xCELLigenceシステムにCR51リリースアッセイを比較することによって、人間Her2neu特異的CD8 T細胞の最適な細胞傷害活性を決定する

本実験の全体的な目的は、EXOGENシステムを用いたインピーダンスベースの手法とクロム放出試験を比較することにより、細胞傷害性T細胞活性を決定することである。まず、Ficollを用いて全血から末梢血単核細胞（PBMC）を分離する。次に、抗原特異的なCD8 T細胞を誘導するため、PBMCをペプチド抗原、ヒト組換えIL-2、および照射PBMCとともにウェルに添加する。

その後、両方の系において、腫瘍細胞死を誘導するために抗原特異的CD8 T細胞と腫瘍細胞を共培養します。インピーダンス法とクロム放出法の両方を用いて、腫瘍細胞の溶解率の結果を得ます。クロム放出法のような既存の手法に対するこの技術の主な利点は、インピーダンスベースのシステムがリアルタイムデータを収集でき、また、標識を必要としないため、より少ない細胞数で測定可能であることです。本プロトコルでは、製造元のプロトコルに従い、正常で健康なHLA-A2陽性ドナーからの血液をpbmc（末梢血単核細胞）の供給源として使用します。

F call PA plusを用いて、血液からP BMCを分離します。次に、6ウェルプレートの各ウェルに、2 mLの培地に懸濁した約400万個のP BMCを分注します。各ウェルに、最終濃度が10 µg/mLになるようにHLAA 2結合ペプチドを添加します。

T細胞の刺激と増殖を促進するため、隔日で細胞を処理します。最終濃度が 50 units/mL となるように、ヒト組換え IL-2 を添加した新鮮な培地を加えます。1週間後、自己PBMCの培養液を調製し、細胞に放射線を照射した後、同一の HLA で2時間パルスします。

10 µg/mLの2結合ペプチドを、放射線照射した自己PBM CS 1 mLをそれぞれ添加することで、培養物を再刺激します。IL-2を添加した新鮮な培地を隔日で追加し、さらに1週間後、同様の方法で2回目の培養物再刺激を行います。さらに6日間培養した後、細胞が使用可能な状態になります。

インテリジェンス・インピーダンス測定ステーションを、5%二酸化炭素下、37 °Cで1時間以上平衡化させ、使用準備を整えます。0.25%トリプシンと遠心分離を用いて、コンフルエント率75%のヒト腫瘍細胞を回収します。ヘモサイトメーターを用いて腫瘍細胞をカウントし、RPMIで再懸濁します。

1 µLあたり7,500細胞の濃度の腫瘍細胞懸濁液を調製します。次に、xCELLigenceエージェントソフトウェアで、ウェルレイアウトに合わせてレイアウトページを設定します。スケジュールページを設定し、40時間にわたって5分ごとにインピーダンス測定を行うようにします。最初の18時間は、xCELLigenceシステムで腫瘍細胞のインピーダンス測定のみを行います。

次に、1ウェルあたり100 µLのRPMI腫瘍培地を加えます。細胞が存在しない状態でインピーダンスを測定し、EPLsの背景値を読み取ります。腫瘍細胞を添加した後、プレートをステーションにセットし、測定を開始します。

腫瘍細胞は直ちにEPLに接着し始めます。約18時間のインキュベーション後、腫瘍細胞はEPLに付着し、1ウェルあたり15,000個まで増殖します。この時点で、緩やかなスクレイピングと攪拌遠心分離により、調製済みのT細胞を回収してください。

T細胞を10% FBS含有RPMI培地で再懸濁し、ヘモサイトメーターを用いて計数します。細胞密度が判明したら、T細胞の2倍希釈系列を調製します。この際、腫瘍細胞に200 µLのT細胞を添加したときに、最高濃度が腫瘍細胞1個あたり40個のT細胞となるようにします。希釈系列の最後の濃度は、腫瘍細胞1個あたり1.25個のT細胞となるように設定してください。

EXOGENステーションを一時停止し、ピペットを用いてEPLを除去します。ウェル内の培地を除去し、陰性コントロールとして希釈系列のすべての濃度を用いたT細胞を200 µLずつ分注します。純粋な培地を使用し、EPLをステーションに戻して、アッセイの最後でプログラムを再開します。

結果を正規化します。chromium 51およびchromium 51標識標的細胞を取り扱う際は、常に施設内の放射線安全手順に従い、遮蔽物を使用して放射線被ばくを低減させてください。まず、腫瘍細胞を1 million cells/mLの密度で、10 µL/mLの新鮮なchromium 51を用いて2時間パルス標識します。

次に、腫瘍細胞を10% FBS含有RPMI培地10 mLで洗浄し、遠心分離した後、同培地を用いて1 mLあたり100万個の細胞密度で再懸濁します。その後、96ウェル丸底プレートに、自発的放出を算出するため、1ウェルあたり10万個の腫瘍細胞を分注します。

これらのウェルのうち6つには何も加えません。別の6つのウェルにも何も加えません。残りのすべてのウェルに、細胞を溶解して最大放出量を算出するため、100 µLのTriton X 100を加えます。あらかじめ準備した希釈系列を用いて、プレートにT細胞を加えます。

次に、プレートを5時間インキュベートし、各ウェルから50 µLの上清サンプルを回収します。プレートをフード内で室温で一晩乾燥させた後、サンプルをlumaプレートにロードします。ガンマカウンターを用いてCPMを測定します。T細胞およびSKBR3癌細胞をxCELLigenceプレートで培養し、プレートインピーダンスを反映するセルインデックスを測定しました。なお、T細胞は増殖に接着を必要としません。

40時間の培養において、それらがインピーダンスに及ぼす影響は無視できる程度でした。がん細胞のみを培養した場合はインピーダンス測定値の上昇が見られましたが、18時間後にT細胞を添加すると、この傾向は消失しました。

このイベントでは、T細胞の添加後にソフトウェアによる正規化が必要となり、次の方法でさらに検証します。SK BR3細胞を異なる濃度のT細胞と共培養したところ、インピーダンスの低下はT細胞の用量に明確に依存していました。データは3回の試行にわたり、10時間時点で5分ごとに収集されました。細胞指数（Cell index）はT細胞の範囲にわたって2次多項式に従っており、これはExogenステーションが、細胞指数の低下としてSK BR3腫瘍のCD8 T細胞介在性死をリアルタイムでモニタリングしていることを示しています。T細胞によるSK BR3のインピーダンス低下が抗原特異的であるかを確認します。

SK-BR-3細胞を、HER2 neuを認識しないHLA-A2陽性のFLU特異的T細胞と共培養しました。これらの細胞の溶細胞活性は有意に低い結果となりました。HER2 neu特異的T細胞が抗原特異的な形式で殺傷しているかをさらに判断するため、Fasリガンドに対する抗体を共培養系に導入しました。この抗体は、HER2 neu P360-9特異的T細胞の溶細胞活性を低下させませんでした。

しかし、anti CD3/CD28ビーズで非特異的に活性化したT細胞を用いた場合、抗体が溶菌を抑制したことから、殺傷がHLAクラスI依存的に起こっているかを確認しました。共培養系にanti HLAクラスI抗体またはアイソタイプコントロール抗体のいずれかを添加しました。その結果、この仮説が強く支持されました。

次に、T細胞を他の癌細胞と1:5の比率で共培養しました。陰性対照として、HLA A2陰性の腫瘍細胞株BT 20を使用しました。その結果、本手法が複数の標的付着性腫瘍細胞に対して有用であることが示されました。

HER two new P 360 9特異的T細胞の共培養物を、クロム51標識標的細胞に添加し、続いてCRA分析を行った。このアッセイは、一貫性を分析する上でより感度が高いと考えられる。アッセイ内変動は、1:40から1:5までの各細胞比における変動係数（%）として算出した。

これは、最も低い細胞比において15%未満で測定されました。しかし、CV%は高く、あるいは予測不可能な値でした。さらに、異なるP 360 9特異的T細胞株との共培養によるSK BR three T細胞溶解の変動性が検討されました。

データは30日おきに生成されました。アッセイは3回繰り返し行われ、結果は非常に類似していました。このビデオを視聴することで、インピーダンスベースのアプローチを用いて、抗原特異的CD8 T細胞と腫瘍細胞による細胞傷害性T細胞活性を決定する方法について十分に理解できるはずです。