウスにおいて、グリコーゲンがほとんど検出されず、グルコースとトリグリセリドの量も非常に少ないことが極めて明確に示されています。

この手順に従うことで、ケモメトリックスなどの複数の統計的手法を適用し、代謝プロファイルに基づいて論理サンプルをクラスター化し、代謝状態に関連するバイオマーカーを抽出することが可能になります。