ラテラルフロー技術を用いた血液学的悪性腫瘍患者における侵襲性肺アスペルギルス症の検出

本手順の全体的な目的は、ヒト血清およびBAL液中のアスペルギルス診断抗原を迅速に検出するためのラテラルフローデバイスの使用法を実証することです。まず、血清またはBAL検体をラテラルフローデバイスのリリースポートに適用します。次に、溶液をメンブレンに沿って移動させます。

次のステップでは、内部コントロールラインを確認してテストが有効であるかどうかを判定します。最終ステップでは、テストラインを確認してテスト結果を判定します。最終的に、このラテラルフローデバイスは、血清または気管支肺胞洗浄（BAL）液中のアスペルギルス診断抗原の有無を検出するために使用されます。

Aspergillus LFDは、侵襲性肺アスペルギルス症の診断における補助検査として利用できます。Aspergillus、galacto-mannan酵素免疫測定法、panfungal β-D-glucanアッセイ、およびAspergillus PCR検査などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、最小限の検査設備とトレーニングで実施可能な、迅速なポイントオブケア診断テストである点です。LFDはAspergillus属の検出のために開発されましたが、ラテラルフロー技術は、Scedosporium、Fusarium、Rhizopus属などの他の感染性病原体の検出にも応用可能です。

これらの生物に特異的なモノクローナル抗体を組み込むことで、本手法を視覚的に実証することが極めて重要となります。LFDの結果を解釈するには、アッセイ形式に習熟する必要があります。未処理の血液検体から血清を採取する場合、4 °Cで血液を凝固させます。血清および気管支肺胞洗浄液（BAL液）は、使用前に-20 °Cで分注して保存してください。分注して保存することで、繰り返し試験を行う際の凍結融解による標的抗原の分解リスクを低減できます。試験用に血清およびBAL検体を調製するには、検体を室温で解凍した後、氷上で保持します。ボルテックスミキサーで十分に混合し、14,000 RPMで1分間遠心分離します。ヒト検体のルーチン試験では、血清を組織培養培地で1:1に希釈します。あるいは、血清免疫複合体から標的抗原を解離させるために、4% EDTA含有PBSで血清を1:2に希釈し、沸騰水浴中で3分間加熱した後、14,000 RPMで5分間遠心分離します。

ヒトBAL液は前処理を必要としません。BALサンプルを融解させ、ボルテックスおよび遠心分離を行ったものは、ラテラルフローデバイスに直接適用可能な純粋なサンプルとなります。検査に使用するラテラルフローデバイス（LFD）は、室温または23 °Cで保存され、この条件下で12か月間安定です。

アッセイを開始するには、デバイスをポーチから取り出し、水平な面に置きます。滅菌ピペットチップを用いて、前処理した血清 100 µL を数秒以内にデバイスのリリースポートに滴下します。液体は、観察窓内のニトロセルロース膜に沿って毛細管現象により移動します。

同様の手順で、100 µLの未希釈BAL検体をデバイスのリリースポートに適用します。室温で15分間アッセイを行い、その時点でテスト結果を記録してください。結果を記録するまで、テストを15分以上放置してはいけません。

これは結果の解釈にバイアスを与える可能性があるため、インキュベーション期間を延長しても弱い反応が強化されることはありません。LFDは、プラスチックハウジング上の文字Cで示される内部コントロールラインと、文字Tで示されるテストラインで構成されています。コントロールラインは、血清またはBAL検体中のアスペルギルス抗原の有無にかかわらず、常に現れるはずです。これにより、血清またはBAL検体中にアスペルギルス抗原が存在する場合、アッセイが正しく実行されたことが示されます。

検体添加後15分以内にテストラインも現れます。テストラインおよびLyme反応の強度は、血清およびVAL検体中の標的抗原濃度に比例します。本手順において最も困難な点は、テスト結果の判定です。

LFDの結果は15分後に読み取り、検査結果をここに示す代表例と比較してください。この図には、BALおよび血清検体における弱陽性、中等度陽性、および強陽性のLFD結果の代表例が示されています。血清検体において、強度に関わらず陽性ラインが認められた場合は、血流中に循環するアスペルギルス抗原が存在することから、侵襲性肺アスペルギルス症（IPA）であると考えられます。BALでの陽性反応は、強度に関わらず、肺における胞子の発芽および潜在的な病原性菌糸の発達を示しています。

Aspergillus抗原が存在しない場合、テストラインは現れず、結果は陰性と記録されます。この表は、European Organization for Research and Treatment of CancerおよびNational Institute of Allergy and Infectious Diseases Study Groupの診断基準に従って診断された急性骨髄性白血病またはML患者のBAL液を用いたLFDテストの結果を示しています。この表には、各患者の対応する臨床的および心理学的データ、ならびにASPERIA特異的PCRテストの結果が含まれています。

2002年のEORTCMSGガイドラインに基づき、患者12、13、および16は、宿主因子と臨床基準、またはGM陽性に基づき、possible（可能性あり）なIPAと診断されました。改訂された2008年のEORTCMSGガイドラインでは、宿主因子とGM陽性のみ、あるいは宿主因子と臨床基準のみでは、それぞれ臨床データおよび真菌学的検査による裏付けとなる根拠がない限り、possibleな侵襲性真菌感染症とはみなされません。患者6は、宿主因子、主要および副次的な臨床的特徴、およびGM陽性が認められたため、2002年と2008年の両ガイドラインにおいてprobable（概ね確実）なIPAと診断されました。

最後に、LFDアッセイおよびPCRアッセイのいずれも、現在はE-O-R-T-C-M-S-Gのガイドラインに含まれていませんが、患者6および12のBAL検体において、これら2つのアッセイと市販のガラマンナンテストの結果は強く一致しており、本手順に従った結果、アスペルギルス抗原および核酸の存在が示されました。侵襲性真菌症を確認するために、Pella Glactomannan酵素免疫アッセイ、パンフ真菌β-グルカンテスト、またはアスペルギルスPCRテストなどの他の方法を並行して実施することも可能です。ヒト血清およびBAL液の取り扱いは極めて危険である場合があるため、装置の操作者は常にB型肝炎や結核などの疾患の予防接種を受けておく必要があることに留意してください。