ロックされた核酸のフローサイトメトリー、蛍光その場でハイブリダイゼーション（LNAフロー- FISH）：細菌のsmall RNAの検出のための方法

この手順の全体的な目的は、個々の細菌細胞における細菌RNAの発現を検出することです。まず、5'末端にビオチンTEG修飾を施したロック核酸（LNA）プローブを設計することでこれを達成します。その後、細菌細胞を固定し、dathyl、過炭酸塩またはdsyで処理し、次いで透過処理を行うことで、RNAを変性させ、LNAプローブをハイブリダイズさせます。

第三に、細胞を洗浄し、ブロッキングおよび染色を行います。最後に、フローサイトメトリーにより細胞の蛍光を測定します。これにより、最終的に、時間経過に伴うRNA発現の変化や、集団内の発現変動を評価することが可能です。

この手法は、単一細胞内におけるRNA種の相対的な存在と量、および均一または不均一な集団内でこの発現がどの程度変化するかという重要な疑問に答えるのに役立ちます。現在、この手法は細菌の小型RNA発現のモニタリングに使用されていますが、理論的には、ほぼあらゆる細胞型のRNA検出に使用することが可能です。LNAプローブ配列を設計した後、blastを使用して、プローブが目的のSRNAまたはmRNAにのみ特異的であることを確認してください。

プローブを注文する際、LNAオリゴヌクレオチドの5'末端にビオチンTEG修飾を加えてください。ビオチン修飾は、ストリプトアビジン・コンジュゲートを用いたハイブリダイゼーション後の染色のために必要です。本手法では、ハイブリダイゼーション時にLNAプローブを添加しない「LNAなしコントロール」を含む3つのネガティブコントロールを含める必要があります。

ステップ2は、LNAプローブが標的sRNAにハイブリダイズしているものの、蛍光染料が存在しないためハイブリダイゼーションイベントが検出されない、ダイコントロール（dye control）です。そして3つ目は、非特異的なハイブリダイゼーションをモニタリングするために、存在しないか、あるいは発現していないsRNAを標的とするLNAプローブを用いた、非発現sRNAまたはmRNAコントロールです。まず、目的の細菌を1×10⁸個回収し、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。次に、遠心分離により2300×gで5分間、細菌細胞をペレット化します。

デカンテーションではなく、ピペットを用いて上清を除去します。次に、ペレットを400 µLのPBSに再懸濁し、400 µLのPFA酢酸PBS固定液を加えて細胞をよく混ぜ合わせます。その後、懸濁液を25 °Cで10分間インキュベートします。

細胞を再度遠心分離した後、5分後に一度ボルテックス処理を行います。この時の条件は4,500 ×gで2分間です。ペレットを400 µLのPBSで2回洗浄します。

最後に、ペレットを400 µLのPBSで再懸濁し、固定した細胞を4°Cで最大7日間保存します。まず、固定した細菌細胞サンプル eachに、調製したばかりの0.1% dsy溶液を400 µLずつ加えます。その後、ピペッティングにより細胞溶液を十分に混合します。

この混合物を25 °Cで12分間インキュベートし、その後、細胞を400 µLのPBSで2回洗浄し、調製直後のリゾチーム溶液800 µLを細胞に加えます。細胞とリゾチームの溶液をボルテックスで十分に混合し、時々撹拌しながら25 °Cで30分間インキュベートします。細胞を遠心分離で回収した後、ペレットに調製直後のプロテイナーゼK溶液800 µLを加え、ピペッティングによって再懸濁した細胞溶液を十分に混合します。

細胞を25 °Cで15分間インキュベートし、その途中でボルテックス処理を行います。遠心分離して細胞を回収し、400 µLのPBSで洗浄した後、さらに400 µLのPBSで細胞を再懸濁します。この懸濁液を100 µLずつ4本の独立した1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注し、細胞をペレット化して上清を捨てます。次に、4つのサンプルすべてに100 µLずつのハイブリダイゼーションバッファーを加え、60 °Cで60分間インキュベートします。ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーション混合液に1 mLのSSC plus tween 20（SSCT）を加え、粘性の高いハイブリダイゼーション溶液から細胞を取り出せるようにします。

ペレット化した後、細胞ペレットに200 µLのホルムアミドSSCT溶液を加え、十分に混合します。次に、ヒーティングブロックを用いて、サンプルを65 °Cで30分間インキュベートします。ここで混合物に1 mLのSSCTを加え、再度細胞をペレット化した後、細胞を500 µLのSSCTに再懸濁し、ヒーティングブロック上で40分間インキュベートします。

ペレット化した後、ハイブリダイゼーション済みの細胞のペレットにブロッキングバッファーを200 microliters加え、25 degrees Celsiusで30分間インキュベートします。再度ペレット化し、ダイのないコントロール用として、細胞のペレットにストリップ済みアビジンおよび色素溶液を50 microliters加え、細胞を十分に混合します。ブロッキングバッファーを50 microliters加えます。

すべてのサンプルをサーモミキサーで定速攪拌しながら、25 °Cでさらに12分間インキュベートします。この際、アルミホイルを用いてチューブを遮光してください。次に、500 µLのSSCTバッファーで1回、続いて400 µLのPBS plus tween 20（またはPBST）で1回、細胞を洗浄します。上清を除去した後、100 µLのビオチン化anti-strippinおよびPBSを加え、25 °Cで時々攪拌しながら30分間インキュベートします。この抗体は、前のステップで導入したstrippin DIコンジュゲートに結合します。

次に、細胞を遠心してペレットにし、400 µLのPBSTで2回洗浄した後、ストリップ済みのavidおよび染料溶液50 µLを細胞に加えて2回目の染色を行い、十分に混合します。このステップは、染料なしコントロールにおけるハイブリダイズしたLNAプローブあたりの信号出力を増加させます。再度、ブロッキングバッファーのみを50 µL加え、その後、すべてのチューブをサーモミキサーを用いて25 °Cで12分間、定常的に混合しながらインキュベートします。

染料溶液でインキュベートした後、細胞を500 µLのSSCTバッファーで再度洗浄し、2回目の洗浄後に400 µLのPBSTで1回洗浄します。ペレットを200 µLのPBSTに再懸濁し、フローサイトメトリー分析を行うまで細胞を4 °Cで保存します。サイズの小さい細菌細胞については、コアサイズを小さくするために、フローサイトメーターの流速を「低速（slow）」に設定してください。さらに、前方散乱光の閾値カットオフがあるフローサイトメーターでは、小さい細菌細胞を確実に検出できるよう、カットオフをできるだけ低く設定してください。

上述の条件を用いて、効果的に固定および透過処理が行われた細胞の例を、こちらのフローサイトメトリードットプロットに示します。透過処理後、細胞集団は小さく均一であり、細胞凝集がほとんどないことを示しています。しかし、より高濃度のリゾチームを使用すると、細胞は凝集しやすくなり、このドットプロットに見られるように、より大きな粒子を示す前方散乱角（FSC）の値が上昇します。

ここでは、LNA flow fish実験に成功した際のフローサイトメトリーデータの例を示します。ヒストグラムは、3つのネガティブコントロールとともに、標的SRNAが特異的に検出されていることを示しています。紫色の「no die」ネガティブコントロールが最も低い蛍光を示し、次に青色の「no LNA」、赤色の「non expressed SRNA」ネガティブコントロールの順に続いています。

最終的に、SRNA特異的なLNAプローブを用いたサンプルが、黒色において最大の蛍光を示します。この手法に習熟すれば、正しく実施することで約6時間で完了させることが可能です。さらに、本手法はR-T-P-C-Rよりも多くの情報を得ることができ、コスト効率にも優れています。

この手順に従い、他のHAPSで追加のプローブをラベル付けし、ハイブリダイゼーションステップで添加することで、マルチプレックスRNA検出が可能になります。