Name: 表面プラズモン共鳴によるホストのサイトゾルへ毒素の転座の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 学ぶ表面プラズモン共鳴を用いて細胞内毒素の動態を定量的に解析する方法。コレラ毒素などの細胞質への移行効率と薬剤阻害を評価し、毒素生物学の理解と治療薬開発に貢献します。

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この作品は、K. TeterにNIHの助成R01 AI073783によって賄われていた。私たちは、原稿の重要な読書のための細胞下分画プロトコルとヘレンBurressの開発の支援のために博士シェーンマッシーに感謝。

1。ジギトニンの準備<ol><li>マイクロ遠心チューブに100％エタノールを500μLを追加し、80℃で10分間に設定されているヒートブロックに配置します。 </li><li>ジギトニンの1％のストック溶液を生成するために加熱されたエタノールを250μLにジギトニンの2.5 mgを溶解する。 </li><li> 0.04％ジギトニンの実用的なソリューションを生成するには、HCN緩衝液（50mMのHepes pH7.5の、150mMのNaCl、2mMのCaCl 2を 、10mMのN -エチルマレイミド、およびプロテアーゼ阻害剤の960μLにジギトニンストック溶液40μLを追加するカクテル）。 </li></ol> 2。セルの中毒と透過私たちの相互転座試験、毒素や細胞株の範囲に適用することができます。以下に、我々は、コレラ毒素（CT）を検出するための詳細なプロトコルを提供しています。手順の概要を図1に提供されています。 <ol><li> HeLa細胞を10％ウシ胎児血清と抗生物質 - 抗真菌剤を添加した1mlのDMEMを含む6ウェルプレートに播種されています37 /ウェルで一晩インキュベーション後1 × 10 6細胞℃を達成するために十分な再現性の検出のための細胞質毒素を生成するには、3つのウェルは、各条件のために必要とされています。 </li><li>一晩インキュベートした後、1 mLのDMEMがガングリオシドGM1の100 ng / mLを含有する培地を交換してください。 CTのGM1受容体はGM1の解決に曝露した細胞の形質膜へのインターカレートされるので、これは、CTの結合部位の数が増えます。 </li><li> 37℃1時間のインキュベーション後° C、GM1含有培地を除去し、DMEMで細胞を2回洗浄する。その後、4℃で細胞を配置· CTの1μg/ mLを含む1 mLのDMEMで30分間を。 </li><li> 37、毒素含有培地を除去DMEMで細胞を2回洗浄し、1 mLのDMEMで細胞をインキュベートします希望の時間間隔（秒）のためのC。 </li><li>各追跡期間の終了時に、PBSで細胞を洗浄し、PBS中の0.5 mMのEDTA 250μLを各ウェルをインキュベートする。細胞は10分間放置<html>室温で分してから、P1000 pipetmanで積極的な粉砕によって6 - ウェルプレートからそれらを削除します。細胞の1つのウェルが収集された後は、よく同じ状態から2番目と3番目とそれを組み合わせる。セルスクレーパーはまた、細胞を収集するために使用することができます。 </li><li>単一のマイクロ遠心チューブに3つの繰り返し井戸（750μL、総容積）から結合細胞懸濁液を置き、5,000 x gで5分間卓上型マイクロでそれを回転させるほぼ同等の大きさの細胞ペレットを、すべての条件のために取得する必要があります。 </li><li>上清を捨て、ジギトニンの0.04％ワーキング溶液100μLで細胞ペレットを再懸濁します。氷上で10分間細胞懸濁液を置きます。 </li><li>卓上微量遠心機で10分間、16,000 xgでジギトニン透過性細胞をスピン。新鮮なマイクロ遠心チューブに細胞質を含む​​上清画分を転送し、細胞小器官を含むペレット画分を保持する。 </li></ol>タイトル&quot;&gt; 3。サンプルの準備<ol><li>細胞質ゾルを含む上清画分を1mLの最終容量にHCN緩衝液で希釈されています。少なくとも1 mLのサンプル容量は、空気を注入する前に500μLのサンプルループからパージされることを保証するために必要です。 </li><li>オルガネラ含有ペレット画分を1％トリトンX - 100を含むHCN緩衝液1 mLに再懸濁する。界面活性剤の添加は、膜の箱に入った毒素のプールを解放するために必要です。 </li><li> 100の濃度は、10、1、0.1 ng / mLので毒素の基準は、HCNのバッファーで調製される。 </li><li>細胞質やオルガネラ分画のパラレルセットは、分画操作の忠実度を確認するために、対照実験のために準備されています。第2節で説明したように生成された画分を4倍速サンプル緩衝液（サイトゾル画分）または1xサンプルバッファー（オルガネラ分画）120μLの20μLに再懸濁する。各画分の相当するボリュームは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、bをプローブしている上清画分の細胞質タンパク質とペレット画分16から19に可溶、常駐ERタンパク質のパーティショニングを実証するためにyをウェスタンブロット分析。 </li></ol> 4。 SPRのスライドの準備<ol><li>ライヘルトSR7000 SPR屈折計は、SPRの実験のために使用されます。 </li><li> SPR測定器で自己組織化単分子膜と金メッキのガラススライドを設定します。 41μL/ minの流速で10分間、スライド上に0.4 M EDCおよび0.1MのNHSのソリューション：センサのスライドを有効にするには、1:1（V V）を灌流。後続のすべてのperfusionsは同じ流速を使用します。 </li><li> EDC削除するには：NHS活性化バッファを、PBS、0.05％ツイーン20（PBST）を含むと5分間プレートを洗浄する。 NHS溶液：プレートはEDCによってuncappingに起因する反応性アミドテザーが含まれています。 </li><li> 15分間20mMの酢酸ナトリウム（pH 5.5）で1:20,000の希釈で活性化さセンサーのスライドを介して抗CTA抗体を灌流。の屈折率の初期ドロップDEXユニット（RIU）はpH変化により発生されます。抗体がセンサーのスライド上でアミド反応性テザーによって捕捉されるため、これはRIUの増加が続きます。 </li><li> 5分のPBST洗浄とセンサーのスライドから未結合の抗体を取り外します。捕捉抗体によって生成RIUの信号は、高原と安定化は、新しい基準信号を提供します。 </li><li> 5分間センサースライド上の灌流1 Mエタノールアミン（pH 8.5）で。このキャップとセンサのスライド上に残っている未結合のテザーを不活性化する。 </li></ol> 5。サンプルのSPR分析<ol><li>ベースライン値、5分間抗体でコーティングされたセンサーで散らすPBSTを確立する。 </li><li> 300秒のためのセンサーで実験サンプルや毒素の標準を灌流。別の200秒のためのセンサー上でバッファと浸み込ませるのPBSTから配位子を削除します。 </li><li>各灌流に続いて、結合した毒素は、pH5.0でPBSTで100秒の洗浄で、センサから削除されます。これは、信号を返します。その初期のベースライン値に、このように別のサンプルが同じセンサーで処理することができます。 </li><li>新しいサンプルをロードする前に、前のサンプルからの残留流体を排出するためのサンプルループを介して少量の空気を押してください。 5.2から5.4に概説した手順を使用して、我々は、ベースラインの信号を実質的に失うことなく、あるスライドで12サンプルまでに実行した。 </li><li>データ分析は、スクラバー2ソフトウェアで実行され、イゴールのソフトウェアは、図の準備のために使用されます。 </li></ol> 6。代表的な結果百日咳毒素（PT）は、そのチェーンの前に細胞表面からERに移動するAB毒素である（PTS1）細胞質ゾル3、12を入力します。図2に示すように、私たちのSPRベースの相互転座試験では、酔ってCHO細胞の細胞質ゾルでPTS1を検出することができた。シグナルは抗PTS1抗体は、宿主の細胞質ゾルの成分と交差反応しなかったが確認unintoxicated細胞、の細胞質から生成されませんでした。市販ブレフェルジンA（BFA）の存在下で酔って細胞からのサイトゾル画分にも肯定的な信号を生み出すことができなかった。 BFAは、ERの転座部位6-8、12、20から25と、このように、細胞質ゾルへのチェーンの配信に毒素の輸送を防ぐことができます。各実行の最後に、結合した毒素は、センサーのスライドから除去されます。この許可された複数のサンプルは、1つのセンサーのスライド上でスクリーニングし、それによって、異なる実験条件で得られた結果との間の直接比較を提供する。 CTは、別のAB型、ER -転位毒素4です。図3Aに、CTA1はCT処理したHeLa細胞から細胞質画分に検出された。これは私たちの方法論が複数の細胞型で動作すると抗鎖抗体が利用できる任意の毒素にも適用できることを強調した。細胞はこのようにそのCTA1を示す、抗CTB抗体（図3B）でコーティングしたSPRセンサー上灌流したときにサイトゾル画分CT -治療からの信号は検出されなかったサブユニットは、セル結合CTB量体は、細胞質ゾルに入るではない。図3Cは、細胞小器官の分画からの信号がサイトゾル画分からの弱い信号に比べてオフスケールであることを示しています。これは、順番に細胞質に達することができる毒素の量を制限するER転座のサイト6、7、へCT輸送の既知の非効率性と一致していた。さらに、細胞小器官の分画はCTのholotoxinだけでなく、小胞体に局在CTA1が含まれているので、オルガネラ分画のための結果のSPR信号がholotoxin関連CTB量体の付加質量だけ膨らみます。従って、それは同じセンサーグラムで細胞小器官と細胞質分画からのデータをプロットするのは実用的ではありません。 私たちのアッセイは、転、細胞質毒素（図4）の時間依存蓄積を監視することができます。細胞を4でCTに暴露した° C、形質膜への毒素の結合が可能ですが、セルに関連した毒素の内在化を防止する温度。サンレモ後に非結合毒素のvalは、細胞を37℃に加温したERへの毒素の輸送および細胞質ゾルへのチェーンの転座の両方が、この温度で​​発生する可能性があります。いいえ毒素は、温暖化後の37℃に細胞質ゾル、15分で検出されなかったこれは、ERから（i）holotoxinの人身売買に必要な遅延時間を反映して、ERで（II）/ Bサブユニットの解離、および細胞質ゾルへの（iii）のチェーンの輸出。細胞質毒素のマイナーなプールは、Cは37℃で30分後に検出された、および細胞質毒素の漸進的に数量が多い場合は、45〜60分の追跡間隔の後に検出された。細胞質毒素の一層のレベルは、このように宿主の細胞質に細胞関連毒素の継続的、長期的な配信を実証、5時間追跡間隔の17日以降に検出された。 私たちのアッセイはまた、細胞質ゾルへの毒素の移行の阻害（図5）を検出することができます。 10％のジメチルスルホキシド（DMSO）、熱disordを防ぐ化学シャペロンによる治療を受けた細胞孤立CTA1サブユニット（T. BanerjeeさんとK. Teter、未発表の観察）のering、未処理の対照細胞と比較して細胞質CTA1の低いレベルを示した。毒素の展開のチェーンは、細胞質ゾル16から18へ移行するための前提条件である、CTA1のDMSO誘発性安定化がそれに応じて小胞体からサ ​​イトゾルへの動きを妨げるので。 SPRの実験から計算された会合速度定数（k a）は灌流バッファ14、15、26のリガンドの濃度に正比例する。従って、それは毒素の濃度の関数としての毒素の基準値kのプロットそのグラフから細胞質毒素の濃度を決定することが可能である。この手順は、図5に示した毒素の転座のDMSO誘発性ブロックを定量化するために使用されていました：毒素の既知濃度から作成した標準曲線は、細胞質CTA1 concentratを計算するために使用された未処理細胞とDMSO処理細胞（図6）は0.1 ng / mLの0.3 ng / mLのイオン。 DMSOによるアンフォールディングCTA1の阻害は、このようにCTA1のERから細胞質に転座の3倍の減少を生成する。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig1.jpg" /> 図1。プロトコルの概要。 （A）、細胞を4℃AB毒素° C、細胞表面に毒素が結合できるようですが毒素のエンドサイトーシスを防止する温度でインキュベートする。毒素のAとBサブユニットはそれぞれ、赤と青の円で表されます。 （B）非結合毒素を培地から除去し、細胞を℃にERにholotoxinのエンドサイトーシスと逆行輸送を促進するために37に加温している。 Holotoxin解離、分離された鎖はER膜内のタンパク質伝導チャネル（S）を通過させることによって細胞質ゾルを入力できるようにERで発生します。 （C）細胞は選択的にプラズマを透過するために、ジギトニンで処理されています膜。 （D）遠心分離は、細胞別の細胞質やオルガネラ画分に分割するために使用されます。細胞質ゾルはジギトニンで生成された孔を通って細胞外に絞られており、上清に位置しています。そのまま、膜結合小器官は、ペレット画分に見出される。 （E）宿主細胞質内毒素チェーンの転プールを検出するために、上清画分を抗鎖抗体をコーティングしたSPRセンサー上灌流される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig2.jpg" /> 図2ホストの細胞質ゾルへのPTS1転座の検出。 CHO細胞はパルスラベル4℃PTの1μg/ mLの30分間でした。次に、細胞を37℃で3時間に追われたも追加（酔って）または5μgのBFA / mLを（+ BFA酔って）含まない° Cで毒素を含まない培地。ジギトニンと形質膜の透過性は、別々のオルガネラや細胞質fractiにパーティションのセルの抽出に使用されていましたアドオン。抗PTS1抗体で被覆したSPRセンサーは、未処理またはBFA処理細胞からPTS1の細胞質プールを検出するために使用されていました。 unintoxicated細胞からのサイトゾル画分をネガティブコントロールとして、センサのスライドを介して灌流しながらPTS1基準は、ポジティブコントロールとして、センサを介して灌流した。各実行の最後に、バインドされたサンプルは、センサーのスライドから除去されました。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig3.jpg" /> 図3。宿主の細胞質ゾルへのCTA1転座の検出。 HeLa細胞のパルスラベルされた4℃の1μg/ CTのmLのCは37℃で2時間に追われたも追加（酔って）または5μgのBFA / mLを（+ BFA酔って）含まない° Cで毒素を含まない培地。ジギトニンと形質膜の透過性は、別々のオルガネラと細胞質分画にパーティションのセルの抽出に使用されていました。 （A）細胞質ゾル画分を抗- CTA抗体で被覆したSPRセンサー上灌流した。知られてunintoxicated細胞から細胞質ゾルをネガティブコントロールとして使用されていた間にCTAの量は、陽性対照として使用した。 （B）BFAの存在下で酔って、細胞から細胞質画分を抗CTB抗体で被覆したSPRセンサー上灌流した。精製したCTB量体は、ポジティブコントロールとしてスライド上に灌流した。 （C）オルガネラの分画を抗- CTA抗体で被覆したSPRセンサーで灌流する前に、1％トリトンX - 100で可溶化した。比較のため、同一の細胞抽出物およびCTAの標準からのサイトゾル画分（1mlの最終容量）もセンサの上に灌流した。すべてのパネルの場合は、バインドされたサンプルは、各実行の終了時に、センサから除去した。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig4.jpg" /> 図4。細胞質ゾルへのCTA1エントリの速度論。毒素のない視野に入っにおけるHeLa細胞パルス標識4℃CTの1​​μg/ mlのCが15、30、45、または37℃で60分間追われた° CM.毒素の転プールを検出するために、ジギトニン透過性の細胞から細胞質画分を抗- CTA抗体で被覆したSPRセンサー上灌流した。 CTAの基準は、同様にセンサーを介して灌流した。各実行の最後に、バインドされたサンプルは、センサーのスライドから除去されました。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig5.jpg" /> 図5。DMSOによるCTA1転座を阻害する。 HeLa細胞のパルスラベルされた4℃の1μg/ CTのmLのCは37℃で2時間に追われたも追加（酔って）または10％DMSOを（+ DMSO酔って）含まない° Cで毒素を含まない培地。毒素の転プールを検出するために、ジギトニン透過性の細胞から細胞質画分を抗- CTA抗体で被覆したSPRセンサー上灌流した。 CTAの基準は（100、10、1、0.1 ng / mL）を陽性対照として、センサを介して灌流した。わずか1〜0.1 ng / mLの標準は、スケーリングの目的のために示されている。 unintoxicateから細胞質ゾルD細胞は、陰性対照として使用した。各実行の最後に、バインドされたサンプルは、センサーのスライドから除去されました。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3686/3686fig6.jpg" /> 図6。細胞質CTA1の計算は、図5からCTAの基準値k個の毒素の濃度の関数としてプロットした。結果として得られる標準曲線は 、k図5に、未処理とDMSO処理細胞における細胞質CTA1の濃度から実験試料の値に基づいて、決定するために使用されていました。未処理細胞質ゾルは、オープンの正方形として表示されます;毒素の基準が満たされた円として提示され、DMSO処理細胞質ゾルは白丸として表示されます。平均± 2つの独立した実験の範囲が示されています。

利害の衝突は宣言されません。

既存の手法との比較私たちのSPRベースの相互転座試験では、ホストの細胞質ゾル中に毒素の配信を検出するための迅速、高感度、および定量的なメソッドを表します。手法は、毒素に放射性標識または他の変更を必要としない、それは抗毒素鎖抗体が利用できる任意の毒素に適用することができます。細胞質ゾルへの毒素の通過を監視するために既存の方法はまた別の細胞質ゾルと膜画11、23、27、28に分割する細胞抽出物の細胞下分画のプロトコルに依存しています。これらのメソッドは、毒素の細胞質プールを検出するためにウエスタンブロットあるいは放射性標識を使用してください。前者のアプローチは、最高の状態で半定量的であり、相対的に貧しい感受性に苦しんでいる。であっても放射標識プロトコルはにより細胞質に到達する毒素の低レベルに、結果を生成するために数週間かかることがあります。放射性標識毒素との定量分析は、相対的な割合を決定することができますが細胞質ゾルに入る細胞関連毒素が、このアプローチは、直接細胞質毒素分子の正確な数を判断することはできません。放射性標識毒素の検出にSPRの毒素検出の感度を比較すると、...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>ジギトニン</td><td>シグマ</td><td> D141 </td></tr><tr><td>エタノール</td><td>アクロス</td><td> 61509-0010 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11995065 </td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>アトランタバイオ</td><td> S11550 </td></tr><tr><td>ガングリオシドGM1 </td><td>シグマ</td><td> G7641 </td></tr><tr><td> CTA </td><td>シグマ</td><td> C2398 </td></tr><tr><td> PTS1 </td><td>一覧</td><td> 182 </td></tr><tr><td> NHS（N -ヒドロキシスクシンイミド） </td><td>ピアース</td><td> 24500 </td></tr><tr><td> EDC（1 - エチル-3 - （3 - ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド） </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 22981 </td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td> SiのGMA </td><td> E0135 </td></tr><tr><td> PBST </td><td>ウマゴヤシ属</td><td> 09-8903-100 </td></tr><tr><td>抗CTAの抗体</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー</td><td> SC - 80747 </td></tr><tr><td>抗CTB抗体</td><td>カルビオケム</td><td> 227040 </td></tr><tr><td>抗PTS1抗体</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー</td><td> SC - 57639 </td></tr><tr><td>屈折計</td><td>ライヘルト</td><td> SR7000、SR7000DC </td></tr><tr><td> SPRセンサのスライド</td><td>ライヘルト</td><td> 13206060 </td></tr><tr><td>注射器ポンプ</td><td>コー​​ルパーマー</td><td> 780200C </td></tr></tbody></table>

表面プラズモン共鳴によるホストのサイトゾルへ毒素の転座の検出

Detection of Toxin Translocation into the Host Cytosol by Surface Plasmon Resonance

ABの毒素は、酵素サブユニットと細胞結合Bサブユニット1で構成されています。これらの毒素は、細胞外環境に分泌されますが、真核生物の細胞質ゾル内のターゲットに作用している。いくつかのAB毒素の細胞表面から細胞質ゾル2-4を入力する前に、小胞体（ER）への小胞のキャリアで旅行。 ERで、毒素や動きの残りの部分から蛋白質導電性チャネルを介して触媒鎖の解離は、その細胞質ターゲット5に到達する。ほとんどの内部化毒素を分解するリソソームにルーティングされるので、表面に結合した毒素のほんの一部はゴルジ装置や小胞体6に達する：ERへの毒素の人身売買は非常に非効率的なプロセスであるため、転、細胞質ゾルのチェーンは検出が困難です。 -12。 ERからの培養細胞の細胞質ゾルへの毒素の移行を監視するには、我々はhighlと細胞下分画のプロトコルを組み合わせて表面プラズモン共鳴（SPR）13から15のy感度な検出方法。毒素処理細胞の形質膜を選択的に続いて抗毒素鎖抗体をコーティングしたSPRセンサー上灌流サイトゾル画分の収集を可能にする、ジギトニン透過化されています。抗体でコーティングされたセンサーは、細胞質毒素のpg / mLの量をキャプチャし、検出することができます。このプロトコルで、それは細胞質ゾルへの毒素のエントリの動態を追跡すると、転座のイベントの抑制効果を評価することも可能です。細胞質毒素の濃度は、センサを介して灌流されているチェーンの規格の既知の量で生成された標準曲線から計算することができます。私たちの方法は、放射性標識またはターゲットの毒素に他の変更を必要としない迅速、高感度、および定量的な検出システムを表します。

このレポートでは、我々は表面プラズモン共鳴は、ホストサイトゾルへ毒素のエントリを検出するために使用される方法について説明します。この高感度の方法は、細胞質毒素の量で定量的なデータを提供することができます、そしてそれは毒素の範囲に適用することができます。

AB毒素は、酵素活性を持つAサブユニットと、細胞結合性を担うBサブユニットから構成されています1。これらの毒素は細胞外環境へと分泌されますが、その作用は...

この手順の全体的な目的は、細胞質に進入する毒素のプールを検出し、定量することです。これを達成するために、まず毒素を4 °Cで宿主細胞の表面に結合させます。次に、未結合の毒素を除去し、細胞を37 °Cに温めます。これにより、毒素が内膜系、そして続いて宿主の細胞質へと移動することが可能になります。細胞への浸透後、ジゴトニンを用いて細胞膜を選択的に透過させます。最終ステップとして、分画遠心法を用いて細胞抽出物を膜画分と細胞質画分に分離します。表面プラズモン共鳴（SPR）を用い、抗毒素抗体をコートしたSPRセンサー上に細胞質画分を灌流させることで、細胞質への毒素の流入を検出し定量します。この手法は、細胞質への毒素流入の効率と速度論、細胞質に流入する毒素量、および細胞質への毒素輸送に対する薬剤による阻害の可能性など、毒素生物学分野における重要な疑問への回答に寄与します。本プロトコルの開始前に、HeLa細胞を一夜培養した後、書面プロトコルに従って細胞毒性試験のためのHeLa細胞を準備してください。培養液を、100 ng/mLのGanglioside GM1を含むDMEM 1 mLに交換し、37 °Cで1時間インキュベートします。これにより、コレラ毒素の結合部位が増加します。これは、GM1溶液にさらされた細胞の細胞膜に、毒素のGM1受容体が挿入されるためです。1時間インキュベートした後、培地を含むGM oneを除去し、DMEMで細胞を2回洗浄します。次に、1 µg/mLのコレラトキシンを含むDMEMを1 mL加え、細胞を4 °Cで30分間静置します。トキシン含有培地を除去し、細胞を2回洗浄します。その後、細胞を1 mLのDMEM中で37 °Cで目的の時間インキュベートします。各チェイス期間の終了時に、細胞をPBSで洗浄し、各ウェルに250 µLの0.5 mM EDTAおよびPBSを加えてインキュベートします。氷上で10分間インキュベートした後、P1000ピペットマンを用いて激しくトリチュレーションを行い、6ウェルプレートから細胞を回収します。1ウェル分の細胞を回収した後、同じ条件の2ウェル目、次いで3ウェル目の細胞と合わせてください。次に、3つの複製ウェルから合わせた細胞懸濁液を、1本のマイクロ遠心チューブに入れます。その後、卓上マイクロ遠心機を用いて、マイクロ遠心チューブを5分間遠心分離してください。5,000 ×g で遠心分離し、すべての条件においてほぼ同サイズの細胞ペレットを得ます。上清を捨て、あらかじめ調製し冷却しておいた 0.04% digitonin 希釈液 100 µL で細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を氷上で 10 分間静置し、卓上マイクロ遠心分離機を用いて 16,000 ×g で 10 分間遠心分離し、digitonin により透過化した細胞を回収します。上清画分を含む細胞質液を新しいマイクロ遠心チューブに移し、オルガネラを含むペレット画分を回収します。SPRトキシン標準品は、HCN緩衝液を用いて110 ng/mL、1 ng/mL、および0.1 ng/mLの濃度で調製します。サンプルは、上清画分を含む細胞質液をHCN緩衝液で希釈し、最終容量を1 mLとして調製します。注入前に500 µLのサンプルループから空気を完全に除去するため、サンプル量は少なくとも1 mL必要です。オルガネラを含むペレット画分は、1% Triton X 100を含む1 mLのHCN緩衝液で再懸濁します。膜に包まれた毒素プールを放出させるには、界面活性剤の添加が必要です。また、分画手順の正確性を確認するための対照実験として、細胞質画分とオルガネラ画分の並行セットを準備します。細胞質画分を20 µLの4倍サンプルバッファーに、オルガネラ画分を120 µLの1倍サンプルバッファーにそれぞれ再懸濁させ、各画分の等量をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分離し、ウェスタンブロット解析によって、細胞質タンパク質が上清画分に、可溶性ER residentタンパク質がペレット画分に分配されていることを示します。SPRスライドを準備するには、まず自己組織化単分子膜を形成させた金メッキガラススライドをSPR装置にセットします。41 µL/minの流速でE-D-C-N-H-S溶液を10分間灌流し、センサースライドを活性化させます。以降のすべての灌流では、同じ流速を使用します。0.05% Tween 20を含むPBSでプレートを5分間洗浄し、E-D-C-N-H-S活性化バッファーを除去します。E-D-C-N-H-S溶液によるアンキャッピングにより、プレートには反応性MIテザーが含まれています。次に、20 mM酢酸ナトリウムで1:20,000に希釈した抗CTA抗体を、活性化させたセンサースライド上に15分間灌流します。pHの変化により、屈折率単位（RIUと略記）の初期低下が見られます。続いて、アミド反応性テザーによって抗体が捕捉されるにつれ、RIUが増加します。センサースライド上の未結合の抗体を、5分間のPBST洗浄で除去します。捕捉された抗体によって生じたRIU信号はプラトーに達して安定し、新たなベースライン信号となります。スライド調製を完了させるため、1 M エタノールアミンをセンサースライド上に5分間灌流します。これにより、センサースライド上に残った未結合のテザーがキャップされ、不活性化されます。RIU信号が増加してベースラインが確立されるため、抗体コート済みセンサーにPBSTを5分間灌流します。次に、実験サンプルまたは毒素標準品をセンサー上に300秒間流します。バッファーからリガンドを除去し、さらに200秒間PBSTをセンサー上に流します。センサーに結合して残っている毒素は、pH 5.0のPBSTによる102回目の洗浄で除去されます。これにより、信号が初期のベースライン読み取り値に戻り、同じセンサーで別のサンプルを処理できるようになります。新しいサンプルをロードする前に、少量の空気をサンプルループに通して、前のサンプルの残留液体を排出してください。データ収集後。データはScrubber 2ソフトウェアで解析でき、図の作成にはIgorソフトウェアを使用できます。百日咳毒素はAB毒素であり、A鎖が細胞質に進入する前に、細胞表面から小胞体へと移動します。SPRベースの転位アッセイにより、毒素に曝露したCHO細胞の細胞質内にPTsが検出されました。非曝露細胞の細胞質からはシグナルが生成されず、これにより抗PTsの特異性が確認されました。ある抗体は、ホスト細胞の細胞質成分と交差反応しませんでした。felden存在下で中毒させた細胞から得られた細胞質画分。Aにおいても陽性シグナルの生成に失敗した。BFAは小胞体（ER）転位部位への毒素輸送を阻害し、その結果、H鎖の細胞質への配送を妨げる。Chole toinは、もう一つのAB型ER転位毒素である。CT処理したhelo細胞の細胞質画分からCTA1が検出されました。これにより、本手法が複数の細胞タイプで機能し、アンチチェーン抗体が利用可能なあらゆる毒素に適用できることが強調されました。CT処理した細胞の細胞質画分をアンチCTB抗体でコーティングしたSPRセンサー上に流したところ、シグナルは検出されませんでした。したがって、CTA1サブユニットとは異なり、細胞結合性のCTBペンタマーは細胞質に侵入しないことが示されました。抗CTA抗体でコーティングしたSPRセンサーへの注入後。細胞質画分からの弱いシグナルと比較して、オルガネラ画分からのシグナルはスケール外となっています。これは、ER転位部位へのCT輸送の効率が低いことが知られており、その結果として細胞質に到達できる毒素量が制限されることと一致しています。転位した細胞質毒素の時間依存的な蓄積をモニタリングすることも可能です。4°Cで細胞をCTに曝露させた後、37°Cに加温して15分が経過した時点では、細胞質に毒素は検出されませんでした。37°Cで30分後、少量の細胞質毒素が検出され、45分および60分のチェイス間隔後には、より多量の細胞質毒素が漸次的に検出されました。これは、細胞に結合した毒素が、宿主細胞の細胞質へ継続的に長期的に輸送されることを示しています。また、このアッセイでは、細胞質への毒素移行の阻害も検出可能です。10% DMSOで処理した細胞では、未処理の毒素投与コントロール細胞と比較して、細胞質様のCT1のレベルが低く、毒素のアンフォールディングが抑制されていることが示されました。鎖状構造は細胞質への移行に不可欠であるため、DMSOによって誘導されたCT A1の安定化は、それに伴い小胞体（ER）から細胞質への移動を抑制した。DMSOによる毒素移行の阻害を定量化するため、既知濃度の毒素から作成した標準曲線を用いて細胞質内のCTA1濃度を算出した結果、未処理細胞では0.3 nanograms per milliliter、DMSO処理細胞では0.1 nanograms per milliliterであった。したがって、DMSOによるCT A1のアンフォールディングの抑制により、ERから細胞質へのCTA1の移行は3分の1に減少した。この手順に従うことで、細胞質中に存在する毒素量と毒素活性との間の直接的な関連性を立証するために、中毒アッセイなどの他の手法を利用することが可能になります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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表面プラズモン共鳴によるセンサーチップを用いた生体分子間相互作用の研究

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単一細胞からのタンパク質分泌物を検出するための局在表面プラズモン共鳴イメージング

迅速な細菌検出用ラベルフリー光学バイオセンサーを導入する。バイオセンサーは、直接的にその表面上に標的細菌の細胞を捕捉するように設計されているナノ多孔質Siに基づいている。私たちは、捕捉プローブとして、多孔質のトランスデューサに固定化モノクローナル抗体を使用しています。我々の研究は、（例えば、細胞溶解など）なし優先検体処理に数分以内に、低濃度の細菌の検出のためのこれらのバイオセンサーの適用可能性を実証する。...

を光学的に検出 E.大腸菌のバクテリア

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タンパク質分析のための継続的な認識パターンを生成する電子舌

表面プラズモン共鳴（SPR）は、リアルタイムでの生体分子相互作用を検出するためのラベルフリー法である。ここで、膜タンパク質のためのプロトコル：技術の長所と短所を議論しながら、受容体相互作用の実験は、記載されている。...

膜タンパク質のリアルタイム測定：受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴を使用した（SPR）

タイプIIIの分泌システムを介した宿主細胞へのエフェクターの転座は、グラム陰性菌の間で一般的な病原性戦略です。転座の定量分析のために、β-ラクタマーゼエフェクター融合ベースのアッセイを適用しました。エルシニア感染細胞では、ベータラクタマーゼによるFRETレポーターの変換をレーザー走査型顕微鏡を用いてモニターします。...

解析<em&gt;腸炎エルシニア</em&gt;エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

このプロトコルの全体的な目標はポータブル、コスト効果の高い、機能的なナノセンサーを合成する、特にターゲットに磁気緩和と蛍光発光モダリティの組み合わせにより病原性細菌の迅速検出。...

E. 大腸菌o157: h7 の食品由来病原体のスクリーニングを使用して磁気蛍光ナノセンサー: 迅速検出

ここでアセンブリと biolayer 干渉計 (結合) による炭疽菌毒素の分解を監視するためのプロトコルを提案する.次のアセンブリ/分解バイオ...

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

プラズモニックナノピンセットは、金ナノ構造の局在化表面プラズモン共鳴を利用して、ナノメートルスケールの光学場内にタンパク質を含む単一のナノ粒子をトラップします。散乱シグナルの変化により、タンパク質の存在とコンフォメーションダイナミクスが明らかになり、フルオロフォアの修飾や表面テザリングなしでのモニタリングが可能になります。...

プラズモニックナノピンセットを用いた単一非修飾タンパク質のコンフォメーションダイナミクスのモニタリング

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Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

学ぶ表面プラズモン共鳴を用いて細胞内毒素の動態を定量的に解析する方法。コレラ毒素などの細胞質への移行効率と薬剤阻害を評価し、毒素生物学の理解と治療薬開発に貢献します。

表面プラズモン共鳴によるホストのサイトゾルへ毒素の転座の検出

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