マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

このビデオでは、磁気ビーズを用いた分離および蛍光活性化セルソーティングを用いた、造血前駆細胞の単離と表現型解析のプロトコルを実演します。まず、マウスから後肢、大腿骨、脛骨、および脊髄を摘出し、均質化して骨髄細胞懸濁液を調製します。その後、磁気マイクロビーズフローを用いて、C kitを発現する細胞を濃縮します。

濃縮された集団のサイトメトリー解析により、本手法が高純度の造血系細胞、前駆細胞、および造血幹細胞を回収できることが示されており、これらはin vitroおよびin vivoの機能研究に使用可能です。骨髄フラッシングなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、骨髄細胞をより効率的かつ迅速に回収できることです。本技術は、造血前駆細胞の表現型特性評価およびex vivo機能解析を可能にするため、炎症、自己免疫疾患、免疫不全症、退行性疾患、代謝異常、およびがん免疫モデルの治療や診断への応用が期待されます。

したがって、この手法は、さまざまな生理学的および病理学的条件下での造血作用のモニタリングに洞察を与えることができます。また、特定の前駆細胞サブセットにおける細胞生物学的シグナル伝達や、発生的に調節される遺伝子発現の研究にも利用可能です。まず、安楽死させたマウスをステンレス製パンに入れます。

細胞源となる骨を採取するため、腹部と背中を70%ethanolでスプレーします。ハサミを使用して後肢の皮膚に2箇所の小さな切開を加え、ピンセットを用いて大腿骨を脱臼させます。その後、マウスを仰向けにし、皮膚を縦方向に切開します。脊柱を露出させるため、脊柱を取り出します。

次に、尖端の鋭いハサミを使用して、脊柱からすべての軟組織残渣を慎重に取り除きます。大腿骨と脛骨から軟組織残渣を取り除くには、ガーゼを使用してください。

次に、骨を30 mLのサプリメント添加RPMI培地を含む50 mLコニカルチューブに入れます。滅菌乳鉢に4/5インチの滅菌フィルターを数枚敷きます。その後、ピンセットを使用して骨を乳鉢に移し、さらにフィルターの層で覆って摩擦面を作成します。

次に、40 µmのセルストレーナーフィルターを50 mLコニカルチューブに入れます。続いて、ペッスルを用いて、均質な細胞懸濁液が得られるまで骨を砕きます。そして、ピペットを使用して、懸濁液をセルフィルターに転送します。

次に、新鮮なサプリメント添加RPMIを5 mL乳鉢に加え、ピペッティングによって残った細胞を洗浄および回収します。その後、そのRPMIをフィルターの入ったチューブに加えます。均質化された骨が透明に見えるまで、以上の2つの手順を繰り返します。

溶液がフィルターを通過したら、新しい50 mLチューブに移し、再度ろ過して残りの組織片を除去します。4°Cで500 ×gで5分間遠心分離し、吸引によって上清を慎重に取り除きます。この際、細胞ペレットを乱さないように注意してください。

手順の次のステップは、造血前駆細胞の表現型を特性評価することです。まず、各マウスから得られた細胞ペレットを15 mLのPBSおよび2% FBSに再懸濁します。次に、チューブを4 °Cで500 ×g、5分間遠心分離し、上清を吸引により慎重に除去します。

ペレットを乱さないようにしてください。5 mLのPBSおよび2% FBSでペレットを懸濁し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。細胞濃度が確定したら、96ウェル丸底プレートの各ウェルに、細胞1×10⁵個分を分注します。

次に、プレートを500 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離中に、細胞を染色するために、ここに記載した表面マーカーに対するモノクローナル抗体をPBSおよび2% FBSで混合して調製します。遠心分離が完了したら、プレートを反転させて上清を除去し、各ウェルに抗体混合液を50 µLずつ加えます。

次に、マルチチャンネルピペットを使用してピぺッティングを行い、単一細胞懸濁液に解離させます。細胞を4°Cの暗所で20分間インキュベートします。インキュベーション後、150 µLのPBSおよび2%FBSで細胞を2回洗浄します。その後、プレートを500 ×gで5分間遠心分離します。

次に、プレートを反転させてセンナを廃棄します。続いて、2% FBS含有PBSで希釈した1:300のAP 3 size 7 strept adinを各ウェルに50 µL加え、ピペッティングによって単一細胞懸濁液に分散させます。細胞を4 °Cの暗所で10分間インキュベートし、インキュベーション後、次の工程へ進みます。

150 µLのPBSおよび2%FBSで細胞を2回洗浄します。プレートを遠心分離して上清を除去した後、細胞を100 µLのPBSおよび2%FBSに再懸濁し、サイトメトリーでサンプルを分析します。次に、造血細胞の選択したサブセットを分取するため、骨髄に対して磁気濃縮を行い、c-kit陽性細胞を濃縮します。少なくとも10匹のマウスから得られた骨髄の細胞ペレットを、1/50に希釈したPE標識c-kitモノクローナル抗体を含む1 mLの緩衝液で再懸濁します。

インキュベーション後、細胞を4°Cの暗所で20分間インキュベートします。40 mLの緩衝液で細胞を2回洗浄します。遠心分離後、上清を吸引して慎重に取り除きます。

次に、マウス1匹あたり50 µLのanti A PC microbeadsをペレットに直接加えます。よく混合し、暗所、4 °Cで20分間インキュベートした後、前述と同様に洗浄および遠心分離を行います。その後、細胞ペレットを4 mLの緩衝液で再懸濁します。マウス3匹につき、適切なmax separatorの磁場内にmax LS columnsを配置してください。

4 Lの緩衝液でカラムを洗浄して調製します。次に、細胞懸濁液を適用し、通過してくる未標識細胞を回収チューブに回収します。その後、緩衝液を数リットル用いて、カラムを3回洗浄します。

カラムのリザーバーが空になったら、新しいバッファーを追加します。すべての溶液が流出した後、流出液を廃棄し、セパレーターからカラムを取り出して、それぞれ15 mLコニカルチューブの上に配置します。各カラムに4 mLのバッファー溶液をピペットで加え、すぐにプランジャーをカラムに押し込んで、磁気標識された細胞を洗い出します。

チューブを500 ×gで5分間遠心分離します。吸引法を用いて上清を慎重に取り除きます。各ペレットを1 mLの緩衝液で再懸濁し、単一の15 mLコニカルチューブにまとめて回収します。

Sca-1陽性細胞集団を濃縮した後、FACSを用いて細胞の染色および分取を行います。磁気ビーズを用いてSca-1陽性細胞を濃縮した骨髄懸濁液から、本ビデオで説明した表面分子の発現に基づき、LT-HSCおよびST-HSCなどの造血前駆細胞および造血幹細胞を分取しました。この図は、共通リンパ球前駆細胞（CLP）をLin⁻としてスコア化するための電子ゲーティング手順の例を示しています。

interleukin seven R陽性細胞のlow画分を確認します。Lin陰性c-kit陽性Sca-1陽性、およびLin陰性c-kit陽性Sca-1陰性の細胞、そしてc-kit陽性ゲートからのlow細胞を確認してください。

共通骨髄系前駆細胞は、FC gamma R.Low CD 34陽性細胞として同定されます。また、C kit陽性ゲートにおいて、顆粒球・単球前駆細胞はFC gamma R high CD 34陽性細胞として、巨核球・赤血球前駆細胞はFC gamma R low CD 34陰性細胞として同定されます。LKS分画からは、L-T-H-S-CおよびS-T-H-S-CがそれぞれCD 34陰性およびCD 34陽性細胞として同定されます。これにより、生理的に低頻度でしか存在しない2つの濃縮および高度に精製された集団が得られ、対照群および炎症性腸疾患モデルマウスのHSCにおける自己免疫が造血に及ぼす影響を検討することが可能となります。

ここに示されているように、KI 67抗体およびDPIで染色しました。健康なコントロール群のLKS CD 34陰性造血幹細胞分画では、細胞周期にある細胞はほとんど、あるいは全く検出されません。対照的に、IBD発症時には同一の細胞サブセットが有意に増加し、相当数のHSCが細胞周期のSG2 M期に検出されます。

このように、T細胞介在性の慢性炎症がHSCの細胞周期への進入を決定していることが示唆されます。小胞に貯蔵されたATPの存在を評価するため、健康なマウス由来のCD34陰性細胞をヌクレオチド結合化合物であるキニンの染色に供しました。生細胞共焦点顕微鏡による核赤色分析の結果、GMPではなくHSCの細胞質においてキニン陽性の小胞が観察されました。HSCが細胞外ATPに反応するかを判断するため、4-0-2をロードしATPおよびイオノマイシンで刺激した分取済み造血幹細胞のカルシウム応答を、ここに示すように分析しました。単一細胞のカルシウム上昇波形は、ピューリナージックP2受容体の活性化により、LT-HSCにおいて細胞質カルシウムが増加したことを示しています。

細胞質内カルシウム濃度の上昇が小胞性ATPの放出を誘導するため、ATPにさらされると……。この実験は、ATPが造血幹細胞（HSC）からの自身の放出を調節している可能性を示唆しており、本手順がHSCの機能研究に利用可能であることを実証しています。このビデオを視聴することで、機能解析に向けた神経幹細胞および系統決定済み前駆細胞の分離方法について十分に理解できるはずです。本手順に続き、非照射レシピエントマウスへの再構成などの他の手法を行うことで、定常状態または炎症環境から精製された造血幹細胞の再構成能など、さらなる疑問を解明することが可能です。