Name: xCELLigenceシステムにCR51リリースアッセイを比較することによって、人間Her2neu特異的CD8 T細胞の最適な細胞傷害活性を決定する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶインピーダンスベースアッセイによるCD8 T細胞の細胞傷害活性測定法。xCELLigenceシステムを用いてリアルタイムで腫瘍細胞溶解をモニタリングし、従来のクロミウムリリースアッセイと比較するラベルフリー手法です。

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CD8 T細胞が直接4感染または悪性細胞を殺すことができるという、適応免疫応答に重要です。抗原特異的CD8 T細胞（例えばELISPOT、テトラマー、フローサイトメトリー）の数を測定するいくつかの方法があるが、多くの場合、それは、これらの細胞が機能的に3細胞毒性であるかどうかを知ることは有用である。細胞傷害性機能を評価するための最も有名なアッセイは、ゴールドスタンダードアッセイ4みなされるCRA、です。 CRAの主な制限は、放射能の（1）の要件、感度、（2）不足、機械的な情報（3）不足している、細胞の多量のために（4）の要件、および（5）面倒なセットアップです。従って、過去十年間、これらの制限を最小限に抑えるために新たな戦略を採用するに関心があった。新しいアプローチは、それらのそのメジャーカスパーゼリリース4、BLTエステラーゼactivity5、表面CD107 6の発現を含む。現在の原稿は示唆しているロシュxCELLigenceシステム上で実行インピーダンスベースのアッセイも、CRAの代替として有用であり得る。インピーダンスベースのアプローチを適応する能力は、表面にしっかりと付着しないT細胞は、測定したT細胞の直接干渉の任意の関心を減少させるため、インピーダンスに大きな影響を持っているようには見えないという観察に基づいている。インピーダンス測定システムを使用するために必要な労力を大幅に減らす放射能の使用のための規制懸念の除去が主な原因であると予想される。インピーダンスベースのシステムの唯一の顕著な欠点は5万ドルから$ 60,000支出がエクセリジェンスユニットの購入のために必要とされることである。しかし、エクセリジェンス部は、放射線カウンタの必要性を排除し、T細胞の細胞毒性8に加えて、薬物および移行の細胞応答を評価するために有用である、はるかに汎用性があります。 その観察単純な二次関数は、次合理的に急勾配のアッセイが細胞傷害性細胞9の周波数を推定するために、限界希釈アッセイ（のLDA）で使用することができることを示唆して腫瘍細胞インピーダンスの減少は、 図2に示すように、用量依存性である。インピーダンスに基づくアプローチの一つの利点は、必要なT細胞および腫瘍細胞の数は、LDAが潜在的により実現すること、CRA未満であることである。例えば、CRAで、午前1時40分の割合で、ウェル当たり1×10 5腫瘍細胞はウェルあたり4×10 6合計T細胞を必要とするメッキです。しかし、インピーダンスベースのアッセイで、ウェルあたりわずか1.5×10 4個の腫瘍細胞がウェルあたりわずか6×10 5総T細胞を消費する、必要とされている。従って、インピーダンスに基づくアッセイは、85％より少ないT細胞および腫瘍細胞を使用する。この減少は、インピーダンスに基づくシステムは、ここで、tヒト臨床試験において免疫学的監視に適合させることができることを示唆している血描くの彼のボリュームが制限される場合があります。 CRAは、単一の時点に限定されている間も、インピーダンスに基づくアッセイは、ユーザは、最小限の追加労力と細胞と同じ実験で複数の溶解時間点を比較することができ、連続的なリアルタイムデータを収集する。周波数の計算は、潜在的に全体の抗原特異的CD8 T細胞10に機能的な細胞傷害性T細胞の比を確立するテトラマー解析などの機能を測定していない他の戦略と組み合わせることができる。インピーダンスベースのアプローチの最も魅力的な特徴の一つは、他のほとんどのアッセイとは異なり、細胞毒性が潜在的にそれが簡単阻害剤または抗体の使用による細胞の相互作用を研究すること、リアルタイムでモニターすることができる、ということである。別の方法は、ラベリングレジスト腫瘍細胞に適していることである。最後に、非殺さ腫瘍細胞を標識し、滅菌、さらに収穫のままとT細胞耐性細胞の研究はpossibているされていないので、ル。 両方のシステムが特定のT細胞に反応して腫瘍を殺すのデータを提供しながら要約すると、インピーダンスベースのアッセイは、CRAよりも敏感で、より柔軟なプラットフォームを提供します。

<table><tbody><tr><td>Ficoll-Paque Plus </td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td>血液からPBMCを分離するために使用</td></tr><tr><td>RPMI 1640 </td><td>Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>FBS </td><td>Denville Scientific</td><td>FB5001-H</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>Human IL-2 </td><td>eBioscience</td><td>14-8029-81</td><td>T細胞の増殖刺激用</td></tr><tr><td>Human Interferon gamma </td><td>Cell Sciences</td><td>CR2026</td><td>腫瘍細胞におけるMHC発現の刺激用</td></tr><tr><td>HER-2/neu p369-377 peptide </td><td>Mayo Clinic peptide synthesis core</td><td>amino acid sequence KIFGSLAFL</td><td>HLA-A2に結合</td></tr><tr><td>Influenza p58-66 peptide </td><td>Mayo Clinic peptide synthesis core</td><td>amino acid sequence GILGFVFTL</td><td>HLA-A2に結合</td></tr><tr><td>Human CD3/CD28 Dynabeads </td><td>Invitrogen</td><td>111-61D</td><td>非特異的なT細胞の活性化および増殖用</td></tr><tr><td>Chromium-51 </td><td>MP Biomedicals</td><td>62015</td><td>CRA標識試薬</td></tr><tr><td>E-plate </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Group</a></td><td>05469830001</td><td>xCelligenceインピーダンスユニット用</td></tr><tr><td>Luma plate 96 </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>6005630</td><td>Top Count NXTでの放射能測定用</td></tr><tr><td>xCelligence RTCA DP Station </td><td><a href="http://www.aceabio.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Roche Applied Science</a></td><td>RTCA DP</td><td>インピーダンスユニット</td></tr><tr><td>Top Count NXT </td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>C990601</td><td>シンチレーション＆ルミネッセンスカウンター</td></tr><tr><td>Fas Ligand antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>556372</td><td>Fas-Fasリガンド相互作用のブロッキング用</td></tr><tr><td>HLA-A2 BB7.2 antibody</td><td>BD Biosciences</td><td>551230</td><td>HLAクラスIのブロッキング用</td></tr><tr><td>Mouse IgG2b, &amp;#954;</td><td>BD Biosciences</td><td>555740</td><td>HLAクラスIのアイソタイプコントロール</td></tr><tr><td>SKBR3 tumor line</td><td>ATCC</td><td>HTB-30</td><td>腺癌</td></tr><tr><td>MCF7 tumor line</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>腺癌</td></tr><tr><td>HCC1419 tumor line</td><td>ATCC</td><td>CRL-2326</td><td>原発性導管癌</td></tr><tr><td>BT20 tumor line</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td>癌</td></tr></tbody></table>

xcelligenceシステムにcr51リリースアッセイを比較することによって、人間her2neu特異的cd8 t細胞の最適な細胞傷害活性を決定する

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

細胞傷害性CD8 T細胞は、感染又は悪性宿主細胞1の死を誘導することができるT細胞のサブグループを構成している。これらの細胞は、I 2分子の HLAクラスに結合した特定の抗原性ペプチドを認識することができ、T細胞受容体（TCR）と呼ばれる特殊な受容体を発現する。例えば、標的細胞死をもたらすグランザイムとパーフォリンとして溶解分子の産生におけるそれらのHLAクラスI分子結果介して感染細胞または腫瘍細胞の係。そのようなELISPOTまたはフローサイトメトリーなどのアッセイを用いて抗原特異的CD8 T細胞の頻度を決定することは有用であるが、それは細胞毒性アッセイ3を用いてCD8 T細胞応答の強度を確認するためにも有用である。細胞傷害性機能を評価するための最も有名なアッセイは、標準アッセイ4みなされるクロム放出アッセイ（CRA）、です。 CRAは、ガンマ放射線、lの細胞の曝露を含むいくつかの制限を有している再現性の確認応答、および多数の細胞のための要件。過去10年間で、これらの制限を克服するための新たな戦略を採用することに関心があった。新しいアプローチは、それらのそのメジャーカスパーゼリリース4、BLTのエステラーゼ活性5およびCD107 6の表面発現を含む。ロシュxCELLigenceシステムを用いたインピーダンスベースのアッセイは、CRAの代替としての可能性のために本論文​​で検討した。付着腫瘍細胞が電極板に結合したときの電流に対するインピーダンスまたは反対が発生します。腫瘍細胞は死滅し、次の電気インピーダンスを切り離しxCELLigenceシステムによって測定することができる低減される。細胞媒介性死滅を評価するために、インピーダンスベースのアプローチを適応する能力は、T細胞は、ほとんどの表面に強固に付着せず、従って、T細胞の直接干渉の任意の懸念を減少インピーダンスに大きな影響を持っているようには見えないという観察に基づいているととも​​に測定。結果は、インピーダンスに基づくアッセイは、標準CRAに対して増加した感度で抗原特異的細胞傷害性CD8 T細胞のレベルの変化を検出することができることを示している。これらの結果に基づいて、インピーダンスベースのアプローチは、細胞傷害性CD8 T細胞の機能を測定することを目的とCRAの又は他のアプローチへの良好な代替物とすることができる。

クロム放出アッセイ、細胞傷害性T細胞活性を検出するための一般的なアッセイは、いくつかの制限を有する。抗原特異的CD8 T細胞およびヒト乳癌腫瘍ライン、SKBR3を用いて、本資料では、インピーダンスベースのアプローチは、細胞死滅を検出する能力を調べた。

xCELLigenceシステムにCR51リリースアッセイを比較することによって、人間Her2neu特異的CD8 T細胞の最適な細胞傷害活性を決定する

細胞毒性CD8 T細胞は、感染細胞または悪性化した宿主細胞の死を誘導することができるT細胞のサブグループを構成している1。これらの細胞は...

本実験の全体的な目的は、EXOGENシステムを用いたインピーダンスベースの手法とクロム放出試験を比較することにより、細胞傷害性T細胞の活性を決定することです。まず、フィコリンを用いて全血から末梢血単核細胞（PBMC）を分離します。次に、抗原特異的なCD8 T細胞を誘導するため、ペプチド抗原、ヒト組換えIL-2、および放射線照射PBMCとともに、PBMCをウェルに添加します。その後、両方のアッセイにおいて、抗原特異的なCD8 T細胞を腫瘍細胞と共培養し、腫瘍細胞死を誘導します。インピーダンス法とクロム放出アッセイの両方を用いて、腫瘍細胞の溶解率の結果を得ます。クロム放出アッセイなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、インピーダンスベースのシステムがリアルタイムのデータを収集でき、さらに、ラベル化を必要としないより少量の細胞で済むことです。本プロトコルでは、メーカーのプロトコルに従い、正常で健康なHLA-A2陽性ドナーからの血液を、PBMC（末梢血単核球）のソースとして使用します。F call PA plusを用いて、血液からP BMCを分離します。次に、6ウェルプレートの各ウェルに、2 mLの培地に含まれる約400万個のP BMCを分注します。各ウェルに、最終濃度が10 µg/mLとなるようにHLAA 2結合ペプチドを添加します。T細胞の刺激および増殖を促すため、隔日で細胞を処理します。最終濃度が 50 units/mL となるように、ヒト組換え IL-2 を添加した新鮮な培地を加えます。1週間後、自己 pbmc の培養液を調製し、細胞を放射線照射した後、同一の hla で 2 時間パルスします。10 µg/mLの2つの結合ペプチドを用い、照射した自己PBM CSを1 mLずつ加えることで、各培養物を再刺激します。1週間後、隔日にIL-2を添加した新鮮な培地を加え続け、同様の方法で2回目の再刺激を行います。さらに6日間培養した後、細胞が使用可能な状態になります。インテリジェンス・インピーダンス測定ステーションを、5% 二酸化炭素条件下、37 °Cで1時間以上平衡化させ、使用準備を整えます。0.25% trypsimを用いて75% コンフルエントに達したヒト腫瘍細胞を回収し、遠心分離を行います。ヘモサイトメーターを用いて腫瘍細胞を計数し、RPMIで再懸濁します。1 µLあたり7,500個の濃度の腫瘍細胞懸濁液を用います。次に、xCELLigenceエージェントソフトウェアで、ウェルレイアウトを含むレイアウトページを設定します。スケジュールページを設定し、40時間にわたって5分ごとにインピーダンス測定を行うようにします。最初の18時間は、xCELLigenceシステムは腫瘍細胞のインピーダンス測定のみを行います。次に、1ウェルあたり100 µLのRPMI腫瘍培地を加えます。細胞がない状態でインピーダンスを測定し、EPLsのバックグラウンド値を測定します。腫瘍細胞を添加した後、プレートをステーションにセットし、測定を開始します。腫瘍細胞はすぐにEPLへ接着し始めます。約18時間のインキュベーション後、腫瘍細胞はEPLに接着し、1ウェルあたり15,000個まで増殖します。この時点で、緩やかなスクレイピングと攪拌遠心により、調製済みのT細胞を回収します。T細胞を10% FBS含有RPMI培地で再懸濁し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。細胞密度が判明したら、200 µLのT細胞を腫瘍細胞に加えた際に、最高濃度が腫瘍細胞1個あたり40個のT細胞となるように、T細胞の2倍希釈系列を調製します。この希釈系列の最終濃度は、腫瘍細胞1個あたり1.25個のT細胞となるようにします。EXOGENステーションを一時停止し、ピペットを用いてEPLを除去します。ウェル内の培地を除去し、陰性対照として希釈系列のすべての濃度を用いたT細胞を200 µLずつ分注します。純粋な培地を用い、EPLをステーションに戻して、アッセイの終了時にプログラムを再開してください。結果を標準化します。chromium 51およびchromium 51で標識した標的細胞を扱う際は、常に機関の放射線安全手順に従い、遮蔽物を使用して放射線曝露を低減してください。まず、腫瘍細胞を1 million cells/mLの密度で、10 µL/mLの新鮮なchromium 51を用いて2時間パルス標識します。次に、腫瘍細胞を10% FBS含有RPMI培地10 mLで洗浄し、遠心分離した後、同培地を用いて1 mLあたり100万個の細胞濃度で再懸濁します。その後、96ウェル丸底プレートに、自発的な放出を算出するために、1ウェルあたり10万個の腫瘍細胞を分注します。これらのウェルのうち6つと、別の6つのウェルには何も加えないでください。残りのすべてのウェルに、細胞を溶解させて最大放出量を算出するため、100 µLのTriton X 100を加えます。あらかじめ調製した希釈系列を用いて、プレートにT細胞を加えます。次に、プレートを5時間インキュベートし、各ウェルから50 µLの上清サンプルを回収します。プレートをフード内で室温で一晩乾燥させた後、サンプルをlumaプレートにロードします。ガンマカウンターを用いてCPMを測定します。T細胞およびSKBR3癌細胞をxCELLigenceプレートで培養し、細胞インデックスを測定しました。T細胞は増殖に接着を必要としないため、細胞インデックスはプレートインピーダンスを反映しています。40時間の培養において、それらがインピーダンスに及ぼす影響は無視できるものでした。がん細胞のみを培養した場合は、インピーダンス測定値の上昇が見られました。しかし、18時間後にT細胞を添加すると、この傾向は消失しました。このイベントは、T細胞の添加後にソフトウェアによる正規化が必要であり、次回の実験でさらに詳しく検討します。SK BR 3細胞をさまざまな濃度のT細胞と共培養したところ、インピーダンスの低下はT細胞の用量に明確に依存していました。データは10時間時点で3回の試行にわたり5分ごとに収集されました。細胞指数はT細胞の濃度範囲において二次多項式に従っており、これはExogenステーションが、細胞指数の低下としてSK BR 3腫瘍のCD8 T細胞媒介性死滅をリアルタイムでモニタリングしていることを示しています。T細胞によるSK BR 3のインピーダンス低下が抗原特異的であるかを確認します。SK-BR-3細胞を、HER2を認識しないHLA-A2陽性のFLU特異的T細胞とともに共培養しました。これらの細胞の溶菌活性は有意に低い結果となりました。HER2特異的T細胞が抗原特異的に殺傷しているかをさらに検証するため、共培養系にFasリガンドに対する抗体を添加しました。その結果、抗体を添加してもHER2 P360-9特異的T細胞の溶菌活性は低下しませんでした。しかしながら、anti CD threeおよびCD 28ビーズで非特異的に活性化されたT細胞を用いた場合、抗体によって溶菌が抑制されたことから、細胞死がHLAクラスI依存的に起こっていることが判明しました。共培養系にanti HLAクラスI抗体またはアイソタイプコントロール抗体を添加したところ、その結果はこの仮説を強く支持するものでした。次に、T細胞を他の癌細胞と1:5の比率で共培養しました。陰性対照として、HLA-A2陰性の腫瘍細胞株BT 20を使用しました。その結果、この手法が複数の標的接着性腫瘍細胞に有用であることが示されました。HER 2つの新しいP 360 9特異的T細胞の共培養物を、クロム51標識標的細胞に添加し、続いてCRA分析を行った。このアッセイは、一貫性を分析する上でより感度が高いと考えられる。アッセイ内変動は、1:40から1:5までの各細胞比における変動係数（%）として算出した。これは、最も低い細胞比において15%未満で測定されました。しかし、CV%は高く、または予測不可能なものでした。さらに、異なるP360.9特異的T細胞株との共培養によるSK-BR-3 T細胞溶解の変動性を検討しました。データは30日おきに生成されました。アッセイは3連で実施され、結果は非常に類似していました。このビデオを視聴することで、インピーダンスベースの手法を用いて、抗原特異的CD8 T細胞と腫瘍細胞による細胞傷害性T細胞活性を決定する方法を十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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