xCELLigenceシステムにCR51リリースアッセイを比較することによって、人間Her2neu特異的CD8 T細胞の最適な細胞傷害活性を決定する

次の実験の全体的な目標は、EXOGENシステムを使用したインピーダンスベースのアプローチとクロム放出アッセイを比較することにより、細胞傷害性T細胞活性を決定することです。最初のステップは、fialを使用して末梢血単核細胞を全血から分離することによって達成されます。次に、PBMCをペプチド抗原、ヒト組換えIL Two、および照射PBMCとともにウェルに添加して、抗原特異的なCD eight T細胞を作製します。

次に、抗原特異的なCD eight T細胞を両方のアッセイで腫瘍細胞と共培養して、腫瘍細胞死を引き起こします。インピーダンス法とクロム放出アッセイの両方を使用して、腫瘍細胞の溶解率を示す結果が得られます。クロム放出アッセイのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、インピーダンスベースのシステムがリアルタイムデータを収集し、ラベル付けを必要としない細胞が少なくて済むことです このプロトコルでは、正常な健康なHLAからの血液 2つの陽性ドナーは、メーカーのプロトコルに従ってpbmcまたは末梢血単核細胞の供給源を提供します。

F call PA plusを使用して、P BMCを血液から分離します。次に、6つのウェルプレートに、ウェルあたり2ミリリットルの培地に約400万個のP BMCをロードします。それぞれに、HLAA 2結合ペプチドをしっかりと添加し、最終濃度を1ミリリットルあたり10マイクログラムの培養にします。

T細胞を刺激し、拡大するのを助けるために隔日で細胞。ヒト組換えIL 2を添加したフレッシュ培地を添加し、最終濃度を50単位/mLにします。1週間後、自家pbmcの培養物を調製し、細胞に放射線を照射し、同じhlaで2時間パルスします。

ミリリットルあたり10マイクログラムの2結合ペプチドを、照射した自家PBM CSをそれぞれに1ミリリットル加えることにより、培養を再刺激します。さて、ILを2回補充した新鮮な培地を隔日で追加し続け、さらに1週間後に同じ方法で培養を再刺激します。さらに6日間の培養後、細胞は使用できるようになります。

インテリジェンスインピーダンス測定ステーションを37%二酸化炭素の下で摂氏5度に少なくとも1時間平衡化することにより、使用するための準備をします。0.25%トリプシンと遠心分離を使用して、75%コンフルエントなヒト腫瘍細胞を採取します。ヘモサイトメーターを使用して腫瘍細胞をカウントし、RPMIで腫瘍細胞を再構成します。

マイクロリットルあたり7, 500細胞の濃度の腫瘍培地。次のプログラムでは、Excelエージェントソフトウェアがウェルレイアウトを使用してレイアウトページを設定します。最初の18時間は、5分ごとにインピーダンスを読み取るようにスケジュールページを設定すると、Xceligentシステムは腫瘍細胞のインピーダンス読み取りのみを行います。

次に、ウェルごとに100マイクロリットルのRPMI腫瘍培地を追加します。セルがない場合のインピーダンスを測定することにより、そこからEPLのバックグラウンド読み取りを行います。腫瘍細胞を追加した後、プレートをそこにロードし、読み取りを開始します。

腫瘍細胞はすぐにEPLに付着し始めます。約18時間のインキュベーション後、腫瘍細胞はEPLに結合し、ウェルあたり15, 000の腫瘍細胞に倍増します。このとき、調製したT細胞を穏やかに掻き取り、攪拌遠心で調製します。

T細胞は、10%FBSを含むRPMI培地でそれらを再構成し、ヘモサイトメーターを使用してカウントします。細胞密度がわかったら、200マイクロリットルのT細胞を腫瘍細胞に添加すると、最高濃度が腫瘍細胞あたり40個のT細胞になるように、T細胞の2倍希釈シリーズを調製します。シリーズの最後の希釈では、腫瘍細胞あたり1.25個のT細胞が得られるはずです。

EXOGENステーションを一時停止し、ピペットを使用してEPLを取り外します。ウェル内の培地を取り出し、希釈シリーズのすべての濃度をネガティブコントロールとして使用して、200マイクロリットルのT細胞をロードします。純粋な培地を使用し、EPLをそこからステーションに戻し、アッセイの最後にプログラムを続行します。

結果を正規化します。クロム51およびクロム51で標識された標的細胞を取り扱うときは、常に施設の放射線安全手順に従い、シールドを使用して放射線被ばくを減らしてください。まず、腫瘍細胞を1ミリリットルあたり100万個の細胞で2時間パルスし、新鮮なクロム51を1ミリリットルあたり10マイクロリットルでパルスします。

次に、腫瘍細胞を10ミリリットルのRPMI培地で10%FBSで洗浄し、細胞を遠心分離し、同じ培地で1ミリリットルあたり100万個の細胞で再構成します。次に、96ウェルの丸い底板に。ウェルあたり100, 000個の腫瘍細胞を追加して、自然放出を計算します。

これらの井戸のうち6つを他の6つの井戸に追加しないでください。100マイクロリットルのTriton X 100を添加して細胞を溶解し、残りのすべてのウェルへの最大放出を計算します。T細胞をプレートに添加するには、あらかじめ調製した希釈シリーズを使用します。

次に、プレートを5時間インキュベートし、それぞれから50マイクロリットルのサンプルを上清に収集し、フード内のプレートを室温で一晩乾燥させた後、サンプルをルミナンスプレートによくロードします。ガンマカウンターT細胞とSKBR3を使用してCPMを測定します。がん細胞をXインテリジェンスプレート上で培養し、細胞指数を測定しましたが、これはT細胞が増殖するために接着を必要としないため、プレートインピーダンスを反映しています。

インピーダンスへの影響は、40時間の培養では無視できる程度でした。がん細胞を単独で培養すると、インピーダンス測定値の増加が示されました。しかし、18時間後にT細胞を追加すると、この傾向が乱れます。

このイベントは、T細胞の添加後にソフトウェアの正規化が必要であり、次の実験でさらに調査されます。SK BR 3細胞をさまざまな濃度のT細胞と共培養したところ、インピーダンスの低下はT細胞の投与量に非常に明確に依存していました。データは、10時間の時点で3回の試行で5分ごとに収集されました。細胞指数は、T細胞の範囲にわたって2次多項式に従い、ExogenステーションがCD8T細胞を介したSK B3腫瘍の死を細胞指数の低下としてリアルタイムで監視し、T細胞によるSK BR 3のインピーダンスの低下が抗原特異的であるかどうかを判断することを示しています。

SK KBRの3つの細胞をHLA Aと共培養した2つの陽性FLU特異的T細胞は、HERの2つを認識しません。これらの細胞は、彼女の2つの新しい特異的T細胞が抗原特異的な方法で殺傷しているかどうかをさらに判断するために、溶解活性が有意に低かった:高速リガンドに対する抗体が共培養に組み込まれました。この抗体は、HERの2つの新しいP 360 9特異的T細胞の溶解活性を低下させませんでした。

しかし、抗CD three、CD 28ビーズで非特異的に活性化されたT細胞では、抗体は溶解を阻害し、HLAクラス1依存的な方法で死滅が起こっているかどうかを判断しました。抗HLAクラス1抗体またはアイソタイプコントロール抗体のいずれかを共培養物に加えました。結果はこの仮説を強く支持しました。

次に、T細胞を他のがん細胞と1対5の比率で共培養しました。HLA A 2つの陰性腫瘍細胞株BT20をネガティブコントロールとして使用した。その結果、この方法は複数の標的接着腫瘍細胞に有用であることが示されています。

HERの2つの新しいP 360 9特異的T細胞の共培養物をクロム51標識標的細胞に添加し、続いてCRA分析を行いました。インテリジェンスアッセイは、一貫性の分析により感度が高いようです。アッセイ内変動は、1〜40および1〜5の各細胞比における変動係数として計算した。

これは、最も低いセル比で15%未満を測定しました。ただし、CVの割合は高かったか、予測不可能でした。さらに、異なるP 360 9特異的T細胞株との共培養によるSK BR 3 T細胞溶解の変動性を調べました。

データは 30 日間隔で生成されました。アッセイはトリプリケートで実施され、結果は非常に類似していました。このビデオを見れば、抗原特異的なCD 8 T細胞とインピーダンスベースのアプローチを利用した腫瘍細胞を用いて、細胞傷害性T細胞の活性を測定する方法についてよく理解できるはずです。