Name: マウスを用いた気管狭窄のin vitroでの測定で (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 学ぶマウス気管平滑筋の収縮性測定法。in vitro等張力測定により、気道狭窄の薬理学的・生理学的メカニズムを直接解析できます。遺伝子改変マウスを用いたシグナル伝達経路研究に適用可能です。

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この作品は、気道疾患、NINDS助成金（NS052574）の予防と治療におけるイノベーションセンターからの助成金によって賄われ、喘息の研究のためのサンドラー·プログラムからされました。

1。機器収縮測定装置の主要コンポーネント）は、 図2Aに概略的に示されています。 <ol><li> 組織浴。組織風呂は暖かい温度で酸素生理的溶液を保持しています。マウス気管リングのために、私たちは変化のためにバブルの酸素（95％/ 5％O 2 / CO 2混合物）と、入口と出口ポートへの温暖化の解決策、フリットガラスの入口を循環させるウォータージャケットを含む10 mlの組織浴を使用ソリューションを提供しています。貯水池のPSS溶液を37℃のウォーターバス（図示せず）の95％/ 10％O 2 / CO 2混合物の一定のバブルと一緒に格納されます。溶液の交換のために、PSS溶液は比較的高速溶液交換を可能にするために毎分約100 MLSで組織風呂の入口（下のポート）にタンクから圧送される。ソリューションのコンセントは、組織のバットに一定体積を（〜10ml）を可能にオーバーフローポート（上部ポート）を介してソリューション交換時の時間。我々は、組織風呂ジャケット（37°Cを維持するために）を介して温水を送り出すハーケ加熱サーキュレータを使用しています。組織浴は、サプライヤーの数から得られたと研究者の実験的なニーズに合わせてサイズと様々なスタイルで来ることができます。 </li><li> 力変換器。等尺性張力を測定するためには、気管チューブは2つのステンレス鋼棒（ 図2A）のL字型の両端にスレッド化されている。ケアは、生物学的物質と互換性のあるステンレススチールタイプを使用するように注意する必要があります。トップロッドは等尺性力変換器にクリップを介して接続されている。下の棒は、固定位置での気管を保持し、受動的緊張および/または筋肉の長さ調整用マイクロメータに搭載されている。気管の収縮は、プリアンプで電圧信号に変換される力変換器、張力を作成します。下の棒は、2つの長方形の白金板（離れて4ミリメートル）tを含むように構成することができ<html>帽子脇腹気管（ 図2B）。プラチナプレートが気管にかかる電界の配信を可能にするグラスS88刺激に配線されています。オープンワイヤとはんだは、浴溶液中に金属の浸出を防止するために、Sylgard（Sylgard 184シリコーンエラストマーは、ダウコーニング社、ミッドランド、MI）でコーティングされています。 </li><li> A / Dコンバータ、コンピュータと収集ソフトウェア。プリアンプからの信号はMacLab 8 / Dシステム上に記録されます。これは、現在のADInstrument Powerlabハードウェアの旧バージョンです。我々は、実験を通して緊張の連続記録を可能にするプログラムチャート（ADInstruments）を使用します。気管筋の緊張の生成が非常に遅いため、我々は毎秒100ポイントのその買収は、十分な見つけることができます。張力測定は、各実験前に既知の重みを（最大5グラム）を使用して校正されています。同様のシステムは、他のベンダー（例えば、BIOPAC、GW·インスツルメンツ）から入手できます。 </li></ol>タイトル &quot;&gt; 2。気管分離<ol><li>組織の分離の前に力変換器は、既知の重みで較正されており、組織浴（表Iを参照）、通常のPSSで満たされている。空気取り入れ口は、O 2 / CO 2の光ストリームを取得するように調整されます。 </li><li> 2ヶ月またはそれ以上の年齢のマウスから気管に最適です。若い動物が使用されますが、これらから得られた気管が大きいスキルはサイズが小さいための力変換器の配線上にマウントするために必要となることがあります。解剖する前に、マウスを深くイソフルランで鎮静されています。鉗子とつま先ピンチが応答を引き出すことができないとき鎮静の適切なレベルに達しています。マウスはすぐに頸椎脱臼により屠殺されている重要な注意：私たちはAVERTIN（トリブロモエタノール）は、一般的にマウスで使用される鎮静剤は、気道平滑筋に強い弛緩作用を有するため、気管収縮研究のために使用すべきではないことを観察した。 </li><li>皮膚（と毛皮）が胸部から喉に削除されます。 RIBSは、心臓の上部に（両側で）横方向に、胸骨の付け根から切断されています。胸骨と肋骨は、心臓/肺、胸腺、気管（腹）と食道（ - と気管の背側に接続されている）明らかにするために喉を楽しみにプルアップされています。 </li><li>気管、気管支分岐の下咽頭、上記切断して摘出しています。気管は、氷冷酸素（95/5）PSS溶液（表Iに与えられた組成物）に配置されます。 </li><li>気管周囲の組織のクリーン解剖されています。清掃時には、気管が咽頭、または分岐以下保持することができます。しかし、注意が直接気管自体に鉗子を適用しないように注意する必要があります。ファインはさみは、周囲の組織を切断するために使用されるかもしれませんが、カットは常に損傷を避けるために、気管に平行になされるべきである。気管の準備がSylgardコーティングディッシュ（Sylgard 184シリコーンに分岐下咽頭上固定されている場合は、この手順のこの部分が促進されるエラストマーは、ダウコーニング社、ミッドランド、MI）。 </li><li>周囲の組織を除去した後、気管は、咽頭の下に、気管支分岐上にカットされ、ゆっくりと力変換器の配線に取り付けられた。 </li><li>気管は2つのL字型の金属製プロング（ 図2A）上でスレッド化されている。一芯は、等尺性張力を連続的に記録するための力 - 変位変換器に接続されています。別のプロングは、マイクロメータに接続されています。組織浴をして気管がPSSに浸漬されるように発生します。気管の取り付けは、気管がPSSの外側に保持される時間を最小限に抑えるためにできるだけ早く行う必要があります。練習すれば、気管の取り付けは、1分以内に行われますが、我々は一般的に生存率の低下を避けるために3分以上時間を避けることができます。 </li><li>マイクロメータをゆっくり〜10 MN（〜1グラムフォース）の受動的張力を得るために調整されます。最適な静止張力経験的に決定され、我々は〜5の受動的張力を発見した - 1高カリウム刺激に相当する、最大応答の0 MNの結果。これは、この範囲16,17,18の受動張力を利用する他の多くの研究と一致しています。最初の5〜10分かけて、気管受動的張力は（応力緩和現象）やや減少する傾向があり、マイクロメータは、平衡時に〜10 MNへの受動的張力を調整するために使用されます。気管は、実験課題を前に、少なくとも1時間平衡化させています。 </li></ol> 3。高カリウム刺激以下の平衡化は、気管は、高カリウムPSS溶液（67 mMのKClを、表I）で二回挑戦しています。収縮は、一般的に組織浴を完全に気管を緩和するために通常のPSSで数回洗浄される定常状態のその時点で到達するために5〜10分かかります。再現性の収縮が得られるまでカリウム収縮は二度目を繰り返し、三回目（必要に応じて）されています。 <pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 4。電気刺激により誘発収縮気管は、準備に電界刺激（EFS）を可能にする2つの長方形の白金板（電極）で挟まれています。 EFSに対する収縮応答は、周波数と電圧の関数です。それはまた、電極の面積とそれらの間の距離などの物理的パラメータの影響を受けています。刺激の電力特性も高い電圧と電流出力で刺激が最大に達することができるような応答に影響を与えます。すべてのEFSファイルシステムの特性が異なる刺激持続時間、周波数、電圧、パルス持続時間で筋肉収縮反応を調べることによって決定されるべきである。私たちの実験のために、私たちは〜4ミリメートルで区切られた電極、および44 ​​V（0.5ミリ秒のパルス）と30 Hzの刺激振幅が再現性に近い最大収縮反応を達成するために最適であることを発見した。 5。収縮のEVコリン作動性刺激によるoked 外因的に適用された化合物への気管の応答は、累積投与量ファッションの薬物の複数添加することによって、関心のある薬剤の単回投与の追加のいずれかによって評価されるか。気管では、我々の研究室では定期的にアセチルコリンとは違って、カルバコールはアセチルコリンエステラーゼによって分解されない、ので、コリン作動性受容体を活性化するカルバコールを使用していました。合理的な用量-反応の範囲は10 -8から10 -5 Mカルバコールすることです。ログのフィッティングヒル型の方程式で[カルバコール] -収縮反応曲線は、コリン作動薬19〜気管収縮の感受性の指標であるEC 50（半最大有効濃度）を推定することができます。それはカルバコールの投与量は累積用量応答曲線の一部としてより単回投与としてわずかに大きい応答を与えることは注目に値する。 6。代表的な結果</p&gt; 高カリウムに対する収縮反応の例を図3Aに示されています。収縮は約10分以内に最大値に達するが、その後わずかに減少が表示される場合があります。高カリウムの早期洗い出しの間に、筋肉は、溶液系における非加熱PSS溶液を少しボリュームが一時的に準備をperfusesような温度の低下によるものである収縮の一過性増加を示すことがあります。これは、加熱されたPSS貯留と組織浴を接続するチューブの最小デッドボリュームを有することにより、また（一般的に我々は100ミリリットル/分で解決策をポンプ）比較的迅速にソリューションを交換することによって最小限に抑えることができます。各製剤は、筋肉の質量や解剖中に発生した損傷の違いによる収縮反応に若干の違いがあります。 図3Bは、高カリウムとカルバコールでチャレンジ別の筋肉量の2気管を示しています。コリン作動性誘発収縮は異なりますが、yは正規化後の高カリウム溶液（ 図3C）の応答に似ています。 図4は、単回投与（A）および累積増加（B）を使用して、カルバコール（コリン作動性）誘発収縮の例を示します。カルバコールのソリューションは、お風呂に直接添加し、泡立たガスが急速に混合するのに役立ちますしています。その単回投与の追加（すなわち、1μM、 図4A）は、累積用量-反応曲線（1μM、 図4B）間に相当する濃度よりも僅かに大きい応答を持って注目に値します。 図4Cは、収縮力のプロットを示しています。 図4Bからのデータを使用してカルバコール濃度の関数として。カルバコールの効果は、10 -5 Mの濃度で飽和します。コリン作動性アゴニストはカルシウム放出機構を介して収縮を開始したものの、収縮の実質的な成分は、また、脱分極によって媒介されると電位依存性カルシウムチャネル20の活性化。 図5Aは、EFS-誘発収縮の例を示します。気管は収縮がプラトーに（挿入図A1を参照）に到達するまで0.5ミリ秒の期間は、40ボルトのパルスを用いて刺激される。刺激頻度の増加は、増加し収縮応答（周波数応答曲線を図5Bにプロットされている）が発生します。電場刺激はシナプス前神経を活性化することにより主に収縮を引き起こすことが示されている。これは、ボツリヌス毒素、気管21のEFS誘発収縮の大部分を遮断する神経伝達物質放出のブロッカーの効果によって証明されています。さらに、テトロドトキシンは、エージェントのブロックのNa +チャネルは、神経活動を抑制し、EFSに気管の応答を排除すること。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig1.jpg" /> 図1：tの図彼は孤立した気管の準備のシグナル伝達経路を専攻しています。気管平滑筋細胞を神経支配するコリン作動性軸索端末が示されている。主要なシグナル伝達経路は、IP3受容体（M3）とcAMPの減少（M2）を介してカルシウム放出を引き起こすM3とM2-ムスカリン性アセチルコリン受容体の活性化（mACHR）です。 M2受容体（とM3受容体のいくつかの貢献）もL-型電位依存性カルシウムチャネルとカルシウム流入を活性化するコリン作動性誘発脱分極を引き起こす。一般的な収縮エージェントとそのエフェクターは1です。高カリウム（平滑筋細胞およびコリン作動性軸索脱分極）、2。電場刺激（EFS、コリン作動性軸索を脱分極）、3。そのようなアセチルコリンやカルバコール（直接ムスカリン受容体を活性化する）などのコリン作動性薬剤の外因性のアプリケーションです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig2.jpg" /> 図2：気管収縮を測定するために使用される装置のダイアグラム。 A.力変換器、マイクロメーター及び組織浴をねじクランプを介してロッドを支援する上に搭載されている。気管リングは上部と下部ロッドに縫い込まれています。図では、組織浴を準備（力変換器に気管のマウント時にIE）の下に配置されています。収縮の研究中に、組織浴の準備を浴びるように垂直に移動されます。 B.は、電界刺激のための下部ロッドは気管保持線に横方向にマウントされている2本の白金板を含むように変更されています。白金板は、刺激への電気配線によって接続されています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig3.jpg" /> 図3高カリウムの例（67 mM）の気管の収縮反応。 （）高カリウムに重複し、再現性のある応答を示しています。 （B）2つの異なる気管のカルバコールに対する収縮応答の例。正規化したときに（C）Bの気管への対応は似ています高カリウム応答にd。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig4.jpg" /> 図4。カルバコール誘発性収縮の例。 （A）単回投与を用いてカルバコール誘発収縮はウォッシュアウトが続く。 Aの気管（C）Bからピークの収縮のために（B）の例の累積用量 - 反応曲線は、カルバコール濃度の関数としてプロットされています。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3703/3703fig5.jpg" /> 図5電場刺激により誘発される収縮の例。 （A）に示すよう気管収縮の電界刺激が0.5 msパルス、40ボルト、様々な刺激の周波数を使用します。はめ込みは、30 Hzの時間拡張収縮です。 （B）からのピーク収縮がplotteです。刺激周波数の関数としてD。 通常のPSS <table border="1"><tbody><tr><td> 塩 </td><td> 濃（MM） </td><td> 量（g / 2 L） </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 119 </td><td> 13.91 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 4.7 </td><td> 0.7 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 1.18 </td><td> 0.32 </td></tr><tr><td> MgSO 4を X 7H 2 O </td><td> 1.17 </td><td> 0.58 </td></tr><tr><td> NaHCO 3を </td><td> 18 </td><td> 3.02 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 0.026 </td><td> 0.5 M 0.1 mlの</td></tr><tr><td>グルコース</td><td> 11 </td><td> 3.96 </td></tr><tr><td>スクロース</td><td> 12.5 </td><td> 8.56 </td></tr><tr><td> CaCl 2を </td><td> 2 </td><td> 10mMの400ミリリットル</td></tr></tbody></table>高K + PSS（NAClとKClの調整） <table border="1"><tbody><tr><td> 塩 </td><td> 濃（MM） </td><td> 量（g / 2 L） </td></tr><tr><td> NaClを</td><td> 56.7 </td><td> 6.628 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 67 </td><td> 9.991 </td></tr></tbody></table> 。PSSソリューションについては、 表1レシピ注 ：ソリューションは、高純度の品質の水で、毎週新鮮行われ、成長を汚染を避けるために5日を超えないために冷蔵庫に保存されています。

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<li>Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BK+channel+beta1-subunit+regulation+of+calcium+handling+and+constriction+in+tracheal+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).</li>
<li>Fortner, C. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EP2+receptors+mediate+airway+relaxation+to+substance+P+ATP%2C+and+PGE2%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).</li>
<li>Hay, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+of+endothelin+ligand-induced+contraction+in+isolated+tracheae+from+endothelin+B+%28ET%28B%29%29+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice.</a> Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).</li>
<li>Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%283%29-receptor+knockout+mice%3A+muscarinic+receptor+function+in+atria%2C+stomach+fundus%2C+urinary+bladder%2C+and+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).</li>
<li>Trevisani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vitro+expression+of+B1+receptor+in+the+mouse+trachea+and+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).</li>
<li>Mehats, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDE4D+plays+a+critical+role+in+the+control+of+airway+smooth+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction.</a> FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).</li>
<li>Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22classical%22+ovalbumin+challenge+model+of+asthma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice.</a> Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここで紹介するプロトコルは、気道の筋肉の機能を評価するための生理的な製剤を提供する。我々は、一般的に、同時に3月4日、臓器の浴用の調製品を動作させるしかし、事前にパッケージ化されたシステムは、8製剤（ADInstruments、世界の精密機器、ハーバード装置）までの同時測定を可能にするサプライヤーの数から利用可能です。我々は同等の結果と力変換器および組織器官浴の番号を利用しています。しかし、我々は電界刺激は刺激電極サイズ、電極板との間の距離と、電界内での準備の位置との間のわずかな違いに基づいて、いくつかの変動性を提供することを見つける。したがって、余分なケアが可能な限り同じフィールド電極を作るために行われるべきである。 等尺性力測定で最も重要なパラメータの一つは、筋肉量の変動を補償するために正規化収縮の問題であるか、別の準備の間に筋肉組織の健康。の部分では、違いが類似した年齢と同じ性別（雌マウスは減少気管の張力を生成する傾向がある）の動物を比較することによって最小限に抑えることができます。さらに、我々は、気管への正規化湿潤または乾燥重量は、マウス気管のサイズが小さいことが原因である...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>アナログ - ディジタルコンバータ</td><td> ADInstruments </td><td> PowerLab 35分の4 </td><td></td></tr><tr><td>カルバコール（Carbamoylcholineクロライド） </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> C4832 </td><td> 10 -2 Mの水（アリコートを-20℃で保存することができます） </td></tr><tr><td>チャートソフト</td><td> ADInstrtuments </td><td> LabChart </td><td></td></tr><tr><td>加熱サーキュレータ</td><td>ハーケ</td><td>ミキサーミルMM400 </td><td></td></tr><tr><td>アイソメトリックフォーストランスジューサ</td><td>ケント科学</td><td> TRN001 </td><td></td></tr><tr><td>刺激</td><td>草·テクノロジーズ</td><td> S88デュアル出力SQUパルス刺激です。 </td><td></td></tr><tr><td>組織·バス</td><td> WPI </td><td> 47264 </td><td></td></tr></tbody></table>

マウスを用いた気管狭窄のin vitroでの測定で

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスは、気道1,2の生理と病態の調査のための強力なツールとなっている。分離された気管の製剤の in vitro tensometry では気道平滑筋（ASM）遺伝子改変マウスにおける収縮反応の有用なアッセイであることが証明されています。 試験管内気管の準備で 、これらは比較的単純であり、堅牢な応答を提供し、さらに長時間のインキュベーション後に、機能的なコリン作動性神経終末と筋応答の両方を保持します。 気管tensometryまた、平滑筋の収縮に影響を与えるセカンドメッセンジャーシグナル伝達経路の様々な勉強するための機能アッセイを提供する。気管の収縮は、主にASM（ 図1）にアセチルコリンを放出する副交感神経、コリン作動性神経によって媒介される。主要なASMアセチルコリン受容体はそれぞれ、G、I / OおよびGqと共役受容体であるムスカリンM2およびM3です。 <suP&gt; 3,4,5。 M3受容体はホスホリパーゼC、筋小胞体3,6,7から増加IP3の生産とIP3媒介カルシウム放出を有効にするにはGqとに結合することによって収縮を呼び起こす。 M2 / G、I / Oシグナリングは、cAMPレベル5,8,9,10の減少につながってアデニル酸シクラーゼの阻害により収縮性を高めると信じられています。これらの経路は、気道平滑筋11のいわゆる&quot;薬理収縮連関&quot;を構成する。さらに、M2受容体を介してコリン作動性シグナリング（とM3シグナリングによって変調された）順番に（つまり、 &quot;興奮収縮連関&quot;と呼ばれるL型、電位依存性カルシウムチャネル（ 図1）とカルシウム流入を有効化するASMを脱分極する経路を含む）4,7。気道収縮を制御するシグナル伝達経路に関する詳細なレビューは、4,12見つけることができます。上記の経路はマウスや他の生物種間で保存されて表示されます。しかし、マウスの気管は、他の種と異なるIいくつかのシグナル伝達経路をn。最も顕著なヒスタミン、アデノシン13,14の収縮反応の欠如、人間や他の種5,15の両方でよく知られているASM変調器です。 ここでは、マウス気管リングの分離とその収縮出力のin vitroで測定するためのプロトコルを提示します。含まれているのは、機器構成、気管リングの分離と収縮の測定値の説明です。例は、電位依存性カルシウム流入（1。高K +、 図1）をアクティブにするためにASM筋の脱分極によって直接神経の高カリウム刺激を使用して間接的に収縮を喚起するために与えられている。さらに、メソッドは電場刺激（2。EFSは、 図1）を使用して、神経の刺激のみの場合、またはお風呂（3。外因性のACH、 図1）に適用される外因性の神経伝達物質を使用してASMの筋肉の直接刺激のために提示されています。このFLE準備のxibilityと使いやすさは、単離された気管リングモデルの気道平滑筋収縮に関与するシグナル伝達カスケードの数の堅牢かつ機能的アッセイをレンダリングします。

トランスジェニックマウスは、遺伝子に生理的機能をascribingで非常に有用であった。一般的にこのような、研究、気道の機能的研究として、具体的には、マウスモデルに向かって顕著シフトを受けています。ここでのプロトコルを提供する<em&gt; in vitroで</em&gt;気管狭窄の研究は、マウスの気道平滑筋機能を評価することができます。

トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスは、気道の生理学および病態生理学の研究において強力なツールとなってきました1,2。...のin vitroテンソメトリー（張力測定）では、

この手順の全体的な目的は、マウス気管平滑筋の収縮性を測定することです。まず、組織浴を準備し、等尺性力トランスデューサを校正します。次に、マウスの気管を単離し、力トランスデューサのロッドに固定します。次に、気管を刺激し、その結果生じる張力を測定・解析します。最終的に、等尺性張力測定を通じて気管筋の収縮性を示すことができます。気道抵抗のin vivo測定などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、in vitroでの張力測定により、平滑筋の収縮性をより直接的に評価できる点にあります。この手法の欠点は、器官浴（organ bath）調製であるため、in vivoにおいて平滑筋の収縮性に影響を与える可能性のある循環因子が、in vitroの調製系では欠如している可能性があることです。この方法はマウス気管平滑筋に関する知見を得ることができますが、大血管やさまざまな腸管および膀胱の平滑筋など、筋組織のリング状調製試料が十分に大きく、力変換器のワイヤーに固定できる他の平滑筋組織にも適用可能です。収縮測定装置のうち、組織バスとフォーストランスデューサの2つの構成要素について説明が必要である。組織バスは、マウス気管環のために、酸素を飽和させた生理学的溶液を温かい温度に維持する。10 mLの組織バスを使用し、これには保温用のウォータージャケット、酸素をバブリングするためのガラス製入口、および保存された溶液を交換するための入口および出口ポートが備わっている。溶液交換用に、酸素をバブリングし、ウォーターバスで37 °Cに維持したPSS溶液のリザーバーを用意します。PSS溶液をリザーバーから組織浴の入口へ、約100 mL/minの速度でポンプ輸送します。同時に、恒温循環ポンプを用いて37 °Cの水を組織浴のジャケット内に循環させます。2つ目の注目すべき装置は、フォーストランスデューサーです。これは、気管の等尺性張力を測定するために使用されます。気管チューブは、ステンレス鋼などの生体適合性材料で作られた2本のロッドのL字型の端に差し込まれます。上部のロッドはクリップを介して等尺性力トランスデューサーに接続されています。下部のロッドは気管を固定位置に保持し、受動的張力または筋肉の長さを調整するためのマイクロメーターに取り付けられています。気管の収縮により力トランスデューサーに張力が生じ、それが電気刺激用のプリアンプで電圧信号に変換されます。下部のロッドには、4 mm間隔で配置された2枚の長方形の白金プレートが構成されており、これが気管を挟む形になります。白金プレートは、Grass S 88などの一般的な刺激装置に配線します。この準備において、金属がバス溶液に溶出するのを防ぐため、露出したワイヤーははんだ付けし、絶縁剤でコーティングする必要があります。追加の設備として、ADコンバータ搭載コンピュータおよびデータ収集ソフトウェアが必要です。プリアンプからの信号は、Mac Lab 8 ADシステムで記録されます。組織の分離を開始する前に、組織バスに標準PSSを満たし、空気入口を調整して酸素が緩やかに流れるようにします。また、フォーストランスデューサーのワイヤーに既知の重りを載せて、データ収集ソフトウェアで校正を行ってください。2か月齢以上のマウスを犠牲にします。若いマウスは気管が小さいため、解剖および固定が困難になるためです。マウスで一般的に使用される鎮静剤であるアネトリオールには、気道平滑筋に対して強力な弛緩作用があることが観察されており、したがって気管収縮の研究には使用すべきではありません。気管を摘出した後、摘出した気管を氷冷した酸素飽和PSS溶液を満たしたシャーレに入れます。解剖顕微鏡下で、気管を分岐点の下および咽頭の上に位置するようにしてディッシュに固定します。ピンセットを用いて周囲の組織を除去します。気管は咽頭部分または分岐点の下で保持し、気管自体に直接ピンセットを当てないようにしてください。同様に、組織を切り出す際は、周囲の組織を除去した後、気管と平行にのみ切断してください。気管を、咽頭の下側かつ気管分岐点の上側で垂直に切断します。これで、気管を装置に取り付けることができます。気管の固定は、気管がPSS外にある時間を最小限にするため、可能な限り迅速に行う必要があります。注意深く、かつ速やかに、2本のL字型金属ピンに気管を通します。次に、組織浴を素早く上昇させ、気管を温めたPSSに浸します。気管がPSSに戻ったら、マイクロメーターをゆっくりと調整し、約5〜10 mN、または0.5〜1 gの受動的張力を得ます。これが、その後5〜10分間の最適な静止張力となります。張力は低下するため、安定するまで目的の張力を維持するように調整を続けてください。安定した後、実験的に収縮を誘発する前に、気管を少なくとも1時間平衡化させます。平衡状態に達した後、カリウム、電場刺激、または目的の薬剤を用いて収縮を誘発させます。カリウム刺激を用いる場合は、高カリウムPSS溶液で気管に負荷をかけます。通常、5〜10分後に収縮が定常状態に達するため、その時点で通常PSSでバス内を数回洗浄し、気管を完全に弛緩させてください。その後、高カリウムPSS溶液に交互に切り替えます。再現性のある収縮が得られるまで行い、通常、3回以上の入浴（バス）は必要ありません。電気場刺激は、気管の両側に配置した白金板によって行われます。収縮反応は、電極の面積および電極間の距離によって影響を受けます。刺激装置の電力特性により、電流出力は高電圧で最大になります。最大に近い反応は、0.5 millisecondのパルスまたは30 hertzの間隔で印加した44 voltsを用いて得られます。ただし、これはシステムによって異なるため、経験的に決定する必要があります。また、本システムでは、気管外から投与された薬剤に対する気管の反応を測定することも可能です。バス溶液、単回投与の薬剤、または累積投与法による薬剤の複数回添加について評価が行えます。例えば、コリン作動性受容体を活性化するためにカルバコールを使用できます。アセチルコリンとは異なり、カルバコールはアセチルコリンエステラーゼによって分解されないため、より安定した反応が得られます。結果をヒル型方程式を用いた対数反応曲線に当てはめることで、半最大有効濃度またはC 50を推定することができます。気管組織標本を高カリウム浴で刺激しました。収縮は約10分以内に最大に達しました。高カリウム浴の洗浄初期において、温度の低下に伴い筋肉に一時的な収縮の増加が見られました。加熱していない少量のPSS溶液を用い、溶液ラインを通じて標本を一時的に灌流しました。次に、筋量の異なる2本の気管に対し、高カリウムおよびカルバコールによる刺激を与えました。コリン作動性の収縮誘発における反応は異なっていたが、高カリウム溶液による反応で標準化した後は同様であった。次に、単回投与および累積投与により、カルバコールを用いて収縮を誘発した。OL溶液はバスに直接添加した。単回投与における反応が、累積投与における同等濃度の反応よりもわずかに大きかったことは注目に値します。収縮力をカラバホールの濃度の関数としてプロットしたところ、カラバホールの効果は10⁻⁵ Mで飽和することが示されました。気管を、収縮がプラトーに達するまで、0.5 ms、40 Vのパルスを用いたEFSに供しました。刺激周波数を上げると、収縮反応が増大しました。これは、EFSが主にシナプス前神経を活性化させることで収縮を誘発することが示されているためであると考えられます。例えば、ボツリヌス毒素は気管のEFS誘発収縮の大部分を遮断します。さらに、テトロドトキシンは神経活動を抑制し、EFSに対する気管の反応を消失させます。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、概ね1時間半で完了できます。しかしながら、気管は臓器バス内において数時間にわたり生存可能であり、長期的な実験が可能です。不要。

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マウスを用いた気管狭窄のin vitroでの測定で

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