表面プラズモン共鳴によるホストのサイトゾルへ毒素の転座の検出

この手順の全体的な目的は、細胞質に進入する毒素プールを検出および定量することです。これを達成するために、まず4 °Cで宿主細胞の表面に毒素を結合させます。次に、未結合の毒素を除去し、細胞を37 °Cに加温することで、毒素の内膜系およびその後の宿主細胞質への移動を可能にします。細胞透過後、ジゴトニンを用いて細胞膜を選択的に透過させます。

最終ステップとして、微分遠心法を用いて細胞抽出物を膜画分と細胞質画分に分離します。抗毒素抗体でコーティングされたSPRセンサーに細胞質画分を還流させ、表面プラズモン共鳴（SPR）を用いて細胞質への毒素の進入を検出し定量します。この手法は、細胞質への毒素進入の効率と速度論、細胞質に進入する毒素量、および細胞質への毒素輸送に対する薬剤による阻害の可能性など、毒素生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本プロトコルの開始前に、HeLa細胞を1晩培養した後、書面によるプロトコルの記載に従って、細胞毒性試験用のHeLa細胞を準備してください。

培養液を、100 ng/mLのGanglioside GM1を含む1 mLのDMEMに交換し、37 °Cで1時間インキュベートします。これにより、コレラ毒素の結合部位の数が増加します。これは、GM1溶液にさらされた細胞において、毒素のGM1受容体が細胞膜へとインターカレートするためです。

1時間のインキュベーション後、培地を含むGM oneを除去し、DMEMで細胞を2回洗浄します。次に、1 µg/mLのコレラトキシンを含むDMEMを1 mL加え、細胞を4 °Cで30分間静置します。トキシンを含む培地を除去し、細胞を2回洗浄します。

次に、1 mLのDMEMを用いて、37 °Cで任意の時間、細胞をインキュベートします。各チェイス期間の終了時に、PBSで細胞を洗浄し、その後、各ウェルに250 µLの0.5 mM EDTAおよびPBSを加えてインキュベートします。氷上で10分間インキュベートした後、P1000ピペットマンを用いて激しくトリチュレーション（TRI）を行い、6ウェルプレートから細胞を回収します。

1ウェル分の細胞を回収した後、同じ条件の2番目、次いで3番目のウェルと合わせて統合します。次に、3つの繰り返しウェルから得られた統合細胞懸濁液を、1本のマイクロ遠心チューブに入れます。そして、卓上マイクロ遠心機を用いて、マイクロ遠心チューブを5分間遠心分離します。

5,000 ×gで遠心分離し、すべての条件でほぼ同サイズの細胞ペレットを得ます。上清を捨て、あらかじめ調製し冷却しておいた0.04%ジジトニン作業溶液100 µLで細胞ペレットを再懸濁します。細胞懸濁液を氷上に10分間置き、その後、卓上マイクロ遠心機を用いて16,000 ×gで10分間遠心分離し、ジジトニン処理により透過性となった細胞を回収します。

上清分画を含む細胞質液を新しいマイクロ遠心チューブに移し、オルガネラを含むペレット分画を回収します。SPR toxin標準品は、HCN緩衝液を用いて110 ng/mL、1 ng/mL、0.1 ng/mLの濃度で調製します。サンプルは、上清分画を含む細胞質液をHCN緩衝液で希釈し、最終容量を1 mLとして調製します。注入前に500 µLのサンプルループから空気を完全に除去するため、サンプル量は少なくとも1 mL必要です。オルガネラを含むペレット分画は、1% Triton X 100を含む1 mLのHCN緩衝液で再懸濁します。

膜に包まれた毒素プールを遊離させるには、界面活性剤の添加が必要です。また、分画手順の正確性を確認するための対照実験として、細胞質画分とオルガネラ画分の並行セットを準備します。細胞質画分を20 µLの4xサンプルバッファーに、オルガネラ画分を120 µLの1xサンプルバッファーにそれぞれ再懸濁させます。各画分の等量を硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分離し、ウェスタンブロット解析を行うことで、細胞質タンパク質が上清画分に、可溶性ER内在性タンパク質がペレット画分に分画されていることを示します。SPRスライドを準備するために、まず自己組織化単分子膜を備えた金メッキガラススライドをSPR装置にセットします。

41 µL/minの流速でE-D-C-N-H-S溶液を10分間スライド上に灌流し、センサースライドを活性化させます。以降のすべての灌流では、同じ流速を使用します。0.05%のTween 20を含むPBSでプレートを5分間洗浄し、E-D-C-N-H-S活性化バッファーを除去します。

E-D-C-N-H-S溶液によるアンキャッピングにより、プレート内には反応性MIテザーが存在しています。次に、20 mM酢酸ナトリウムで1:20,000に希釈した抗CTA抗体を、活性化されたセンサースライド上に15分間流します。pHの変化により、屈折率単位（RIUと略記）の初期低下が見られます。

続いて、アミド反応性テザーによって抗体が捕捉されるにつれて、RIUが増加します。その後、5分間のPBST洗浄を行い、センサースライド上の未結合の抗体を除去します。捕捉された抗体によって生成されたRIU信号はプラトーに達して安定し、新たなベースライン信号となります。

スライド調製の最終工程として、1 M の ethanolamine をセンサースライド上に5分間灌流します。これにより、センサースライド上に残っている未結合のテザーがキャップされ、不活性化されます。RIU信号が増加してベースラインが設定されるまで、抗体コーティング済みのセンサーに PBST を5分間灌流します。

次に、実験サンプルまたは毒素標準品をセンサー上に300秒間灌流させます。バッファーからリガンドを除去し、PBSTをさらに200秒間センサー上に灌流させます。センサーに結合したままの毒素は、pH 5.0のPBSTによる102回目の洗浄で除去されます。

これにより、信号が初期のベースライン読み取り値に戻り、同じセンサーで別のサンプルを処理することが可能になります。新しいサンプルをロードする前に、少量の空気をサンプルループに送り、前のサンプルの残留液体を排出してください。データ取得後。

データはscrubber twoソフトウェアで解析でき、図の作成にはIgorソフトウェアを使用できます。百日咳毒素はAB型毒素であり、そのA鎖が細胞質に進入する前に、細胞表面から小胞体へと移動します。

SPRベースの転移アッセイにより、毒性にさらされたCHO細胞の細胞質内にPTsを検出することができました。非曝露細胞の細胞質からはシグナルが生成されず、これによりanti PTsが確認されました。この抗体は、宿主細胞質の成分とは交差反応しませんでした。

felden存在下で毒性にさらされた細胞からの細胞質分画。Aも陽性シグナルの生成に失敗した。BFAは小胞体転位部位への毒素輸送を阻害し、その結果、H鎖の細胞質への輸送を防ぐ。Chole toinは、もう一つのAB型小胞体転位毒素である。

CT処理したhelo細胞の細胞質画分からCTA1が検出されました。このことは、本手法が複数の細胞タイプで有効であり、抗鎖抗体が利用可能ないかなる毒素にも適用できることを強調しています。CT処理した細胞の細胞質画分を抗CTB抗体でコーティングしたSPRセンサー上に流したところ、シグナルは検出されませんでした。これにより、CTA1サブユニットとは異なり、細胞結合性のCTBペンタマーは細胞質に入り込まないことが示されました。

抗CTA抗体でコーティングされたSPRセンサーへの注入後。オルガネラ画分からのシグナルは、細胞質画分からの弱いシグナルと比較してスケール外となっています。これは、ER転位部位へのCT輸送の効率が低いことが知られており、その結果として細胞質に到達できる毒素の量が制限されることと一致しています。

転移した細胞質毒素の時間依存的な蓄積をモニタリングすることも可能です。4°Cで細胞をCTに曝露させた後、37°Cに加温して15分後まで細胞質に毒素は検出されませんでした。

37°Cで30分後に少量の細胞質毒素が検出され、45分および60分のチェイス間隔後には、より多量の細胞質毒素が段階的に検出されました。これは、細胞に関連した毒素が宿主の細胞質へと継続的に長期的に輸送されることを示しています。また、このアッセイでは細胞質への毒素移行の抑制も検出可能です。10% DMSOで処理した細胞では、未処理の毒素投与対照細胞と比較して、CT1に類似した細胞質レベルが低くなっており、毒素のアンフォールディングが抑制されたことが示されました。

鎖は細胞質への転位に必須であるため、DMSOによるCTA1の安定化は、それに応じて小胞体から細胞質への移動を抑制した。DMSOによる毒素転位の阻止を定量化するために、既知濃度の毒素から作成した標準曲線を用い、細胞質内のCTA1濃度を算出したところ、未処理細胞では0.3 nanograms per milliliter、DMSO処理細胞では0.1 nanograms per milliliterであった。したがって、DMSOによるCTA1のアンフォールディングの抑制により、CTA1の小胞体から細胞質への転位が3分の1に減少した。

この手順に従うことで、細胞質に存在する毒素量と毒素活性との直接的な関連性を立証するために、毒性アッセイなどの他の手法を利用することが可能になります。