Name: 神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: 学ぶ神経幹細胞から神経前駆細胞を生成・濃縮する方法。フローサイトメトリーを用いて未成熟神経細胞を分離・精製する技術を解説。神経科学と幹細胞研究の発展に貢献する実験プロトコルです。

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<ol><li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393(2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457(2011).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods. Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Scheffler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+characterization+of+adult+brain+neuropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional characterization of adult brain neuropoiesis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 9353-9358 (2005).</li>
<li>Azari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+immature+neuronal+cells+from+neural+stem+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny.</a> PLoS One. 6, e20941-e20941 (2011).</li>
<li>Amariglio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-Derived+Brain+Tumor+Following+Neural+Stem+Cell+Transplantation+in+an+Ataxia+Telangiectasia+Patient%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Medicine%22%5BJournal%5D)">Donor-Derived Brain Tumor Following Neural Stem Cell Transplantation in an Ataxia Telangiectasia Patient.</a> Plos Medicine. 6, 221-231 (2009).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

定義されている神経細胞集団を分離する能力（すなわち、ニューロン、アストロサイトとオリゴデンドロサイト）は、神経幹細胞の臨床応用（NSCの）に関連付けられている障害のいくつかを解決するかもしれません。まず最初に、それは完全にドナー細胞の出発人口を特徴付けるために私達が可能になります。第二に、私たちは病気の性質や段階に応じて、特定の比率で特定の細胞型または異なる細胞型の組み合わせを使用することができます。最後に、高濃縮前の分化神経細胞の前駆細胞を使用すると、飛躍的に制御されていない可能性の増殖と善意のNSC 6を含む異種の神経前駆細胞の使用に関連した腫瘍形成を減少させることができます。一般的に神経幹細胞の分化は5〜10％の神経細胞と80％以上がアストロサイトになります。分化のNBAメソッドを使用して、神経細胞の割合は20から30パーセントまで増加しますが、まだアストロサイトの多くと他の幹とpがありますいずれかのin vitroで 、純粋な神経細胞を研究するために、または神経疾患の動物モデルでそれらの治療効果を勉強するつもりならば望ましくないかもしれない文化の中でrogenitor細胞。このプロトコルで...

<table border="1"><tr><td> 試薬の名前 </td><td> タイプ </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC基礎培地</td><td>培地</td><td>セル技術を幹</td><td> 05700 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC増殖サプリメント</td><td>培地サプリメント</td><td>セル技術を幹</td><td> 05701 </td><td></td></tr><tr><td> 0.05％トリプシン-EDTA </td><td>試薬</td><td>ギブコ</td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td>ダイズトリプシン阻害因子</td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>試薬</td><td>ギブコ</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td>試薬</td><td>ギブコ</td><td> 41500-018 </td><td> HEMコンポーネント</td></tr><tr><td> * HEPES </td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> H4034 </td><td> HEMコンポーネント</td></tr><tr><td> *蒸留水</td><td>試薬</td><td>ギブコ</td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>ふるい</td><td> BDファルコン</td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25フラスコ</td><td>文化ウェア</td><td> Nalge Nunc社国際</td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80フラスコ</td><td>文化ウェア</td><td> Nalge Nunc社国際</td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> 15 mlチューブ</td><td>文化ウェア</td><td> BDファルコン</td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> 50mlチューブ</td><td>文化ウェア</td><td> BDファルコン</td><td> 352070 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> EGF </td><td>成長因子</td><td>研究開発</td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> B-FGF </td><td>成長因子</td><td>研究開発</td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>成長因子</td><td>シグマ</td><td> H4784 </td><td> PBSで再構成</td></tr><tr><td>抗PSA-NCAM-PE </td><td>抗体</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-093-274 </td><td></td></tr><tr><td> PE-共役マウスIgG1を</td><td>アイソタイプコントロール抗体</td><td> BD Pharminogen </td><td> 556029 </td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>成長因子</td><td>シグマ</td><td> H4784 </td><td> PBSで再構成</td></tr><tr><td> HrBMP-4 </td><td>成長因子</td><td>研究開発</td><td> 314-BP-010 </td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-Ornitハイン</td><td>試薬</td><td>シグマ</td><td> P4957 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>培地サプリメント</td><td>ギブコ</td><td> 10099-141 </td><td></td></tr><tr><td> GFAP </td><td>抗体</td><td> DAKO </td><td> Z0334 </td><td></td></tr><tr><td> B-IIIチューブリン</td><td>抗体</td><td>プロメガ</td><td> G7121 </td><td></td></tr></table> * HEM、ミックスMEMの1×10 Lパケットと1M HEPESの160ミリリットルを加え、蒸留水を用いて8.75 Lにボリュームをもたらす。 7.4の最終pHを設定し、4℃で保管して

神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

すなわち、アストロサイト、オリゴデンドロサイトとニューロン、神経幹細胞（NSCの）神経球アッセイを用いて、中枢神経系（CNS）の三つの主要な細胞型に分化し、大規模で分離し、拡張することができます。これらの特性は、神経幹細胞や前駆細胞などの創薬スクリーニング、神経毒性および電気生理学などのin vitro試験で 、また多くの神経疾患の細胞補充療法のためのセルの貴重な再生可能エネルギー源を作る。しかし、実際には、NSCの子孫の不均一性、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトの低生産、分化、その臨床応用を制限するには、次のアストロサイトの優位性。ここでは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）技術を使用してマウスNSCの子孫からの未熟な神経細胞の生成とその後の精製のための新規方法論を記述します。この方法を使用して、高度に濃縮された神経前駆細胞集団は、ウィットを達成することができます任意の顕著な星状膠細胞と善意のNSC汚染ホウトベイ。手順は、NSCの子孫を単離し、フローサイトメトリー技術を使用して、その物理的（サイズと内部の複雑さ）と蛍光特性に基づいて、未熟な神経細胞の分離と濃縮に続いて神経球アッセイを使用してE14マウス神経節隆起から、拡大の分化が含まれています。全体的には、NSCの子孫を区別し、非常に未熟な神経細胞を精製単離するための神経と6-8日を生成するために5-7日かかる。

このビデオプロトコルは、神経幹細胞（NSC）の物理的（サイズと内部の細かさ）に基づいて、フローサイトメトリー技術を用いた蛍光特性の再生可能エネルギー源から神経前駆細胞の生成とその後の精製のための新しい方法を示します。

神経幹細胞（NSC）は、ニューロスフィアアッセイを用いて大規模に単離および増殖させることができ、さらに...の3つの主要な細胞型へと分化させることが可能です。

このビデオプロトコルの目的は、フローサイトメトリーを用いて、分化過程にある神経幹細胞娘細胞から神経前駆細胞を生成し、濃縮する方法を実演することです。まず、ニューロスフィアアッセイを用いて神経幹細胞を単離・増殖させます。得られた細胞を、その後、ニューロブラストアッセイと呼ばれる2段階の手法で分化させます。最後に、フローサイトメトリーを用いることで、細胞の物理的特性および蛍光特性に基づいて、異なる細胞集団を同定し、分取することが可能です。本プロトコルでは、ニューロブラストアッセイと呼ばれる神経幹細胞の分化誘導法と、得られた未熟な神経系娘細胞をフローサイトメトリーを用いて精製するための新規な手法を紹介します。ニューロブラストアッセイは、約3〜4日間の増殖相と、約4〜5日間の分化相で構成されています。分化段階において、下層にアストロサイト、上層に未熟なニューロンのクラスターからなる細胞単層が形成されました。分化中の神経幹細胞の娘細胞を単一細胞に解離させ、フローサイトメトリーにかけた際、神経前駆細胞とそれ以外の細胞との間には、細胞サイズと内部複雑性の観点から明確な差が認められます。前方散乱光（FSC）および側方散乱光（SSC）の値が低い小型細胞集団をゲートすることで、高度に濃縮されたニューロンを単離でき、より均一な神経細胞集団を得ることが可能です。解離させた神経血行系アッセイ培養液をPSAおよびCAMで染色し、陽性細胞を小細胞分画からゲーティングおよびソートすることができます。それでは、始めていきましょう。マウス胚から神経幹細胞を単離し、拡大培養します。画面上のアドレスにある別のビデオプロトコルに記載されているニューロスフィアアッセイを用い、14日目の神経節隆起を準備します。スフィアの直径が150～200 µmに達していることを確認してください。スフィアを回収し、適切なサイズの滅菌チューブに移します。チューブを800 RPMまたは110 Gで5分間遠心分離します。その後、上清を除去し、球体を1 mLの予熱したtrypsin EDTA溶液で再懸濁します。細胞を37 °Cのウォーターバスで2〜3分間インキュベートします。細胞に等量のトリプシンインヒビターを加え、よく混ぜてトリプシンの活性を停止させ、単一細胞懸濁液にします。細胞をより小さなチューブに移し、110 Gで5分間、再度遠心分離します。上清を除去し、1～2 mLで細胞を再懸濁します。完全神経幹細胞培地。細胞懸濁液を10 µL取り出し、90 µLのトリパンブルーとよく混ぜ合わせて細胞数を計測する。増殖用培養培地を調製するには、完全神経幹細胞培地に胎児血清を最終濃度5%となるように添加する。次に、細胞を培地に加え、密度が 200,000 から 300,000 cells/ml になるように調整します。ここで、EGFを最

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオプロトコルは、神経コロニー形成細胞アッセイを用いて神経前駆細胞の混合集団で善意の神経幹細胞を区別して列挙する方法を示しています。...

神経コロニー形成細胞アッセイ：神経前駆細胞から善意の神経幹細胞を区別するアッセイ

このビデオは、ニューロスフィアからの神経前駆細胞の移動応答を研究するin...

NPC Neurosphere Assay:ニューロスフィアからの神経前駆細胞の遊走応答を評価するためのIn Vitroアッセイ

神経細胞型の表面抗原および/または細胞内抗原のフローサイトメトリー分析のためのプロトコルの詳細な説明を提供します。実験計画の重要な側面、段階的な方法論的手順、およびフローサイトメトリーの基本原理が説明され、神経生物学者がこの強力な技術を活用できるようになります。...

神経細胞型の表面のためのフローサイトメトリーのプロトコルおよび細胞内抗原解析

神経幹細胞（NSCは）自己再生および3神経系統に分化することができる細胞を指します。ここでは、クローン性条件下でニューロスフェア形成および分化を使用して、指定された細胞集団におけるNSCの周波数を決定するためのプロトコルを説明します。...

クローンのアッセイを用いて神経幹細胞の列挙

神経膠芽腫幹細胞 (GSCs) のグリア分化を促進する小さい分子の同定の効率的なスクリーニングのプロトコルが表示されます。アッセイは、人間の GFAP プロモーターによって強化された GFP (eGFP)...

流れの Cytometry ベースの医薬品スクリーニング システム神経膠芽腫幹細胞の細胞分化を促進する小さい分子の同定に関する研究

増殖、移行、および神経突起伸長はしばしば脳神経疾患で摂動など発達のプロセスします。このように、迅速かつ再現性をもって人間の iPSC 由来の Npc でこれらの神経発達のプロセスを評価するためのプロトコルを提案する.これらのプロトコルには、NPC...

ひと神経前駆細胞 (Npc) における神経発達学的表現型の迅速な検出

ここでは、我々 は、スペアの中央運河ニッチ住宅内因性神経幹細胞 (NSCs) 大人のマウスの最小限の脊髄損傷モデルの性能を発揮します。Neurosphere アッセイを使用してアクティブ化および傷害に続く決定的な原始的な NSCs...

最小限の脊髄損傷のマウス モデルにおける内因性神経幹細胞の活性化を評価する Neurosphere アッセイ

マウスの脳や脊髄から取り出した異なる細胞の種類を同時に同定するためのフローサイトメトリー法を提示する。この方法は、神経変性疾患における純粋な細胞集団を単離または特徴付けたり、ウイルスベクターまたはナノ粒子の生体内投与を標的とする細胞の程度を定量化するために利用され得る。...

異なる均質化法を通じてマウス脳/脊髄から取り出された複数の細胞型の同時フロー細胞特性評価

提示されたプロトコルは、低分子化合物の神経突起成長アッセイおよび神経毒性評価のための方法を記述する。...

神経前駆細胞由来ニューロンを用いた神経突起増殖アッセイと神経毒性評価

吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。...

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

この研究では、フローサイトメトリーと2つの蛍光レポーターまたは抗体による二重染色に基づいて複数のミトコンドリア機能パラメーターを測定し、ミトコンドリア体積、ミトコンドリア膜電位、活性酸素種レベル、ミトコンドリア呼吸鎖組成、およびミトコンドリアDNAの変化を検出する新しいアプローチを報告しています。...

ヒト人工多能性幹細胞における複数のミトコンドリアパラメータとその神経およびグリア誘導体のフローサイトメトリー解析

学ぶ神経幹細胞から神経前駆細胞を生成・濃縮する方法。フローサイトメトリーを用いて未成熟神経細胞を分離・精製する技術を解説。神経科学と幹細胞研究の発展に貢献する実験プロトコルです。

神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ

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