IBDのDSS誘発モデルにおける腸炎の調査

炎症性腸疾患の実験モデルは、私たちは病因に関連する複雑な自然免疫と獲得免疫応答を検討することを可能にした。組織学的スコアリング、炎症性サイトカインおよびミエロペルオキシダーゼ活性の定量化を使用して、一つは炎症性腸疾患に見られるこれらの応答を評価するために始めることができます。

この手順の全体的な目標は、炎症に応答して生成される骨髄ペルオキシダーゼ活性と炎症誘発性サイトカインの量を決定することにより、デキストロン硫酸ナトリウムによって誘発される腸の免疫応答を評価することです。まず、マウスではDSS SALT溶液を飲料水に導入することでDSS大腸炎を誘発します。次に、大腸炎の疾患の重症度を巨視的スコアリングによって評価し、さらなる分析のために結腸を切除します。

次に、解剖された結腸を組織学、サイトカイン定量、およびNPO活性のために3つの部分に切片化します。最後に、結腸組織を均質化し、上清を使用してMPO活性を決定します。最終的には、MPO活性の変化は、分光光度計を使用して収集された吸光度データを通じて決定できます。

この方法は、DSSやTNBS誘発性大腸炎など、炎症性腸疾患のさまざまなモデルの慢性情報に関する洞察を提供できます。さらに、この方法は、手順を開始する前に、肺や肝臓などの他の臓器で使用できます。各マウスケージ内の飲料水をDSS溶液に交換して、炎症を誘発します。

コントロールマウスにDSSなしでオートクレーブ飲料水を与えます。次に、実験の日に、以前にWhitham WilliamsとWilliamsによるJoVEの記事で示したように、結腸を解剖します。曲がったピンセットを使用して結腸全体から糞便を慎重に絞り出し、滅菌PBSで組織をすすいで計量紙に集めます。

一対の鉗子を使用して糞便を押し下げて便を評価し、その一貫性を判断して、糞便中の血液のスコアを決定します。糞便の色に注意し、さらに血液カルトテストを使用して評価を検証し、これは血腫紙に便を塗りつけ、現像剤を追加し、次に青色をメモして、血液の便検査が陽性であることを示します。次に、この表を使用して、各条件の値を決定します。

次に、結腸の近位から遠位への向きを維持しながら、結腸を3等分します。次に、結腸の近位および中央結腸部分からサンプル断片を採取し、サンプルを個々の1.5ミリリットルのEPHチューブに入れます。大腸炎の重症度の組織学的損傷を評価するには、結腸の最も遠位の組織切片を使用し、小さな半分から1センチメートルの長さの断片を切断します。

断片を組織カセットに入れ、カセットを緩衝液10%ホルマリン溶液に浸します。次に、組織片のパラフィン包埋断面を調製した後、盲検化された観察者によるスコアリングのために、切片をヘマチンエオインで染色します。最後に、近位コロン切片と中コロン切片からのサンプルを液体窒素で凍結し、摂氏マイナス70度で使用するまで保存します。

マイナス70°Cの保管から結腸サンプルを取り出した後、氷の上に置きます。次に、曲がった鉗子を使用して目に見える糞便や脂肪を取り除き、ホモジナイザーでの使用に適した個々の2ミリリットルのチューブに入れます。次に、各サンプルの重量を決定して記録します。

次に、各サンプルチューブにホモジナイザービーズを添加し、次に、決定した組織の重量に応じて適切な量のHタブバッファーをチューブに加え、フラグメントを組織ホモジナイザーで30ヘルツで4分間解離します。最後に、細胞溶液をGの400倍、摂氏4度で6分間遠心分離します。上清を新しいチューブに集め、均質化ビーズを保持し、得られたペレットを廃棄するようにしてください。

その後、上清は使用するまでマイナス70度で保存できます。このステップは、事前に調製した組織ホモジネートの7マイクロリットルをトリプリケートで96ウェルプレートに加えることから始めます。次に、調製したばかりのOD Dionヨウ素に50マイクロリットルの希釈過酸化水素を加えます。

マルチチャンネルピペットを使用して、200マイクロリットルの過酸化水素混合物を各ウェルに加えます。次に、分光光度計を使用して550ナノメートルの吸光度を測定し、32秒間隔で3回読み取ります。次に、吸光度データ、組織重量、およびバッファー量を使用して、このサンプル計算で示されているように、ホモジネート中のNPO活性を計算します。

DSS治療の期間中、疾患活動性指数を使用して、疾患の臨床的進行を評価および評価できます。DSSで治療された動物は、初期体重、軟便、便出血と比較して大幅な体重減少を示します。巨視的なシステムよりも実質的であればあるほど、疾患活動指数は高くなります。

マウスの結腸を犠牲にして5%DSSを飲料水に5日間投与したところ、この代表的な実験の結腸長の短縮、結腸出血、糞便出血、便の一貫性の緩み、および直腸出血の徴候の巨視的スコアリングに基づく大腸炎の重症度は、これらのデータによって示されるように、水のみで処理された対照よりも約5倍悪いと判断されました DSS治療の断面から示されています結腸組織サンプルは、HおよびEと同様に、水処理された対照よりも組織学的スコアが高くなります。ここでは、水のみを受け取った対照動物から収集されたこのhおよびe染色断面のアスタリスクで示される領域に、正常な構造と細胞浸潤の欠如が見られます。次に、A DSS処理動物からのサンプルのこのh染色とe染色を前の図と比較します。

この動物の結腸は、ポンド記号で示される細胞浸潤の増加と、杯細胞の枯渇と歪みの増加によって証明されるように、より多くの組織学的損傷を示します。アスタリスクで示されているKcryptアーキテクチャの損傷。DSSで治療したマウスにおける疾患の重症度の程度をさらに特徴付けるために、NPO活性、炎症の代理マーカーを均質化された結腸組織サンプルから評価することができます。

予想通り、DSSで治療された結腸は、対照よりもNPO活性が高い。さらに、DSS誘発性大腸炎の重症度は、IL 1、β、IL 6、TNF αなどの炎症誘発性サイトカインのレベルの増加と関連しています。この手順を試行する際、MPOのアクティビティは時間の経過とともに減少する可能性があることを覚えておくことが重要です。

したがって、MPOアッセイは、腸の炎症の重症度を判断する際に最初に実施されるアッセイの1つである必要があります。