Name: 無菌マウスでのプログレッシブ植民地時代に肝代謝変化を評価する 1 H NMR分光法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 学ぶ無菌マウスのプログレッシブ植民化が肝代謝に与える影響を評価する方法。NMR分光法を用いて尿中微生物共代謝物と肝生検の代謝プロファイルを非侵襲的に解析し、エネルギー代謝や酸化ストレス経路に関与する代謝物を同定する。

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例示的な例として使用されるすべてのNMRスペクトルは、財政的にネスレでサポートされていた以前に発行された研究7から派生しています。

1。無菌動物とサンプル採取の植民地化<ol><li>無菌アイソレーターと家それらのコントロール（図1）となる従来の動物の前にフィルターを装備したケージの中で、従来の飼育室内から動物を取り外します。 </li><li>無菌動物のくずで制御従来のケージから取り出したゴミ（3日齢）の半分を混ぜる。常に汚れた従来のゴミの1 / 3は、細菌のレベルを（少なくとも3日間それを保つ）を維持するためにそれを更新する必要があるたびにしてください。 </li><li>チューブの上にマウスを処理することにより、1.5 mLのマイクロチューブに尿を収集し、静かに腸をマッサージによって排尿を助ける。スナップインの凍結液体窒素で直ちに。 NMRの分析まで、少なくとも-40℃で保管してください。 20μLの最小体積は5mm NMRプローブで取得するために必要ですが、メタボリックプロファイリングの質を向上させるために30μLを使用することをお勧めします。 </li><li>動物Bすべきeは、麻酔薬の化合物の肝代謝（例えば、放血によって死の確認に続いて頸椎脱臼を使用）によ​​る交絡NMR共鳴を避けるためにどんな麻酔を使用せずに安楽死させ</li></ol> 2。肝生検のコレクションのための勧告<ol><li>汚染を避けるために、アルコールを含む製品を使用しないでください。水のみまたは生理食塩水を使用してツールを洗ってください。 </li><li>胆嚢穿孔しないでください。胆汁の漏れの場合には、水または生理食塩水ですぐに組織を洗う。 </li><li>図2に示すように、左葉から肝生検（15-50約100mg）を収集する。再現可能な生検のために、組織が薄くなって周辺地域を避けて左葉の中心に一貫して収集する。 </li><li>直ちに液体窒素中で凍結生検をパチンと-80に保管しておきます° CのNMR分析まで。 </li></ol>尿微量3。1 H NMRの取得</P&gt; <ol><li> D2O（99.8％）、1mMの3を含む液（pH7.4）中0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液を準備- （トリメチルシリル）プロピオン酸- dの4（TSP）。 </li><li>リン酸ナトリウム緩衝液の30μLと尿の30μLを混合。 </li><li>金属針（外径0.5 mm）を装備した50μLガラスシリンジを用いて1.7mmのNMRキャピラリーチューブ（図3（2））に混合液の50μLを移す。気泡を避けるように注意してください。 </li><li>毛細血管を含む尿サンプルの上にキャピラリアダプタ（図3（3））に適合と5mm NMRプローブ（図3（1））のための2.5 mmのNMRのマイクロチューブに入れてください。スペクトル取得のための定期的な5 mmのNMR管にチューブのこの組み合わせを使用してください。 </li><li>それを引き出すために静かにキャピラリアダプタをねじ込んで2.5 mmのNMRチューブからキャピラリーを削除するには、抽出のロッド（図3（4））を使用してください。 </li></ol> 。肝組織生検の4 1 H人事MAS NMR法：試料調製<ol><li>ローターのコンポーネントとツールがあるMAS図4で説明しています。 </li><li>ジルコニウムローターに生検を（15-50約20mg）を挿入します（図4（1））とNMRロック用の純粋なD 2 Oでボリュームの残りを埋める。これはデータ収集のその後のシミングと質の質を変えてしまうので、どんな泡をしないように注意してください。 </li><li>円筒状のネジ（図4（5））を使用して50μLテフロンスペーサー（図4（2））を挿入します。ネジを外し、それと短い側の深さゲージ（図4（8））を使用して、それを校正する。このステップでは、それの部分がスペーサーの穴から漏れる可能性があるため、サンプルに固有の注意を払うことが重要です。このような場合は、その後、生検の一部が破壊され、サンプルの重量は、信頼性はなくなりました。それは、このように最初から再度サンプルの準備を開始する必要があります。 </li><li> THEADピン（図4（3））に置き、ねじ回し（図4（6））で軽く固定します。組織片を持つ任意の残留水を完全に乾かす。 </li><li>でキャップ（図4（4））を配置ローターの上部とローターパッカー（図4（6））に挿入します。キャップが所定の位置になるまでしっかりと押します。ローターとそのキャップの間に残されたスペースは存在しないはずです。 </li><li>光学的スピン速度の検出を可能にするために黒のマーカーペンを使ってローターの底部の半分をマークします。 </li><li> NMR分光計の内部にローターを配置し、5 kHzで回転し始める。メーカーのガイドラインに従ってCPMGパルスシーケンス13を用いて1 H NMRスペクトルを取得する。 </li><li> NMRスペクトルを較正するために5.22 ppmの（二重線）で、αアノマーグルコースの共鳴を使用してください。 </li><li>ローターをアンパックするには、キャップリムーバー（図4（9））を使用してキャップを除去することによって進んでください。ネジを外しTHEADピンと円筒形のネジを使用して削除テフロンスペーサー。徹底的に水と洗剤を使って洗う。 </li></ol> 5。代表的な結果腸内微生物の活動は、尿中の代謝プロファイリングを使用して監視できます。尿中の微生物の数が多い1 H NMRによって同定共同代謝物は、文献7,14-17に記載されている。これらの微生物の共同代謝物は、彼らが新たに設立された生態系が安定しているときに推定するために、迅速かつ非侵襲的な方法を提供するように植民地化のプロセスを監視するために特に有用です。図5Aは、明らかに植民地化のプロセスを介し腸の微生物の共同代謝物の外観を示しています。この図は、動物のためのステップ2で説明した手順に従うことによって得られる尿中代謝プロファイルは、ステップ1で説明した手順を使用して20日を植民地化を示しています。この動物は、無菌状態（0日目-青）で任意のインドキシル硫酸とphenylacetylglycine（PAG）及びp -クレゾール硫酸の非常に少ない量を排出していない。植民地化が進むにつれ、腸内細菌によるタンパク質代謝のこの3つのマーカーは、20日目（赤）で平衡に達するために大幅に増加する。 PAGを使用して、図5Bに示すように、これは動物のグループを監視するための特に簡単です。共鳴。この図は7動物のグループのために、PAGの特定の共鳴（三重）に対応する図5Aに灰色で強調表示されて共鳴（δ7.40から7.43）、下の面積を積分して得られた。 1 H高分解能マジック角スピニング（人事MAS）NMR分光法は、生検18の任意の種類の代謝プロファイルを迅速かつ再現性の買収を可能にする非破壊技術です。このプロトコルでは、我々は（青）と後（赤）のコロニー形成（図6）前2マウスの肝代謝のプロファイルを取得するために、この強力な技術を使用していました。この図はよくMAS NMRベースの代謝プロファイルから導出することができる情報を示しています。多数のアミノ酸だけでなく、例えばグルコース、グリコーゲン、乳酸、トリグリセリド、（D）-3 -ヒドロキシ酪酸とnicotinurateなどのエネルギー代謝から得られる代謝産物を可視化することができる。これらのプロファイルはまた、酸化ストレス（すなわちアスコルビンに関連する情報が含まれていますCID、グルタチオン）、ヌクレオチド代謝（すなわちイノシン、ウリジン）およびメチルアミンの代謝（すなわちコリン、トリメチルアミン- N -オキシド）。この例では、それは、無菌マウスはほとんどグリコーゲンやブドウ糖とトリグリセリドの非常に低い量として以前に7を公開したが表示されないことが非常に明確です。 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig1.jpg" alt="図1。"/> 図1。植民地化のプロトコルの概要。無菌と、従来の動物が側とその仔は、従来の腸内細菌叢（1）からプログレッシブ植民地化を可能にするために交換されることで、フィルタの側面を装備したケージに収容されています。腸内微生物の活動は、1 H NMRベースの代謝プロファイリング（2-3）を使用して監視されます。肝代謝は、1 H人事MAS NMRベースの代謝プロファイリング（4-5）によって評価される。 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig2.jpg" alt="図2。"/> 図2。マウスのライブRの解剖学。肝臓は、そのような臓器の平らな面として表示されているテーブルに直面している。再現可能な生検の場合は、それは破線の長方形で示されるように常に左葉の中央からサンプルを収集することをお勧めします。 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig3.jpg" alt="図3。"/> 図3 microvolumesで動作するように1.7ミリメートルNMRキャピラリーキットキー ：。。：1 2.5 mmのNMRマイクロチューブ、2：1.7ミリメートルNMRキャピラリーチューブ、3：キャピラリアダプタ、4：抽出ロッド。 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig4.jpg" alt="図4。"/> 図4 MASローター装備キー ：。。：1 MASローター、2：50μLテフロンスペーサー、3：THEADピン、4：キャップ、5：円筒形のネジ、6：ドライバー、7：ローターパッカー、8：深さゲージ。 <img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig5.jpg" alt="図5。"/> 図5。colonizatio時の尿中代謝プロファイルの進化nの<ol class="ualpha"><li>微生物の共同代謝を可視化できる6.8から7.8 ppmの間のスペクトルの芳香族領域でズーム。1 H NMRスペクトルは0日目（青）で、単一の個体由来した、4（緑）、15（オレンジ）と20 （赤）ポスト植民地化。インドキシル硫酸、彼の：：ヒスチジン、p -クレゾール- S：、：1 - MeHistamine：インドキシル- S 1 - methylhistamineグレーゾーンはBキーで図を作るために統合された領域に対応するp -クレゾール硫酸; PAG ：Phenylacetylglycine。 </li><li>植民地化中の平均PAGの濃度（N = 7）。スチューデントのt検定は、様々なタイムポイントでPAGの濃度差を比較するために使用されていました：P 0日目に比べて&lt;0.05、B：P &lt;0.01は、10日目に比べて。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/3642/3642fig6.jpg" alt="図6。"/> 図6。無菌（青）と元無菌（再由来する肝生検の典型的な600 MHzの1 H人事MAS NMRスペクトルD）マウス。大胆な陽子は、トリグリセリドの共鳴する責任がありますキー ：3 - HB：3 -ヒドロキシ酪酸、GSH：還元型グルタチオン、TGS：トリグリセリド、TMAO：トリメチルアミン- N -オキシド。

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<li>Sitter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HR+MAS+MR+spectroscopic+profiles+of+breast+cancer+tissue+with+clinical+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Comparison of HR MAS MR spectroscopic profiles of breast cancer tissue with clinical parameters.</a> NMR Biomed. 19, 30-40 (2006).</li>
<li>Beckonert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+profiling%2C+metabolomic+and+metabonomic+procedures+for+NMR+spectroscopy+of+urine%2C+plasma%2C+serum+and+tissue+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts.</a> Nat. Protoc. 2, 2692-2703 (2007).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もない。

このプロトコルでは、我々はさらに無傷の生検の1 H人事MAS NMRのプロファイリングにより評価された肝代謝で腸内細菌の影響を調査するためにオープンな環境で進歩的な植民地化の手順を説明した。植民地化の様々な方法が文献に記載されている。定義された細菌を持つ動物を植民地化する最も一般的な方法は強制経口投与または汚染された飲料水19,20です。糞便の接種は、前述の21として使用することができます。ここで紹介する植民地化の方法は、コープJPらによって記述された無菌動物の&quot;正常化&quot;の方法から派生しています。 1986年22インチ本書では、著者らは、無菌動物の間でアイソレーターに生きて、従来の動物を置く。しかし、それは、アイソレータで動物を維持するためには必ずしも可能ではないサンプルコレなら彼らは植民地化のプロセス中に操作する必要がある場合は特に（これは特に困難です。ction）が必要です。代替は、ごみの存在下で、従来のオープンな環境で家の元無菌動物することにあるコントロールとして使用される従来の動物によって汚した。このように、植民地化の目的...

特定の試薬と機器の表： <table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td> 2.5mmのマイクロチューブ</td><td>新時代</td><td> NE-H5/2.5-V-Br </td><td></td></tr><tr><td> 1.7ミリメートル毛細管</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> NORS175001 </td><td></td></tr><tr><td>キャピラリアダプタ</td><td>新時代</td><td> NE-325-5/1.7 </td><td></td></tr><tr><td>抽出ロッド</td><td>新時代</td><td> NE - 341から5 </td><td></td></tr><tr><td> 50μLとHR - MASローターBL4 球状​​のテフロンスペーサキット</td><td>ブルカー</td><td> HZ07213 </td><td></td></tr><tr><td> 50μLを挿入するためのツールキット</td><td>ブルカー</td><td> B2950 </td><td></td></tr><tr><td>アドバンスIII 600MHzのNMR </td><td>ブルカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1 H人事MAS NMR固体プローブ</td><td>ブルカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>重水99.9パーセント</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 530867 - 1L </td><td></td></tr><tr><td> 3 - （トリメチルシリル）プロピオン 酸の- d 4（TSP） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 269​​913 </td><td></td></tr></tbody></table>

無菌マウスでのプログレッシブ植民地時代に肝代謝変化を評価する 1 h nmr分光法

Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy

それは、腸内細菌がこのような免疫保護とビタミンの合成など、さまざまな利点を提供し、ホストの恒常性に大きく貢献することはよく知られています。彼らはまた、このエコシステムに不可欠な代謝の臓器作り、栄養素のかなりの量のホストを指定します。ホストとその腸内細菌叢との間の代謝相互作用を理解する腸内細菌叢とメタボリックシンドロームとの間のリンク、の増加する証拠の文脈では、現代生物学の重要な課題となってきています。1-4 植民地化は（また、正規化のプロセスとも呼ばれる）の元無菌動物における微生物の設立を指定します。それは、出生時に発生する自然なプロセスですが、それはまた腸花生態系を制御し、さらにホストの代謝への影響を判断するために成人無菌動物で使用されています。植民地化のプロセスを制御するための一般的な手順は、singlで強制経口投与の方法を使用することです。eまたは微生物の混合物。このメソッドは、非常に迅速に植民地化の結果、5非常にストレスであることの不利を提示。したがって、ストレスを最小限に抑え、徐々にホストの代謝上の細菌の設立の影響を観察するために低速の植民地化のプロセスを取得すると便利です。 この原稿では、我々は非破壊メタボリックプロファイリング技術を使用して徐々に植民地化の過程で肝代謝の変更を評価する手順を説明します。我々は、1 H NMRベースの代謝プロファイリングによる共同代謝微生物の尿中排泄により反射された腸内微生物の代謝活性を評価することによって、腸内微生物のコロニー形成を監視するために提案する。これは通常、DGGE（勾配ゲル電気泳動を変性）による糞便細菌を監視することにより評価した腸内微生物生態系の安定した設置を超える腸内微生物活性の安定性の理解が可能になります。6植民地化は、従来のオープンな環境で行われ、汚れたゴミ対照となる従来の動物、で汚れたによって開始されます。糞食性の動物がいるげっ歯類は、これは前述のように均質な植民地化を保証します 肝代謝プロファイリングは、NMR分光法をスピニング1 H高分解能マジック角を使用して無傷の肝生検から直接測定されます。この半定量的な手法は、さらに植民地化のプロセスと肝代謝70から10の間の複雑な相互作用を推定するために、セル構造に損傷を与えることなく、そのようなトリグリセリド、グルコースとグリコーゲンなどの主要な代謝物を評価するための素早い方法を提供しています。このメソッドは任意の組織生検11,12に適用することもできます。

プログレッシブ植民地化の手順は、さらにホストの肝代謝への影響を評価するために記述されています。肝代謝が高分解能マジック角スピニング（人事MAS）無傷の生検のNMRプロファイリングによって評価されている間植民地化は、NMRベースの代謝プロファイリングによる共同代謝微生物の尿中排泄を評価することにより、侵襲的、非監視されます。

無菌マウスでのプログレッシブ植民地時代に肝代謝変化を評価する 1 H NMR分光法

腸内細菌が、免疫保護やビタミンの供給など、さまざまな利益をもたらし、宿主の恒常性維持に大きく寄与していることはよく知られています。

この手順の目的は、段階的なコロナイゼーションが宿主の肝代謝に及ぼす影響を評価することです。まず、無菌マウスに段階的なコロナイゼーションを行い、その後、NMR分光法を用いて微生物共代謝物の尿中排泄を評価することで、コロナイゼーションの過程をモニタリングします。定着プロセスのモニタリング後、マウスから肝生検サンプルを採取し、代謝プロファイリングの準備を行います。その後、非破壊的な高分解能マジック角回転（MAS）NMR分光法を用いて、未処理の生検サンプルから肝臓の代謝プロファイルを取得できます。最終的に、このプロトンNMR分光法の活用により、エネルギー代謝や酸化ストレス経路などの代謝経路に関与するさまざまな代謝物が明らかになります。本実験により、定着中の肝機能に関する知見を得ることができます。また、腎臓などの他の器官のシステムにも応用可能です。動物に菌を定着させるには、無菌マウスをアイソレーターから取り出し、コントロールとして使用する通常飼育動物の前面にフィルターを備えたケージに入れ、通常の飼育室で飼育してください。次に、対照群の通常ケージから採取した生後3日のリッターの半分を、無菌動物のリッターと混合させます。マウスをマイクロチューブの上に保持し、腸を優しくマッサージして排尿を促すことで、1.5 mLのマイクロチューブに尿を回収します。5 mm NMRプローブでの測定には最低20 µLが必要ですが、メタボリックプロファイリングの品質を向上させるためには30 µLの使用が推奨されます。回収した尿は直ちに液体窒素で急凍結させ、NMR分析まで−40 °C以下で保存してください。NMR測定に先立ち、重水を用いた0.2 molarのリン酸ナトリウム緩衝液を調製します。pH 7.4で1 millimolarのTSPを含むこの緩衝液を、尿試料30 µLに対して30 µLの割合で混合します。混合液50 µLを、金属針付きの50 µLガラスシリンジを用いて1.7 mm NMRキャピラリーチューブに移します。気泡が入らないように注意してください。尿サンプルが入ったキャピラリーの上部にキャピラリーアダプターを装着し、それを5 mm NMRプローブ用の2.5 mm NMRマイクロチューブに挿入します。このチューブの組み合わせを、スペクトル収集用の標準的な5 mm NMRチューブとして使用できます。このデモンストレーションでは、Bruker Advanced Three 700 MHz NMR 分光計を用いてデータを収集します。書面でのプロトコルに記載されているパラメータを使用して、1次元プロトン NMR スペクトルを取得してください。NMR 取得後、書面でのプロトコルに記載されている動物の安楽死の手順に従い、キャピラリーアダプターをゆっくりと回して、2.5 mm NMR チューブから抽出ロッドを用いてキャピラリーを取り出します。肝生検の準備を行います。汚染を防ぐため、アルコールを含む製品は一切使用せず、器具は水または生理食塩水で洗浄してください。再現性を確保するため、肝生検検体は左葉から採取します。組織が薄い周辺領域を避け、左葉の中心部から一貫して採取します。胆汁漏れを防ぐため、胆嚢を穿孔させないよう注意してください。採取した組織は、直ちに水または生理食塩水で洗浄します。生検試料を直ちに液体窒素で急凍結し、NMR分析まで-80°Cで保存します。HR-MAS NMRの準備として、3つ目の生検試料をジルコニアローターに入れ、残りの容量をNMRロック用の純重水で満たします。気泡が入ると、その後のシミングやデータ収集の品質に影響を及ぼす可能性があるため、注意してください。円筒形ネジを用いて50 µLのテフロンスペーサーを挿入します。ネジを緩め、短辺にあるデプスゲージを使用して校正します。スレッドピンをスペーサーの上に置き、ドライバーでゆっくりと締め付けます。ティッシュペーパーを用いて、残っている水分を拭き取ります。次に、キャップをローターの上部に置き、ローターパッカーに挿入します。キャップが固定されるまでしっかりと押し込んでください。ローターとキャップの間に隙間がないことを確認します。光学的回転数検出を可能にするため、黒のマジックペンを使用してローター底部の半分に印を付けます。ローターを十分に充填したら、NMR分光計に設置し、5 kHzでスピンを開始します。ここでは、Bruker Avance III 500 MHz分光計を使用しています。CPMGパルスシーケンスを用いて、1H NMRスペクトルを測定します。製造元のガイドラインに従い、5.22 ppmに現れる豊富なαおよびβ-グルコースのダブレットピークを、得られたNMRスペクトルの校正に使用できます。ローターを取り出すには、キャップリムーバーを用いてキャップを取り外し、スレッドピンを緩めて外してから、テフロンスペーサーを取り除きます。円筒形ネジを使用することで、装置を水と洗剤で十分に洗浄することが可能です。定着プロセスにおける腸内微生物共代謝物の出現は、定着から20日目の動物の尿中代謝プロファイルのこのプロトンスペクトルに明確に示されています。この動物は、無菌状態でインドキシル硫酸を全く排泄せず、フェニルアセチルグリシン（PAGと略記）およびキシル硫酸を極少量しか排泄していませんでした。定着が進むにつれて、腸内細菌叢によるタンパク質代謝のこれら3つのマーカーは大幅に増加し、20日目に平衡状態に達します。特定のPAGトリプレットピークを積分することにより、この特定のマーカーの経時的な増加量を定量化することが可能となりました。この図は、プロトンH-R-M-A-S-N-M-R分光法を用いて得られた、7匹の動物グループにおける定着中の平均PAG濃度を表しており、定着前後のマウス2匹の肝代謝プロファイルが取得されました。この図は、A-M-A-S-N-M-Rに基づく代謝プロファイルから得られる情報を明確に示しています。多数のアミノ酸およびエネルギー代謝由来の代謝物を可視化することができます。これらのプロファイルには、酸化ストレス、ヌクレオチド代謝、およびメチルアミン代謝に関連する情報も含まれています。この例では、無菌マウスにおいて、グリコーゲンがほとんど検出されず、グルコースとトリグリセリドの量も非常に少ないことが極めて明確に示されています。この手順に従うことで、ケモメトリックスなどの複数の統計的手法を適用し、代謝プロファイルに基づいて論理サンプルをクラスター化し、代謝状態に関連するバイオマーカーを抽出することが可能になります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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