X線CTを用いたマウス肥満モデルにおけるセグメンテーションおよびFATボリュームの測定

この手順の全体的な目的は、生存しているマウスの脂肪含有量を非侵襲的に定量化し、可視化することです。これは、まずマウスのX線CTスキャンを行うことで達成されます。手順の第2ステップでは、放射線密度に基づいてマウス体内の脂肪量をセグメンテーションし、定量化します。

第3のステップは、CTデータを3次元で可視化し、脂肪量を赤色で強調表示することです。最終的に、albia X-ray ctとPMODおよびvol viewソフトウェアパッケージを併用することで、in vivoでの縦断的研究における脂肪含有量の定量化と可視化が可能になります。Ex vivo分析などの既存の手法に対するこの技術の主な利点の一つは、小動物の疾患モデルにおいて、非侵襲的かつ縦断的な脂肪評価が可能になることです。

一般的に、この手法に不慣れな方は、セグメンテーションおよび可視化プロトコルに連続して完了させるべき複数のステップが含まれているため、苦労することがあります。さらに、撮影時には最適なX線パラメータを利用する必要があります。脂肪組織から最高のコントラストを得るには、まず誘導チャンバーを用いて対象となる肥満マウスを麻酔し、その後ノーズコーンへと移してください。

撮像中の麻酔を維持し、マウスの四肢を体幹の外側に向けた状態で標準的なラット用ベッドに配置します。これにより、均一なCT収集が可能になります。CTシステムを、600回の投影を用いて115 mmの長さのベッドをスキャンするように設定します。

X線源を200 microampsおよび45 kilovolt peakに設定し、0.5 millimeterのアルミニウムフィルターを用いてビームを硬化させます。この設定でマウスが受ける等価深部線量は約220 milli seaversであり、コンピュータ上の等価浅部線量は357.4 milli seavertとなります。画像再構成には、標準パラメータを用いたFBPアルゴリズムを選択してください。

最終的に、最終画像は125 micronの等方性ボクセルで構成され、個体全体の画像解析に使用できます。画像解析はPMOD解析ソフトウェアを用いて行われ、まずPMODが組織密度に応じて画像をセグメント化し、次に脂肪量を算出します。画像を読み込んだ後、計算負荷を最小限に抑えるために画像サイズを縮小してください。

メインビュータブに移動し、[ツール]から[リデュース]を選択します。リダクション値をXに2、Yに2、Zに2に設定し、確認して置換し、プロセスを実行します。プロセスが完了すると、メッセージボックスが表示されます。

画像からベッドおよびノーズコーンの要素を除去するため、VOI解析の前にそれらをマスクします。プレーンレイアウト、回転、ミラー3Dマーカーに移動し、プレーンおよびレイアウトを選択します。「Zプレーンを表示」を選択し、次にZプレーンでノーズコーンまでスクロールします。

次に、メインのVOIタブを選択し、頂点の描画（draw vertices）を選択します。ベッドとノーズコーンを除いた、ノーズの周囲にROIを描画し、各ROIに実際のROIをコピー（copy actual ROI to each other）を選択します。ノーズコーン要素でスライスします。

必要に応じて、バッファからROIを鼻の上に貼り付けます。「頂点グループの編集」コマンドを使用してROIを調整してください。鼻のコーンが見えなくなった時点で、ROIを削除し、動物の胴囲を囲むVOIを作成します。

VOIツールに移動し、「masking」および「algebra」を選択します。表示されたダイアログボックスに-1000を入力してください。次に、「Mask voxels outside the selected vois」と記載されたボタンを選択します。

「データの不可逆的な操作が行われます。続行しますか？」というメッセージが表示されたら、「はい」を選択します。次に、[planes layouts]、[rotations]、[mirror 3D markers]、最後に [planes and layouts] の順に移動します。[show all planes] を選択してください。

VOIの完全性を確認します。VOIが適切であれば、解析ファイルとして保存し、ファイル名の接頭辞を変更します。続いて、動物の総体積を算出するための画像セグメンテーションに進みます。

まず、「tools」および「external」を選択します。次に、「segmentation」のチェックボックスを選択します。範囲に-300から+3,500を入力し、セグメンテーションを実行します。

次に、全容積を表す統計情報を報告するVOI statisticsを選択します。この容積を記録してください。次に、まずセグメンテーションされていないマス画像に戻り、脂肪容積のために画像をセグメント化します。

次に、保存した質量データファイルをロードし、ロードウィンドウ内の「analyze（解析）」ボックスにチェックを入れます。次に、「tools（ツール）」と「external（外部）」を選択します。その後、「segmentation（セグメンテーション）」チェックボックスを選択してください。

-200から-50の範囲を入力し、セグメンテーションを実行します。結果を承認した後、VOI.Statisticsを選択してください。なお、報告される統計値は脂肪量を示すことに留意してください。

解析形式で結果を保存し、一意のファイル名プレフィックスを指定します。ただし、皮膚や末梢部の密度が残っている場合は、VOI解析のためにエロージョンおよびダイレーションプロトコルを用いてこれらの領域を除去してください。保存する前に、「tools external」に移動し、新しいボックス内の「morphological」チェックボックスを選択します。

エロージョンを選択し、次に、形態学的操作のチェックボックスに戻ってダイレーションを選択します。その後、皮膚または周辺密度の問題が解消されているかを確認し、結果を保存してください。セグメント化された画像の3Dレンダリング表示を作成するために、ソフトウェアパッケージのVolvo viewバージョン3.2を使用します。

まず、解析フォーマットで保存されたCTデータセットを開きます。ポップアップウィンドウではデフォルト設定を使用し、次にプラグインメニューを開き、「utility」から「merge volumes」を選択します。「rescale components」のチェックを外します。

「Assign Second input」をクリックします。2番目の入力としてセグメンテーション済みの脂肪データを選択し、ポップアップウィンドウではデフォルト設定のままにします。次にプラグインを適用し、対象マウスの拡大表示を行います。

ボリュームビューウィンドウをダブルクリックします。「color slash opacity」タブに戻ります。「component」ドロップダウンボックスは、現在編集中のデータセットを示しています。

タブの下部に2つのスライダーがあります。これらは0から1の値を用いて、オーバーレイ内の各コンポーネントデータセットの相対的な明るさを決定します。例えば、色をグレースケールに変更するには、「scalor color mapping」セクションに移動してください。

スライダーのひとつをダブルクリックし、ボックスの外へドラッグします。スライダーエリア内の任意の場所をクリックして、2つ目のスライダーを追加します。左側のカラースライダーを黒に、右側のカラースライダーを白に設定してください。

次に、スカラー不透明度マッピングボックスに移動し、ボックス内をクリックして新しい点を追加します。これにより、ウィンドウ内の中間点として計3つの点が存在することになります。スカラー値を約-3000に変更し、不透明度値を0に変更します。

ウィンドウの右側にある3番目のポイントのスカラー値を約 32,000 に、不透明度を 0.25 に変更します。1番目のポイントは、不透明度の値が 0 に設定されていれば、左側のどこに配置しても構いません。スカラーを設定した後、コンポーネント2に切り替えます。これにより脂肪の外見を編集できるため、各色のスライダーをダブルクリックし、色相スライダー H を端までスライドさせて赤色に変更します。

これにより、脂肪が赤色に擬似着色されます。CT脂肪像とオーバーレイを表示する3パネルの回転ムービーを作成するには、まず、被験者をマウスでドラッグして、背中がU方向を向くように直立させます。次に、「component weights」の下で、「component two」の値を0に設定し、CTスキャンのみが表示されるようにします。3番目に、「review」をクリックし、続いて「camera」を選択し、回転ムービーのフレーム数を指定します。4番目に、X回転の値を360度に変更します。

ポップアップダイアログボックスで「Create」を選択します。「CT」という名前の新フォルダを作成し、ファイルをTIF形式で保存すると、一連の回転画像が出力されます。脂肪画像および重ね合わせCT画像についても同様の手順を繰り返し、それぞれの回転画像を個別のフォルダに保存します。出力画像から回転ムービーを生成するために、ImageJを開き、画像シーケンスをインポートします。

CTフォルダ内の最初の画像を選択すると、他の画像が自動的に選択されます。脂肪（fat）およびオーバーレイ（overlay）シーケンスについても、各スタックのいずれか一つを用いてこの操作を繰り返します。画面は開いたままにしてください。

ROIマネージャーを開きます。これは「分析ツール（Analyze tools）」の中にあります。ROIマネージャーを使用して、不要な背景ピクセルを除外するように、対象のマウスの周囲にROIを描画します。完了したら、ROIマネージャーの「追加（Add）」をクリックします。

次に、すべての画像シーケンスに同じROIを適用します。ROIがすべてのスタックに適用された状態で、右クリックします。ROIメニューから「duplicate（複製）」を選択し、「select（選択）」します。「duplicate stack（複製スタック）」を確認してください。

これにより、ROIを画像の他の部分から分離します。次に、大きな画像スタックを閉じ、3つの画像シーケンスすべてに対してこの手順を繰り返します。スタックを統合するには、[Stacks]の中の[Tools]にある[Combine]コマンドを使用してください。

スタック1にCTスタックを、スタック2に脂肪スタックを選択します。その後、このプロセスを繰り返します。新しく結合されたスタックをスタック1に、オーバーレイスタックをスタック2に選択します。

これで、3パネルの画像回転スタックの作成が完了しました。画像ウィンドウの左下にある再生ボタンを選択して、スタックをプレビューします。その後、AVI形式のムービーとして保存してください。

Alber CTシステムの実現可能性を示すために、肥満B6VLEOBJマウスを用いた。CTによる脂肪含有量の測定では、これらをC57BL/6野生型と比較した。左図は肥満マウスのCT全ボリュームである。

中央が赤色で示された脂肪量、右側がオーバーレイです。野生型動物で同様の解析を行ったところ、肥満マウスと比較して脂肪含有量に大幅な差があることが示されました。個体ごとに総体積、脂肪量、および体積比を算出しました。

野生型群と肥満群における脂肪量と全体積の平均比は、それぞれ0.09および0.42でした。これらの値は、P値0.001で有意に異なっていました。このビデオを視聴することで、習熟後には、生存マウスのCTデータセット内における脂肪量のセグメンテーション方法について、十分な理解が得られるはずです。

この手技の所要時間は30分未満です。ご視聴ありがとうございました。それでは、また次回にお会いしましょう。