Name: マイクロインジェクション分子およびそれらの真核生物の細胞内ターゲットを視覚化するツールに相関光学および電子顕微鏡（クレム） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 学ぶマイクロインジェクションCLEM法で培養哺乳類細胞に蛍光標識分子を導入し、ミリメートルからナノメートルスケールで細胞内構造変化を可視化する技術。神経科学と細胞生物学研究に応用可能です。

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我々は有用な議論アルト研究室のメンバーに感謝。我々はまた、技術的な専門知識とアドバイスを博士クリス·ギルピン、トムJanuszewski、とローリーミューラー具体的には、UTの南西医療センターの分子細胞イメージング施設に感謝します。また、原稿の批判的な読みのために博士Xionanドンに感謝します。この作品は、NMAにNIHの助成金AI083359でサポートされています

1。哺乳動物細胞培養<ol><li>正常ラット腎（NRK）、不死化子宮頸癌（HeLa細胞）、または他の適切な哺乳動物細胞株を37℃で培養される℃、5％CO 2は 、セル料理を生きるために貼付フォトエッチングガラスグリッド化されたカバースリップ上で（任意の試薬 ​​については、 表1を参照するか、 DMEM中でこのプロトコルに使用される装置）+ 10％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシン。哺乳類培養細胞を扱うときの注意事項は、無菌環境を維持するために取られるべきである。 </li><li>あなたの実験のタイムライン（0-5時間対 1から2日後に注射）に応じて細胞の密集度は約50％に調節したり、それぞれ、25％〜すべきである。 </li></ol> 2。マイクロインジェクション<ol><li> 〜50μlの最終体積に、細胞培養への従順さに応じて、バッファのあなたの選択で目的のタンパク質、DNA、または小分子を準備します。例えばテキサスレッドまたはカスケードブルーなどの不活性の蛍光色素マイクロインジェクション、細胞をマークするために含まれており、注射染料と蛍光プローブの選択は非重複励起および発光波長を持つ必要があります。マイクロインジェクションのために必要な目的の分子の濃度は、経験的に決定されるべきであり、蛍光トラッキング色素は、一般的に0.5から1.0 mg / mlで使用されています。典型的には、ローダミンまたは別の蛍光色素分子は共有結合の検出が、他の方法は感度に応じて使用することができ、市販のキットを使用して興味のある分子に結合されています。詳細については、下記の重要な考慮事項を参照してください。 </li><li> 0.22μmの遠心フィルターを通して注入物質（〜50μl）をフィルタリングします。遠心フィルターは、真空および/またはデッドボリュームが関連付けられているシリンジろ過よりも優先されます。 </li><li>マイクロインジェクションニードルを生成するには、ホウケイ酸ガラスピペットは、メーカーのガイドラインに従って、フレイミング·ブラウンマイクロピペットプラーを使用してプルアップされています。代わりに、マイクロインジェクション針はfemtotipマイクロインジェクション針を作るエッペンドルフ含むベンダーから購入することができます。 </li><li>慎重エッペンドルフ20 Femtotipsを使用してマイクロインジェクション針の悩まされていない端に注入物質の4μlをピペット。気泡が引っ張らマイクロインジェクションニードル内に存在しないことを確認します。倒立顕微鏡に取り付けられたエッペンドルフFemptoJet Injectmanのマイクロマニピュレータアームにマイクロインジェクションニードルをロードします。マイクロインジェクション手順の良いレビューのために、読者は可視化実験の資料8の以前のジャーナルに向けられている。 </li><li>倒立ツァイス顕微鏡の皿ホルダーにグリッド化カバーガラスおよび培養細胞を用いた生細胞の皿を置きます。フォトエッチンググリッド内で増殖している細胞を見つけて、グリッドの英数字識別子の点に注意してください、これは、以降のすべてのステップで使用されます。以降の手順では、カバーガラスの縁でサンプル移送を制限するように理想的には、カバースリップの中心に細胞を見つけます。 </li><li>手動で低くインジェクションカバースリップ上の所定の位置にアームと、先端が優しく培養細胞およびこのポイントを超えて針の動きを防ぐために、プレス &#39;Limitの表面に接触するまで、マイクロマニピュレータジョイスティックとコントロール、下注射針を下に使用して、したがって、脆いを壊すホウケイ酸ガラスを引っ張った。細胞のマイクロインジェクションの他のすべての側面を、エッペンドルフFemtoJet InjectManユーザーマニュアルに従って実行されます。マイクロインジェクション法は、最近細菌9から分泌される個々の病原性タンパク質を理解するために使用された。 </li><li>選択されたグリッド内の他のすべての細胞を顕微注入する。コンフルエント〜50％で成長した細胞では、1は600μm2グリッドあたり〜80セル（例では、 図3（a）に示すように）期待することができます。従って、蛍光および電子顕微鏡検査により、30から40〜実験と対照細胞のnがあるでしょう。 </li><li>目的のために哺乳動物細胞培養インキュベーターに戻し、生細胞皿を置き時間は、実験装置によって決まる。あるいは、一つは前固定に関心のある特定の細胞内構造の出現を待つためにマイクロインジェクションからタイムラプス顕微鏡分析に直接進むこともできます。 </li></ol> 3。蛍光顕微鏡法<ol><li>必要に応じて、マイクロインジェクション、細胞の生細胞タイムラプス蛍光測定を実行し、その後、0.1Mカコジル酸緩衝液（pH7.4）に2.5％グルタルアルデヒドでメディアを交換して、室温で10分間インキュベートする。生細胞の測定が必要とされない場合は、細胞増殖培地を廃棄し、10分間室温で1xPBSで5ミリリットル3.7％ホルムアルデヒドで細胞を固定します。固定液を捨て、5mlの1xPBSと交換して、3.2に進みます。注：それは蛍光顕微鏡が完了するまで、グルタルアルデヒドを追加しないように非常に重要です。 </li><li>蛍光顕微鏡でフォトエッチンググリッド化されたカバースリップで生細胞の皿を置き（共焦点は、THIは必要ありません■ステップ）とセルの配置（ 図4A）を文書化するために5月10日、明視野と適切なグリッドの蛍光画像を収集する。不活性の注入色素（ 図4B）の励起および発光波長を用いて顕微注入された細胞を同定する。これは、電子顕微鏡を含む後続のステップでマイクロインジェクション細胞の同定を容易にするために、異なる倍率（例えば10xと65X）で画像を得ることが重要である。 </li><li>共焦点蛍光顕微鏡を用いて、上記の手順2.5で識別されたグリッド内のマイクロインジェクション、細胞のZ-スタックを収集します。高倍率（100倍）は、電子顕微鏡で同定される細胞内構造と蛍光画像を相関させるために必要です。 </li><li>カバーガラスは、市販のカバースリップの除去液を用いて生細胞の皿の底から除去し、5 mlを含むバージン細胞培養皿に細胞側を上に配置されている1xPBS。以下に詳述するようにカバースリップを使い、電子顕微鏡用に処理されます。 </li></ol> 4。透過型電子顕微鏡<ol><li> 0.1Mのカコジル酸緩衝液（pH7.4）で2ミリリットル2.5％グルタルアルデヒドで1xPBSバッファーを交換し、10分間室温でインキュベートする。長いインキュベーションは、必要ありませんが、細胞内構造の維持に役立ちます。注意：単独でホルムアルデヒドは電磁界解析のための十分な固定ではありません。 </li><li>カコジル酸緩衝液で3回洗浄し、続いて30分間の0.1Mカコジル酸緩衝液2 mlの1％四酸化オスミウムを加えて固定液と染色細胞を除去し、最後に蒸留H 2 Oですべてのバッファを置き換える</li><li>標準のEMプロトコルに続いて、エタノールで段階（70％〜100％）を直列にサンプルを脱水。エポン樹脂が充填されたチューブの上にエポン樹脂と場所のカバーガラスセル側を下準備します。 60℃で24時間重合を許可℃にセル側が行うフォトエッチンググリッド化されたカバースリップを置くことでエポン樹脂にWNは、目的の細胞だけでなく、グリッドパターンの両方が（ 図に示した例3B）重合時エポン樹脂に転送されます。 </li><li>速やかに液体窒素および/または熱湯に浸漬することによって、エポン樹脂からカバーガラスを外します。興味のあるグリッド（：グリッドパタパタは鏡像として転送されます注意してください）​​検索する双眼解剖スコープ内で樹脂の表面を点検してください。無菌のかみそりの刃またはメスを用いて、関心のある唯一のグリッドはエポン樹脂ブロックの頂点にあるようなエポンブロックを切り詰める。 </li><li>ウルトラミクロトームを使用して、所望の厚さ（断層TEM用従来のTEMおよび〜250nmの厚さのために〜70nmの厚さ）でトリミングブロックの連続切片を獲得。標準的なプロトコルに従って酢酸ウラニルとクエン酸鉛でセクションを比較してください。 </li></ol> 5。相関光学および電子顕微鏡<ol><li>で、目的の細胞を再配置前の手順で得られた画像を用いて電子顕微鏡。興味のある回顕微注入した細胞の位置が特定されている、興味のあったセル内の領域を識別するために高解像度の共焦点蛍光画像を使用しています。 TEMを用いた高解像度の画像、これらを。蛍光zスタック画像がEMスライスに対応するかを決定するためにそのような細胞周囲や核膜などのランドマークを使用しています。 </li><li>お好みの画像処理プログラム（例えば画像Jは、Adobe Photoshopなど）を使用して、50％に蛍光画像の不透明度を下げると、それが相関するとTEM像の上に重ねます。スケールを調整することによって、画像（縦横比を固定することを忘れないでください）​​とTEM像と一致するように共焦点画像の回転を合わせます。蛍光画像のコントラスト、シャープネスなどを微調整し、アライメントを助けるかもしれない。注：私達はヘテロクロマチン、核膜、およびセルの周囲が支援するための優れた建造物を表すことを発見した2画像の向きインチ</li></ol> 6。重要な考慮事項<ol><li>大幅に注入された小分子を識別しやすいように、例えばローダミンまたはフルオレセインなどの蛍光タグが共有結合し、市販のキットを使用して取り付けることができます。追加情報は、異所的にマイクロインジェクションの前に蛍光細胞内局在のマーカータンパク質を発現することによって得られる。したがって、蛍光体および不活性マイクロインジェクショントラッキング色素の選択が重要になります。 </li><li>近くにカバースリップの中心に付着しているマイクロインジェクションのための細胞を選択し、エッジに近いグリッドを選択しないように。これは、目的の細胞を電子顕微鏡に使用エポン樹脂に転写されることが最大の確率を提示します。 </li><li>細胞のコンフルエントI完全合流プレートとして、大事には電子顕微鏡でマイクロインジェクション細胞の同定は非常に困難になります。彼らは短い実験の当日〜50％コンフルエントに達するか、または長い（1-2日）実験当日の密集度25％〜ようではなく、種細胞。位置や形状の細胞と同様に配向させるランドマーク電子顕微鏡像として &quot;空のスペースを使用します。 </li><li>共焦点光学スライス厚は、実験のニーズに合わせて調整する必要があり、したがって、経験的に10を決定すべきである。 </li><li>固定剤のホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは、利用可能な最も高いグレードである必要があります。ホルムアルデヒドは、細胞を固定し、さらにタンパク質や小さな蛍光分子（例えば、ローダミンまたはFITCなど）の両方の蛍光特性を保持します。しかし、それは高いEMの解像度を可能にするための構造が保持されません。グルタルアルデヒドはanaly EMに高度に膜や細胞内構造を保持SISが、かなり蛍光妨げるでしょう。したがって、2つのステップの固定は、蛍光顕微鏡法とEMの両方にとって重要です。最後の固定がグルタルアルデヒド処理によって行うことができるようにホルムアルデヒド固定ステップは、生細胞の測定を実行する場合は省略できます。 </li></ol> 7。代表的な結果この手順では、真核細胞の細胞質に直接目的の分子を提供し、ミリメートルからマルチナノメートルの分解能に対する細胞とorganellerアーキテクチャにその局在および/または効果をモニターする能力を与える。実験装置と手順の概略図を図2に示します。この手法は、共焦点顕微鏡の後、エポン樹脂（ 図に目的の細胞だけでなく、グリッドパターンの両方を転送することができるレーザーエッチングされたガラスカバースリップグリッド化（ 図3A）、上に成長させた細胞のマイクロインジェクションに依存している3B）。 典型的なマイクロインジェクションのCLEM手順は相関蛍光画像と電子顕微鏡写真を、もたらし、細胞内局在性および超微細構造解析の両方を可能にします。フォトエッチングガラスグリッド化されたカバースリップ上で培養した細胞は、明視野像が得られた後、目的の分子（ 図4A）にマイクロインジェクションする。不活性トラッキング色素が非マイクロインジェクション細胞（ 図4B）からマイクロインジェクション、細胞を区別するために組み込まれている。共焦点Z-スタックはフルオロフォアまたは関心のマイクロインジェクション小分子（ 図4C）に接続された他の識別子を使用して得られる。サンプルは、グルタルアルデヒドで固定し、電子顕微鏡用に処理されます。電子顕微鏡写真は、それに対応するセル（ 図4D）に取得され、オーバーレイされます。蛍光シグナルを宿す領域が（ 図4Eより高い倍率で、より詳細に検査され</強い&gt;）。 <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig1.jpg" alt="図1"/> 図1マイクロインジェクションのCLEM手続きのタイムライン。実験の設定に応じて、マイクロインジェクションし、蛍光測定は、同じ日に行うことができます。電子顕微鏡用の試料を準備する長いインキュベーション工程に最も時間がかかるためで、2〜3日続く。 TEM解析および電子顕微鏡画像を用いた蛍光信号を相関は一日で行うことができます。 <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig2.jpg" alt="図2"/> 図2マイクロインジェクションのCLEM手順の一般的な実例ステップ1：レーザーエッチングされたガラスグリッド·カバースリップ上に増殖している細胞を見つけ、目的の分子を顕微注入するステップ2：明視野画像とマイクロインジェクション、細胞の共焦点蛍光灯Z-スタックの両方をキャプチャステップ3：準備するEMのためのカバーガラスは、分析とエポン樹脂に埋め込む。転送されたグリッドパターンを用いて、目的のように細胞をブロックトリム頂点にあるステップ4：ウルトラミクロトームで切断し、シリアルのセクションでは、 ステップ5：EM画像と蛍光画像を関連付けます。 <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig3.jpg" alt="図3"/> 図3グリッドパターンは、目的の細胞の識別を容易にパネル 〜50％コンフルエントまで増殖させた細胞のマイクロインジェクションを示す。。グリッド識別子AKの点に注意してください。スケールバーは100μmである。 パネルBは、関心のあるグリッドは、解剖顕微鏡で同定された後、連続切片となる重合エポン樹脂ブロック上にカバースリップから転送グリッドパターンを示しています。 パネルCは、セクショニングの準備のために転送されたグリッドパターンを示しています。転送されたグリッドのパタパタは樹脂ブロックに逆であることに注意してください。SCAL電子バーは1200μmである。 <img src="/files/ftp_upload/3650/3650fig4.jpg" alt="図4"/> 。図4マイクロインジェクション相関光と電子顕微鏡からの代表的な結果をパネルレーザーエッチングされたガラスグリッド·カバースリップ上で生育NRK細胞の明視野顕微鏡写真を示し、矢印は、パネル内のCDのCLEMによって可視化される二つのセルを示すパネルBは蛍光を示す。不活性トラッキング色素の、このケースでは、カスケードブルー、顕微注入した細胞を識別するために使用される。 パネルCは、明視野の重ね合わせとローダミン標識小分子の蛍光シグネチャを示しています。ここに示されている2つのセルはA＆B パネルDは明視野、蛍光および電子顕微鏡のCLEMを表すパネルの矢印で示されます。矢先は蛍光punctaはパネルEで高倍率で結像を示しスケールバーは次式のとおりです。安値：パネル＆Bは100μm、C＆Dは50μm、E、100nmである。

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<li>Selyunin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly+of+a+GTPase-kinase+signalling+complex+by+a+bacterial+catalytic+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold.</a> Nature. 469, 107-111 (2011).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されていません。

ここで紹介する方法は、真核生物の細胞質に精製されたタンパク質、核酸、または小分子を直接配信することを可能にし、蛍光および電子顕微鏡の相関関係により超高分解能分析を与える。このメソッドの使用方法はシンプルなもので、様々な既存のコア施設及び/または適切に装備され、電子顕微鏡の研究室で、社内で行うことができます。技術は、ユーザがリアルタイムで蛍光標識された分子のダイナミクスを監視するため、タイムラプス顕微鏡と共に使用され、断層電子顕微鏡に相関させることができるので、また、生細胞に適している。 予備的実証試験が最適な細胞集密度、注入物質の適切な量のマイクロインジェクションの効率化と配信、フルオロフォアおよび注入/トラッキング色素の最適化（s）、および可用性および/または電子MICRための専門知識を決定するために、実験のすべての段階で実施すべきであるoscopy分析。 CLEMの手順のすべてのステップで注入されたセルを配置すると、このプロトコルに重要です、そして、したがって、それはカバーガラスの中央付近英数字グリッドに増殖している細胞が両方共焦点に試料が文書化される可能性を高めるために選択す...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>フォトエッチングカバーガラスとライブセルプレート</td><td>マテック</td><td> P35G-2-14-CGR​​D </td><td></td></tr><tr><td>テキサスレッド</td><td>インビトロジェン</td><td> D3329 </td><td></td></tr><tr><td>カスケードブルー</td><td>インビトロジェン</td><td> D7132 </td><td></td></tr><tr><td>ローダミン標識キット</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 53002 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μmの遠心ろ過ユニット</td><td>ミリポア</td><td> UFC30GV00 </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスピペット</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> BF100-50から10 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td>モデルP-97 </td><td>ランプテストを実行した後にプログラム＃4を使用</td></tr><tr><td> FemtoJetのマイクロインジェクションシステム</td><td>エッペンドルフ</td><td> Injectman NI2 </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップの除去液</td><td>マテック</td><td> PDCFのOS 30 </td><td></td></tr><tr><td> Technai透過型電子顕微鏡</td><td> FEI </td><td> Technai G2 BioTWIN </td><td></td></tr><tr><td> Ultramicrotombe </td><td>ライカ</td><td> EM UC6 </td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロインジェクション分子およびそれらの真核生物の細胞内ターゲットを視覚化するツールに相関光学および電子顕微鏡（クレム）

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

真核細胞は、複雑に依存して高度に規制され、適切な細胞機能のために必要な生化学的な極性を維持する機能的に異なる膜結合コンパートメント。酵素、タンパク質、および細胞骨格成分がこの生化学的分離を支配し、維持する方法を理解することが極めて重要でことである。および/または混乱させる細胞内コンパートメントローカライズする蛍光標識分子の使用は、豊富な知識を得られたと携帯規制の我々の理解を進めてきた。蛍光、共焦点顕微鏡などのイメージング技術は比較的単純蛍光標識小分子の位置を確認し、しかし、非常に小さな構造の分解能は1に制限されます。 一方、電子顕微鏡は、非常に高い解像度で細胞内の形態の詳細を明らかにしたが、その静的な性質は、それが困難な高度に動的なプロを測定することができる精度2,3とcesses。したがって、同じ試料の電子顕微鏡と呼ばれる相関光学および電子顕微鏡と光学顕微鏡との組み合わせ（CLEM）4,5は 、電子顕微鏡6の高解像度を持つ超高速蛍光イメージングの二重の利点が得られる。この強力な技術は、細胞生物学5,7の多くの側面を研究するために実装されています。創業以来、この手順では、高解像度で細胞内のアーキテクチャや形態を区別するために我々の能力を高めている。 ここでは、CLEM（ 図1）に続いて急速なマイクロインジェクションを実行するための効率的な方法を提示します。マイクロインジェクションのCLEMプロシージャが直接真核細胞の細胞質に小分子および/ ​​またはタンパク質の特定の量を導入し、ミリメートルからマルチナノメートルの分解能（ 図2）への影響を研究するために使用することができます。技術はマイクロインジェクションに基づいている細胞は両方共焦点蛍光顕微鏡および電子顕微鏡でライブセルイメージング料理との裏面に貼付レーザーエッチングされたガラスグリッド·カバースリップ上に成長させた。興味のあるセル（複数可）の局在を容易に試料の固定化に使用エポン樹脂に、目的の細胞と一緒に、転送され、電子顕微鏡分析（ 図3）に先立ってセクショニングされるグリッドパターンによって促進される。蛍光およびEM画像のオーバーレイは、ユーザーが同様に関心のマイクロインジェクション分子（ 図4）により誘導される任意の形態学的および/ ​​または微細構造の変化などの細胞内局在を決定することができます。この手法は、マイクロインジェクション試料の性質に応じて、いくつかの時間≤5秒からまでの範囲の時間ポイントに適している。

CLEMの技術はマイクロインジェクション分子の影響を受け、膜、細胞小器官、および細胞内構造の超微形態を分析するように適合されています。このメソッドでは、複数ナノメートルの分解能にミリメートルできるようにマイクロマニピュレーション/マイクロインジェクションの強力な技術、共焦点蛍光顕微鏡、電子顕微鏡を組み合わせたものです。この技術は、多種多様なアプリケーションに適している。

真核細胞は、生化学的な極性を維持する、複雑で高度に制御された機能的に異なる膜結合コンパートメントに依存している...

本実験の全般的な目的は、培養した哺乳類細胞の細胞質に蛍光標識された低分子化合物またはタンパク質を導入し、それによって誘導される形態変化をマイクロメートルからマルチナノメートル分解能で観察することである。まず、グリッドガラスカバースリップ上で哺乳類細胞を培養し、目的の蛍光標識低分子またはタンパク質をマイクロインジェクションによって注入する。次に、細胞をホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡を用いて観察およびイメージングを行う。次に、細胞をグルタルアルデヒドで固定し、切片を作成して染色し、電子顕微鏡を用いて撮影します。最後に、明視野蛍光顕微鏡および電子顕微鏡で得られた画像を統合し、アライメントを行います。最終的に、これらの画像を相関させることで、研究者は標的となる低分子化合物またはタンパク質によって誘発された摂動を高解像度で観察することが可能になります。こんにちは。私はテキサス大学サウスウェスタン医学センター微生物学部門のNeil Alto博士の研究室に所属しているEvan Reddick博士です。本日は、M Clem法、すなわちマイクロインジェクション相関光電子顕微鏡法について解説します。マイクロインジェクションや顕微鏡観察などの単独の手法に対する本手法の主な利点は、グリッド付きガラスカバースリップを使用することで、これらの操作を連携して実施できる点にあります。この格子状のカバーガラスを使用することで、研究者はプロトコルの異なる段階において同一の細胞に戻ることが可能になります。さらに、この手法により、研究者は多種多様な注入可能な低分子化合物や目的のタンパク質によって誘導される細胞内構造の変化を、マイクロメートルからマルチナノメートルの分解能で観察することができます。マイクロインジェクションの準備として、正常ラット腎細胞や不死化子宮頸がん細胞などの培養細胞を、生細胞用ディッシュに固定されたフォトエッチング加工の格子状ガラスカバースリップ上で、37 °C、5% CO2の条件下でインキュベートします。使用する実験スケジュールのタイムラインに応じて、細胞のコンフルエンシーを調整します。プレートが完全にコンフルエントになると、電子顕微鏡でマイクロインジェクションした細胞を特定することが非常に困難になります。したがって、短期間の実験を行う日は約50%のコンフルエンシーに、それ以外の場合は約25%のコンフルエンシーに達するように細胞を播種してください。長時間の実験を行う日に、蛍光標識されたタンパク質、DNA、または低分子化合物を適切なバッファーで調製し、最終容量を50 µLにします。選択した蛍光色素に応じて、Texas redやcascade blueなどのトラッキング色素を添加してください。濃度は0.5～1 mg/mLとなるように添加します。溶液を0.22 micronの遠心フィルターでろ過します。製造元のガイドラインに従ってマイクロインジェクション用ニードルをプルした後、数µLの溶液をニードルの後端に注意深くピペッティングします。倒立顕微鏡に取り付けられた市販のマイクロインジェクション装置のマイクロマニピュレーターアームにニードルを装着します。培養細胞が入ったディッシュを倒立顕微鏡のディッシュホルダーに設置します。フォトエッチンググリッド内で増殖している細胞を探し、そのグリッドの英数字識別子を記録してください。これは以降のすべての手順で使用します。マイクロインジェクションに使用する細胞は、カバーガラスの中央付近に接着しているものを選択し、周辺部のものは避けることが重要です。これにより、後続の電子顕微鏡観察に使用するエポン樹脂センターピースへ、目的の細胞を効率的に転写させることができます。インジェクションアームをカバーガラスの上に手動で下ろし、マイクロマニピュレーターを使用して、針先が細胞表面に軽く触れるまで針を下げます。選択したグリッド内の細胞を1つ飛ばしでマイクロインジェクションします。コンフルエンシー約50%で培養された細胞の場合、600 square micrometerのグリッドあたり約80個の細胞が見込まれ、これにより実験群および対照群合わせて約30から40個の細胞数（N数）が得られます。注入後、ディッシュをインキュベーターに戻し、目的の時間まで保持してから蛍光顕微鏡観察を行います。培地を除去し、室温でPBS中のホルムアルデヒドを用いて細胞を10分間固定します。固定液をXPBSに置換します。次に、選択したグリッドの低倍率および高倍率で明視野画像を5〜10枚撮影し、細胞の配置を記録します。マイクロインジェクションされた細胞を特定するために、不活性インジェクション色素の励起および蛍光波長で蛍光画像を撮影します。共焦点顕微鏡を用い、 previously imaged grid（以前に撮影したグリッド）内のマイクロインジェクションされた細胞の高倍率z-stack画像を収集します。電子顕微鏡を用いて同定する細胞内構造と蛍光画像を相関させるためには、高倍率での観察が必要です。共焦点イメージング後、カバースリップ除去液を使用してディッシュからカバースリップを剥離させ、1×PBSを含む新しい培養ディッシュに細胞面を上にして配置します。その後、電子顕微鏡用の処理に進みます。標準的な電子顕微鏡（EM）プロトコルに従ってください。サンプルの固定、染色、および脱水を行うため、エポキシ樹脂を調製し、カバーガラスの細胞側を下にしてエポキシ樹脂を満たしたチューブの上に配置します。60 °Cで24時間、樹脂を重合させます。カバーガラスをエポキシ樹脂から取り除くため、速やかに液体窒素に浸します。これにより、60 °Cから-196 °Cへの温度ショックを与えます。カバーガラスを樹脂チューブから脱落させます。5〜10分間待機した後、チューブを回収すると、カバーガラスが外れています。解剖顕微鏡下で樹脂の表面を確認し、目的のグリッドを探します。滅菌済みのカミソリ刃またはメスを用いて、目的のグリッドがブロックの頂点にのみ位置するようにEponブロックをトリミングします。ウルトラミクロトームを用いてトリミング済みブロックの連続切片を作成し、標準的なプロトコルに従って酢酸ウラニルとクエン酸鉛を用いて切片をコントラスト染色します。あらかじめ撮影した高解像度蛍光画像を用いて、細胞の相対的な位置関係をガイドとして、電子顕微鏡内で目的の細胞を特定します。電子顕微鏡写真の中で、蛍光シグナルに対応する関心領域を特定します。ヘテロクロマチンの位置や核膜などのランドマークを用いて、どの蛍光Zスタック画像がEMのスライスに対応するかを判断してください。Image JやAdobe Photoshopなどの画像処理プログラムを使用して、蛍光画像の不透明度を50%に下げ、対応するTEM画像に重ね合わせます。表示されているスケールを調整して、画像を位置合わせします。以下は、マイクロインジェクションおよび相関光電子顕微鏡法による結果です。この画像は、レーザーエッチングされたガラスグリッドカバースリップ上で増殖しているNRK細胞の明視野顕微鏡写真を示しています。注入細胞を含むグリッドを識別するために使用される背景文字のbとmに注目してください。矢印は、電子顕微鏡で識別および撮影された2つの細胞を示しています。ここでは、マイクロインジェクションされた細胞を識別するために使用された不活性トラッキング色素のcascade blueの蛍光画像を示します。ここでは、アミン標識小分子の明視野信号と蛍光信号を重ね合わせて表示しています。このパネルは、注入された細胞の明視野、蛍光、および電子顕微鏡像の相関を示しています。矢印は、このパネルで高倍率で撮影された蛍光点を示しています。このビデオを視聴することで、目的のタンパク質をマイクロインジェクションで注入し、マイクロインジェクションCLEM（相関光電子顕微鏡法）を用いて、そのタンパク質が誘発する細胞内形態変化を追跡する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

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