標準的なインクジェットプリンタを使用して一時的な細胞膜孔を作成する

この手順の全体的な目標は、インクジェット印刷を使用して細胞膜に一過性の細孔を作成することです。これは、最初に標準のインクジェットプリンターを変更することによって実現されます。2番目のステップは、バイオインクの挿入を可能にするために、ストックプリンターのインクカートリッジを空にしてクリーニングすることです。

次に、目的の細胞を蛍光タグ付きアクトンモノマーとPBSの溶液に懸濁して、バイオインク溶液を作製します。最後のステップは、改造されたプリンターとカートリッジを使用して、バイオインクを顕微鏡のスライドに印刷することです。最終的には、蛍光顕微鏡を使用して、Fluor 4つの結合Gアクチンモノマーが、一過性の膜細孔を通じてプリンテッド細胞によって取り込まれていることを示すことができます。

この技術が標準的なトランスフェクションや細胞マイクロインジェクション技術と比較した場合の主な利点は、このプリンティング技術が使いやすく、高い細胞生存率が得られることです。この手法は遺伝学への洞察を提供しますが、細胞生物物理学や細胞生物物理学の組織工学など、他の研究分野にも適用できます。この手法は、細胞移動中の細胞の細胞骨格を容易に観察するために使用できます。

この手法は、細胞に加えられた力による細胞骨格の配置の変化を可視化したいと考えていたときに思いつきました。まず、プリンターの下部ベースからプラスチッククリップのロックを解除し、次に上部のプラスチックケースをゆっくりと持ち上げます。次に、ボタンディスプレイライトパネルをプリンターの上部から取り外し、プリンターのマザーボードに接続したままにします。

キムワイプとエタノールを使用。プリンターの内部、特にインクカートリッジが置かれている場所や印刷が行われる場所を清掃します。次に、HP Desk Jet500の給紙メカニズムに電力を供給するケーブルを見つけます。

前面の左側にある用紙トレイのすぐ下にあり、マザーボードからケーブルを抜きます。次に、用紙検出メカニズムを見つけて、印刷用紙送りメカニズムの上下にある灰色のプラスチックレバーにワイヤーループを固定し、手動ハンドルとして機能し、ここにステージを配置します。15本の遠心分離管用の発泡スチロール輸送ホルダーは、給紙機構の前の印刷領域にテープで留められたいくつかの顕微鏡スライドとともに使用され、目的の印刷スライドをカートリッジプリントヘッドのすぐ下のレベルに持っていきます。

最後に、アセプティック技術を維持するために、プリンタを層流フード内に配置します。まず、カートリッジをパッケージから取り出し、プリンタの接点と印字ヘッドを覆っている保護テープを残します。カートリッジの本体をclで安定させますamp ハンドヘルド回転切削ツールを使用して、緑色の上部に障害物がないようにします。

カートリッジの上部から緑色の上部を切り取り、リザーバーに残っているインクをすべて空にしてから、プリンタの接点とプリントヘッドを覆っているプラスチック製の保護テープをはがします。このプロセス中にプリントヘッドから水が漏れる可能性がありますが、カートリッジに害を及ぼすことはありません。水が透明になったら、カートリッジを乾かします。

きれいな印刷環境を維持するには、まずカートリッジを脱イオン水で満たされたビーカーに完全に浸し、次にカートリッジを15分間超音波処理します。超音波処理後、カートリッジを取り外し、余分な水を振り落とします。70%エタノールをカートリッジに噴霧して、より無菌的な環境を作り出します。

目的の細胞を回収した後、15ミリリットルの円錐形遠心チューブ内の5ミリリットルの新鮮な培地で細胞を室温で250倍Gで5分間遠心分離します。次に、培地を吸引し、次いで、新たに調製した蛍光Gアクチンストック溶液中に1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞で細胞を1回再懸濁し、バイオインクを作成するために、バイオインクの250マイクロリットルがここに示す線パターンで3つのカバースリップを印刷することに留意されたい。プリンターの電源を入れてウォームアップした後、ここに目的の印刷面を配置し、前に組み立てたステージの中央に22ミリメートル×22ミリメートルのカバースリップを使用します。

次に、描画ソフトウェアプログラムを開き、目的のパターンを選択します。次に、約100〜120マイクロリットルの細胞懸濁液をカートリッジコンパートメントの下部にある小さな円形ウェルにピペットで入れます。プリンタが再びウォームアップすると、カートリッジが準備完了位置に移動します。

カートリッジがインクのわずかに左に移動すると、インクがしっかりと滴り落ち、そこに留まります。給紙機構に引き上げると、ワイヤーと印刷が始まります。プリンターは、Gアクチンモノマー溶液中の線維芽細胞懸濁液からなるバイオインクを備えたHPデスクジェット500プリンターを使用して、印刷ステージの中央に配置されたカバースリップに印刷します。

HP 26シリーズの内部では、インクカートリッジセルがガラス製の顕微鏡カバースリップに印刷されました。この図は、蛍光アクチンモノマーが組み込まれていることを示す印刷された線維芽細胞の代表的な結果を示しています。このパターンは、前の図で、顕微鏡スライドの大部分に印刷ソリューションの連続線を作成するために使用されました。

この図では、バイオリンクと細胞が相互に沈着した直線を示しています。なお、印刷直後はバックグラウンド蛍光が増加するのは、細胞を懸濁させたバイオリンク溶液に遊離した過剰な蛍光アクチンモノマーが含まれているため、印刷後約10分間細胞をインキュベートすることでスライドへの接着が促進され、新鮮な増殖培地で基材から過剰なモノマー溶液を洗浄することができ、バックグラウンド蛍光が大幅に減少します。ここでは、印刷の15分後に撮影された細胞のこの蛍光顕微鏡写真顕微鏡写真が示すように、局所的な印刷ゾーンで印刷された3つのT型3線維芽細胞の代表的な画像は、緑色でgiin、青色で核、およびGIアクチンと核色素の両方のオーバーレイを示しています。

次の2つの画像は、印刷後3時間後のラインパターンで2つの線維芽細胞の蛍光顕微鏡を示しています。この最初の画像は、細胞内の蛍光標識されたアクチンモノマーを示しています。この 2 番目の画像は、蛍光チャネルと背景画像を重ね合わせたもので、左下隅のスライドに破片が残っている可能性がありますが、蛍光を発しないことを示しています。

最後に、蛍光タグ付きモノマーと3時間インキュベートしたノンプリント細胞の対照群をここに提示し、モノマーが細胞プリンティングによる膜透過なしに細胞膜を貫通できないことを示しています。この手順を試行する際は、プリンターの目詰まりがこの手法の速度を低下させる問題の1つであるため、いくつかのカートリッジをクリーニングして使用できるようにすることが重要です。このビデオを見れば、標準的なデスクトッププリンターを生細胞の印刷に変換し、一過性の膜力を発生させる方法について十分に理解できるはずです。