マイクロインジェクション分子およびそれらの真核生物の細胞内ターゲットを視覚化するツールに相関光学および電子顕微鏡（クレム）
2012年5月4日
CLEMの技術はマイクロインジェクション分子の影響を受け、膜、細胞小器官、および細胞内構造の超微形態を分析するように適合されています。このメソッドでは、複数ナノメートルの分解能にミリメートルできるようにマイクロマニピュレーション/マイクロインジェクションの強力な技術、共焦点蛍光顕微鏡、電子顕微鏡を組み合わせたものです。この技術は、多種多様なアプリケーションに適している。
次の実験の全体的な目標は、蛍光標識された低分子またはタンパク質を培養哺乳類細胞の細胞質に導入し、マイクロメートルから数ナノメートルの分解能で誘導された形態学的変化を観察することです。これは、まず哺乳類細胞を格子状のガラスカバースリップで培養し、蛍光標識された目的の小分子またはタンパク質をマイクロインジェクションすることで達成されます。次に、細胞をホルムアルデヒドに固定し、蛍光顕微鏡を用いて観察および画像化します。
次に、細胞をグルタルアルデヒドで固定し、切片化し、染色し、電子顕微鏡を用いて画像化します。最後に、明視野蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で撮影された画像を組み合わせて整列させます。最終的に、これらの画像の相関関係により、研究者は目的の小分子またはタンパク質によって誘発される摂動を高解像度でイメージングできます。
こんにちは、私はダラスのテキサス大学サウスウェスタンメディカルセンターの微生物学部のニール・アルト博士の研究室のエヴァン・レディック博士です。今日は、M Clemの手順またはマイクロインジェクションの相関光と電子顕微鏡についてお話しします。マイクロインジェクションや顕微鏡検査などの単独の技術と比較した場合、この手順の主な利点は、ここではそれらが協調して行われ、グリッドガラスカバースリップの使用を支援することです。
この格子状のカバースリップにより、研究者はプロトコルの異なる部分で同じ細胞に戻ることができます。さらに、この技術により、研究者は、さまざまな注射可能な低分子または目的のタンパク質から細胞内構造の変化を観察する能力を、マイクロメートルからマルチナノメートルの分解能で観察することができます。マイクロインジェクションの準備として、正常なラット、腎臓、または不死化子宮頸がん細胞などの培養細胞を、2つの生きた細胞皿を貼り付けたフォトエッチングガラスグリッドカバースリップに載せて培養し、細胞を摂氏37度とCO2の5%でインキュベートします。
使用する実験タイムラインに応じて、細胞の同時流暢さを調整します。完全にコンフルエントなプレートは、電子顕微鏡でマイクロ注入された細胞の同定を非常に困難にします。したがって、種子細胞は、短い実験の日に約50%coの流暢さに達し、約25%coの流暢さに達します。
より長い実験の日には、蛍光標識されたタンパク質DNAまたは小分子を適切なバッファーに調製し、最終容量50マイクロリットルにします。選択したFluor oforに応じて、Texas redやcascade blueなどのトラッキング色素を追加します。ミリリットルあたり0.5〜1ミリグラムの濃度を追加します。
0.22ミクロンの遠心フィルターで溶液をろ過します。メーカーのガイドラインに従ってマイクロインジェクション針を引っ張った後、針のバックエンドにマイクロリットルの溶液を慎重にピペットで入れます。倒立顕微鏡に取り付けられた市販のマイクロインジェクションデバイスのマイクロマニピュレーターアームに針をロードします。
培養細胞の皿を倒立顕微鏡の皿ホルダーに入れます。フォトエッチングされたグリッド内で成長しているセルを見つけ、グリッドの英数字識別子をメモします。これは、後続のすべてのステップで使用されます。
マイクロインジェクション用の細胞は、カバースリップの中央付近に付着しているものを選び、周辺部に近い細胞は避けることが重要です。これは、後で電子顕微鏡検査に使用されるエポン樹脂のセンターピースに関心のある細胞を効率的に移動させるため、重要です 手動、手動で注入アームをカバースリップの上に下げ、マイクロマニピュレータを使用して、先端が細胞の表面に優しく触れるまで針を下げます。マイクロインジェクトは、約50%Coの流暢さで成長した細胞のために選択されたグリッド内の他のすべての細胞を注入し、600平方メートルのマイクロメートルグリッドあたり約80個の細胞を期待し、これは約30〜40の実験および制御細胞のNを与えるでしょう。
注入後、ディッシュをインキュベーターに戻し、蛍光顕微鏡検査を行なうために所望の時間だけ置きます。増殖培地を廃棄し、細胞をホルムアルデヒドでPBSに室温で10分間固定します。固定剤を1つのXPBSと交換します。
次に、選択したグリッドの5〜10枚の明視野画像を低倍率と高倍率で撮影することにより、セルの配置を文書化します。マイクロインジェクションされた細胞を同定するには、不活性インジェクション色素眼の励起波長と発光波長で蛍光画像を撮影します。共焦点顕微鏡を使用して、以前に画像化されたのと同じグリッド内で、マイクロ注入された細胞の画像を高倍率でザック収集します。
蛍光画像を電子顕微鏡で同定する細胞内構造と相関させるためには、高倍率が必要です。共焦点イメージング後、カバースリップ除去液を使用してカバースリップをディッシュから分離し、1つのXPBSを含む新鮮な培養ディッシュに細胞側を上にして置きます。電子顕微鏡の解析に進みます。
標準のEMプロトコルに従った後であること。サンプルを固定して染色し、脱水するには、eponレジンを調製し、eonレジン充填チューブの上にカバースリップセルを下にして置きます。樹脂を摂氏60度で24時間重合させます。
エポン樹脂からカバースリップを取り外すため。液体窒素にすばやく浸します。摂氏60度からマイナス196度までの温度ショック。
カバースリップを樹脂チューブから外します。5〜10分待ってから、カバースリップから解放されたチューブを取り出します。解剖スコープの下で、レジンの表面を検査し、目的のグリッドを特定します。
滅菌カミソリの刃またはメスを使用して、目的のグリッドのみがブロックの頂点にあるようにエポンブロックをトリミングし、トリミングされたブロックの超微分音カットシリアルセクションは、小便器のアセテートとクエン酸鉛を使用して、標準的なプロトコルを使用してセクションを対比します。電子顕微鏡で、細胞の相対的な位置をガイドとして使用して、目的の細胞を再配置します。以前に撮影した高解像度の蛍光画像を使用。
電子顕微鏡写真で、蛍光シグナルに対応する関心領域を特定します。ヘテロクロマチンの位置や核膜などのランドマークを使用して、どの蛍光Zack画像がEMスライスに対応するかを判断します。現在、Image JやAdobe Photoshopなどのイメージングプログラムでイメージングされている場合は、蛍光画像の不透明度を50%に下げて、対応するTEM画像に重ね合わせます。
表示されているスケールを調整して、画像を整列させます。マイクロインジェクションと相関光および電子顕微鏡の結果を以下に示します。この画像は、レーザーエッチングされたガラス格子カバースリップ上で成長するNRK細胞の明視野顕微鏡写真を示しています。
注入された細胞を含むグリッドを識別するために使用される b と m の背景文字に注意してください。矢印は、電子顕微鏡で同定および画像化された2つの細胞を示しています。ここに示されているのは、マイクロインジェクトされた細胞の同定に使用される不活性トラッキング色素カスケードブルーの蛍光画像です。
これは、アミン標識小分子の明視野と蛍光シグナルの重ね合わせです。このパネルは、注入された細胞の明視野蛍光顕微鏡と電子顕微鏡の相関関係を表しています。矢印は、このパネルで高倍率で画像化された蛍光点を示しています。
このビデオを見た後、目的のタンパク質をマイクロインジェクションする方法と、マイクロインジェクションClemまたは相関光および電子顕微鏡の手順を使用して、それが誘発する細胞内形態学的変化を追跡する方法をよく理解しているはずです。
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概要
CLEM技術により、マイクロ注射された分子によって影響を受けた膜や細胞器の超微細構造の形態学的分析が可能になります。マイクロ操作、共焦点蛍光顕微鏡、および電子顕微鏡を組み合わせることで、この方法はミリメートルからマルチナノメートルスケールの高解像度イメージングを実現します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 顕微鏡技術
背景
- この研究は、培養された哺乳類細胞に対する小さな分子やタンパク質の影響に焦点を当てています。
- 蛍光標識により、これらの分子を細胞内で追跡することができます。
- 異なる顕微鏡技術を組み合わせることで、観察される変化の解像度が向上します。
- 神経科学研究には、様々な解像度での細胞応答の理解が不可欠です。
研究の目的
- 蛍光標識された分子を哺乳類細胞に導入すること。
- これらの分子によって引き起こされる形態学的変化を観察すること。
- 詳細な分析のために異なる顕微鏡技術からの画像を相関させること。
使用された方法
- グリッド付きガラスカバースリップ上で哺乳類細胞の培養。
- 蛍光標識された小さな分子やタンパク質を細胞にマイクロ注射すること。
- 蛍光顕微鏡イメージングのためのホルムアルデヒドによる細胞の固定。
- グルタルアルデヒドによる固定、切片化、染色、および電子顕微鏡によるイメージング。
主要な結果
- 高解像度の画像により、注射された分子によって引き起こされた変化が明らかになります。
- 蛍光顕微鏡と電子顕微鏡からの画像の成功的な整列。
- CLEMが細胞小器官の分析に有効であることを実証。
- 様々なスケールでの形態学的変化についての洞察を提供。
結論
- CLEM技術は、マイクロ注射された分子に対する細胞応答を研究するのに効果的です。
- イメージング技術を組み合わせることで、細胞形態の包括的な分析が可能になります。
- この方法は、神経科学および細胞生物学の様々な研究分野に適用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) enables biopharma teams to visualize the precise subcellular localization and morphological impact of microinjected molecules in eukaryotic cells. This dual-modality approach bridges the gap between dynamic fluorescent imaging and ultrastructural electron microscopy, supporting mechanistic de-risking and target validation. Integrating CLEM into discovery workflows enhances predictive confidence in early-stage compound and biologic evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of molecular perturbations at subcellular resolution for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by correlating molecular localization with ultrastructural changes.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of protein or small molecule effects within disease-relevant cellular compartments.
Screening & Assay Development
- Provides validated imaging outputs for downstream assay development and screening workflows.
- Ensures reproducibility and standardization by leveraging gridded coverslips for precise cell tracking.
- Delivers quantitative and spatially resolved data to inform compound selection and prioritization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns subcellular morphological readouts with translational biomarker strategies when relevant.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling high-resolution mechanistic insights.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on direct visualization of cellular responses.
Pipeline & Workflow Integration
CLEM integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-resolution, correlative imaging of microinjected molecules and their cellular effects.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking molecular localization to ultrastructural outcomes.
- Screening: Provides reproducible, quantitative imaging data for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Enables direct comparison of experimental and control conditions through aligned fluorescence and EM images.
- Translational Research: Offers mechanistic insights that inform biomarker alignment and preclinical model selection.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for diverse molecular and cellular targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing high-content data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of candidates based on direct cellular evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in both fluorescence and electron microscopy techniques.
- Demands access to specialized instrumentation, including microinjection systems and high-resolution microscopes.
- Necessitates cross-team standardization for sample preparation and image alignment.
- Adaptation may be needed for different cell types or molecular classes.
- Throughput is limited by manual microinjection and imaging steps.
