ロックされた核酸のフローサイトメトリー、蛍光その場でハイブリダイゼーション（LNAフロー- FISH）：細菌のsmall RNAの検出のための方法

小説ハイスループット法は、ロックされた核酸プローブとフローサイトメトリー、蛍光を用いて、単一の細菌細胞からの検出と小さなRNAとmRNA発現の相対定量を可能にすることが記載されている

この手順の全体的な目標は、個々の細菌細胞における細菌RNAの発現を検出することです。これは、まず、5つのプライムエンドにビオチンTEG修飾を施したロックされた核酸またはLNAプローブを設計することによって達成されます。その後、細菌細胞を固定し、ダチル、過炭酸塩、またはdzyで処理し、次に浸透させると、RNAが変性し、LNAプローブがハイブリダイズされます。

第三に、細胞を洗浄し、ブロックし、染色します。最後に、細胞の蛍光をフローサイトメトリーで測定します。最終的には、経時的および集団内のRNA発現の変化を評価できます。

この方法は、単一細胞内のRNA種の相対的な存在と存在量、およびこの発現が均質または不均一な集団内でどの程度変化するかに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は現在、細菌のsmall RNA発現のモニタリングに使用されていますが、理論的には、潜在的に任意の細胞タイプのRNAを検出するために使用できます。LNAプローブ配列を設計した後、ブラストを使用して、プローブが目的のSRNAまたはmRNAのみに特異的であることを確認します。

プローブをご注文の際は、LNAオリゴヌクレオチドの5つのプライムエンドにビオチンTEG修飾を添加してください。ビオチンの高揚感は、ストリップされたアビッドおよびジコンジュゲートによるハイブリダイゼーション後の染色に必要です。メソッドには 3 つのネガティブコントロールを含める必要があります (1 A、ハイブリダイゼーション中に LNA プローブを添加しない LNA コントロールはありません)。

ステップ2、LNAプローブがターゲットSRNAにハイブリダイズされるが、蛍光染色がないためにハイブリダイゼーションイベントが検出されないノーダイコントロール。そして3つ目は、非特異的ハイブリダイゼーションを監視するために、存在しないまたは発現していないSRNAを標的とするLNAプローブを利用する非発現SRNAまたはmRNAコントロールは、目的の細菌の10〜8番目の細胞を1回回収し、それらを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移すことから始まります。次に、遠心分離後5分間、細菌細胞をGの2300倍でペレット化します。

上清は、デカンテーションではなくピペッティングで除去します。次に、ペレットを400マイクロリットルのPBSに再懸濁し、400マイクロリットルのPFA酢酸PBS固定液を加え、細胞をよく混合します。次に、懸濁液を摂氏25度で10分間インキュベートします。

細胞を再びスピンダウンした後、5分後に一度ボルテックスします。今回は4、500倍のGで2分間。ペレットを400マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。

最後に、ペレットを400マイクロリットルのPBSに再懸濁し、固定した細胞を最大7日間4度で保存します。まず、400マイクロリットルの新たに調製したポイント、1%dsy溶液を各固定細菌細胞サンプルに加えます。次に、ピペッティングで細胞溶液をよく混合します。

この混合物を摂氏25度で12分間インキュベートし、次いで400マイクロリットルのPBSで細胞を2回洗浄した後、新たに調製したリゾチーム溶液800マイクロリットルを細胞に加える。細胞リゾチーム溶液をボルテックスして十分に混合し、時折混合しながら細胞を摂氏25度で30分間インキュベートします。細胞をスピンダウンした後、調製したばかりのプロテイナーゼK溶液800マイクロリットルをペレットに加え、再懸濁した細胞溶液をピペッティングで完全に混合します。

細胞を摂氏25度で15分間インキュベートし、インキュベーション期間の途中でボルテックスした後、スピンダウンして細胞を400マイクロリットルのPBSで洗浄し、細胞を別の400マイクロリットルのPBSに再懸濁し、懸濁液100マイクロリットルを4つの別々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに追加し、細胞を口蓋にして上清を廃棄します。次に、4つのサンプルすべてを100マイクロリットルのハイブリダイゼーションバッファーにそれぞれ60分間インキュベートします。ハイブリダイゼーションに続いて、1ミリリットルのSSCとtween 20またはSSCTをハイブリダイゼーション混合物に加えて、粘性ハイブリダイゼーション溶液から細胞を除去できるようにする。

ペレット化後、細胞はペレットに200マイクロリットルのフォームアミドSSCT溶液を加え、完全に混合します。次に、サンプルを摂氏65度で30分間、加熱ブロック内でインキュベートします。次に、混合物に1ミリリットルのSSCTを加え、細胞をもう一度ペレット化した後、細胞を500マイクロリットルのSSCTに懸濁し、細胞溶液をヒートブロック上で40分間インキュベー

ペレット化後、ハイブリダイズした細胞は、ペレットにブロッキングバッファーを200マイクロリットル加え、次いで細胞を摂氏25度で30分間インキュベートする。ペレット化後、細胞は再び50マイクロリットルの剥離されたアビッドおよび色素溶液をペレットに加え、細胞を完全に混合して色素なしの制御を行います。ブロッキングバッファーを50マイクロリットル追加します。

すべてのサンプルを摂氏25度でさらに12分間インキュベートし、サーモミキサーで一定に混合し、アルミホイルを使用してチューブを光から保護します。次に、細胞を500マイクロリットルのSSCTバッファーで1回、400マイクロリットルのPBSと20またはPBSTで1回洗浄します。上清を除去した後、100マイクロリットルのビオチン化抗薬、ストリピン、PBSを摂氏25度で30分間加え、時折混合すると、この抗体は前のステップで導入したストリッピンDIコンジュゲートに結合します。

次いで、400マイクロリットルのPBSTで細胞を2回ペレット化して洗浄した後、50マイクロリットルの除去したアビッドおよび色素溶液を細胞に加えて2回目を染色し、十分に混合する。このステップにより、ハイブリダイズLNAプローブあたりの信号出力が増加し、色素を使用しない制御が可能になります。再度、ブロッキングバッファーのみを50マイクロリットル加え、次にサーモミキサーで一定の混合を行いながら、すべてのチューブを摂氏25度で12分間インキュベー

色素溶液とインキュベートした後、細胞を500マイクロリットルのSSCTバッファーで再度洗浄し、2回目の洗浄後に400マイクロリットルのPBSTで1回洗浄します。Resusは、ペレットを200マイクロリットルのPBSTに懸濁し、フローサイトメトリー分析の準備が整うまで細胞を摂氏4度で保存し、小さな細菌細胞のフローサイトメーターの流量を遅くしてコアサイズを小さくします。さらに、前方散乱閾値カットオフを備えたフローサイトメーターの場合は、小さな細菌細胞が検出されるように、カットオフをできるだけ低く設定します。

このフローサイトメトリーのドットプロットでは、今説明した条件を使用した場合、固定され、効果的に透過する細胞の例が示されています。浸透の場合、細胞集団は小さく均質であり、細胞凝集体が少ないことを示しています。ただし、高濃度のリゾチームを使用すると、このドットプロットに見られるように、細胞が凝集し、より大きな粒子を示す前方散乱値の増加を示す可能性が高くなります。

ここでは、成功したLNAフローフィッシュ実験からのフローサイトメトリーデータの例を示しています。ヒストグラムは、ターゲットSRNAの特異的検出と3つのネガティブコントロールを示しています。紫色のノーダイネガティブコントロールは蛍光が最も少なく、次いでLNAなし、非発現SRNAネガティブコントロールはそれぞれ青と赤で続きます。

最後に、SRNA特異的LNAプローブを使用したサンプルは、黒色で最大の蛍光を発します。このテクニックを習得すると、正しく実行すれば約6時間で実行できます。さらに、この手法は R-T-P-C-R よりも多くの情報を提供し、費用対効果が高くなります。

この手順に続いて、追加のプローブを他のHAPSで標識し、ハイブリダイゼーションステップで追加して、マルチプレックスRNA検出を有効にすることができます。