Name: マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学ぶマウス骨髄造血幹細胞と前駆細胞の磁気ビーズ分離とフローサイトメトリーによる表現型解析法。この効率的な技術は高純度細胞分離と機能研究に応用可能です。

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我々は、貴重なアドバイスを信行紀夫、仁滝沢とマルクスマンツに感謝します。この作品は、スイス国立科学財団、スイスのがんリーグとFondazione Ticinese当たりラ未公表スルCancroによって資金を供給された。

1。骨髄からの細胞懸濁液の調製<ol><li>マウスを安楽死させると、その腹部と背面にステンレスパンとスプレー70％エタノール中に動物を配置します。後ろ足、と脊柱からの大腿骨と脛骨を収集します。 </li><li>正確に鋭い先端をハサミでとガーゼで足の骨から脊柱からすべての軟組織の残留物を除去する。 50μMβ-メルカプトエタノールを添加した10％の熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を含むRPMI培地30mLを、100μMのMEM非必須アミノ酸、1 mMのMEMピルビン酸ナトリウム、2 50mLのファルコンチューブに店の骨mM L-グルタミン、100μg/ mlのストレプトマイシン、100 U / mlペニシリン。 </li><li>滅菌フィルターで予め滅菌乳鉢の底をカバーしています。 </li><li>モルタルに骨を移し、摩擦面を組み立てるために、フィルターの層でそれらをカバーしています。 </li><li>ファルコンフィルタが設けられた50mLのファルコンチューブを準備します。 </li><li>骨を砕く均一な細胞懸濁液が得られるまで乳棒の助けを借りて。 </li><li>チューブに懸濁液を移す。 </li><li>残りの細胞を洗浄し、収穫する新鮮なRPMI完全培地中のモルタル5mLに追加します。 </li><li>均質化された骨が明らかに表示されるまで、最後の2点を繰り返します。 </li><li>残りの組織片を除去するために細胞懸濁液を移し、新しいチューブにフィルタリングします。 </li><li> 5分間1,500 rpmでチューブを遠心分離し、慎重に吸引して上清を除去します。細胞ペレットを乱さないようにしてください。 </li></ol> 2。表現型分析<ol><li> PBS、2％FBS 15mLに個々のマウスの細胞を再懸濁し、洗浄してください。 </li><li> 5分間1,500 rpmでチューブを遠心分離し、慎重に吸引して上清を除去します。ペレットを乱さないことを確認してください。 </li><li> 5 mLのPBS、2％FBSおよびcount細胞のペレットを一時停止します。 </li><li>転送1×10 6細胞/ウェル、96ウェル丸底でプレート。 </li><li> 5分間1,500 rpmでプレートを遠心分離します。 </li><li>以下の表面マーカーに対するモノクローナル抗体のミックスを調製する。それらの細胞を染色するためにPBS、2％FBSに示されている希釈します。 <ul type="disc"><li> PE-Cy5で1:200に結合したCD4、CD8、CD3、CD45R、CD19、GR1、TER119、NK1.1 </li><li> APC 1:100に結合したc-Kitの</li><li>ビオチン1:50〜共役SCA1 </li><li> FITC 1:50〜共役CD34 </li><li> PE 1:100に結合したFcγRと</li><li> PE-Cy7 1:100に結合したIL-7R </li></ul></li><li>上清を捨て、各ウェルにモノクローナル抗体ミックス50μLを追加します。ピペッティングにより単一細胞に解離する。 </li><li> 4℃で暗所で20分間細胞をインキュベート</li><li> PBS150μLの2％FBSで細胞を2回洗浄します。 </li><li> 5分間1500rpmでプレートを遠心分離し、反転板により上清を捨てる。 </li><li> PBS中でストレプトアビジンを希釈し、2％FBSは、細胞を染色することが示された。 <ul type="disc"><li>ストレプトアビジンコンジュAPC-Cy7 1:300にゲート</li></ul></li><li>各ウェルに溶液50​​μLを追加します。ピペッティングによって単一細胞懸濁液に解離する。 </li><li> 4℃で暗所で10分間細胞をインキュベート</li><li> PBS150μLの2％FBSで細胞を2回洗浄します。 </li><li> 5分間1,500 rpmでプレートを遠心し、上清を捨てる。 </li><li> PBS、2％FBSを100μLに細胞を再懸濁します。 </li><li> FACSでサンプルを取得します。 </li></ol> 3。のc-Kit +細胞の磁気濃縮<ol><li> PBS、pHは7.2、（BSA）0.5％ウシ血清アルブミン、および2mM EDTAを含む緩衝液を準備します。 </li><li>骨の細胞ペレットを再懸濁し1:50に希釈し、APCに結合したc-KitのmAbを含む緩衝液1mLに少なくとも10匹のマウスから派生した髄。 </li><li> 4℃で暗所で20分間細胞をインキュベート</li><li>緩衝液40mLで2回細胞を洗浄します。 </li><li> 5分間1,500 rpmでチューブを遠心分離し、慎重にtを削除する彼は、吸引によって上清。ペレットを乱さないことを確認してください。 </li><li>再懸濁し、細胞ペレットとペレットに直接各安楽死させたマウスの抗APC MicroBeadsは50μlを加える。 </li><li>よく混ぜ、4℃で暗所で20分間インキュベート</li><li> 5分間1,500 rpmで緩衝液、遠心分離を40 mLを加えることにより細胞を洗浄します。完全に上清を吸引除去する。 </li><li>緩衝液4 mLの安楽死させたすべての3匹のマウスの複数の再懸濁し、細胞ペレット。 </li><li>適当なのMACS Separatorの磁場内の場所MACS LSカラム。すべての3匹安楽死させた1列を使用しています。 </li><li>緩衝液4 mLで洗浄してカラムを準備します。 </li><li>カラムに細胞懸濁液を適用します。 </li><li>を通過し、緩衝液4 mLでカラムを洗浄し非標識の細胞を収集します。緩衝液4 mLの三回を追加することによって、洗濯の手順を実行します。カラムのリザーバーが空にされた新しいバッファを追加します。 </li><li>セパレータとPLACから列を削除します。電子15mlファルコンチューブの上に各1。 </li><li>各カラムに緩衝液をピペットで4mlの。すぐに列にプランジャーを押すことにより、磁気標識された細胞を洗い流す。 </li><li> 5分間1,500 rpmでチューブを遠心し、注意深く吸引により上清を除去します。 </li><li>シングル15mlファルコンチューブに緩衝液およびグループのペレットを1 mLの各ペレットを再懸濁します。 </li></ol> 4。造血幹細胞およびリネージュコミットされた前駆細胞の選別<ol><li>以下の表面マーカーに対するモノクローナル抗体のミックスを調製する。それらの細胞を染色するために500μLのPBS、2％FBSに示されている希釈します。 <ul type="disc"><li> PE-Cy5で1:200に結合したCD4、CD8、CD3、CD45R、CD19、GR1、TER119、NK1.1 </li><li> APC 1:100に結合したc-Kitの</li><li>ビオチン1:50〜Sca-1は共役</li><li> FITC 1:50〜共役CD34 </li><li> PE 1:100に結合したFcγRと</li></ul></li><li>先行するからチューブを遠心sは5分間1500 rpmでセクションを注意深く吸引して上清を除去します。 </li><li>ペレットにモノクローナル抗体ミックスを追加します。ピペッティングによって単一細胞懸濁液に解離する。 </li><li> 4℃で暗所で20分間細胞をインキュベート</li><li> PBS、2％FBSの14mLで2回細胞を洗浄します。 </li><li> 5分間1,500 rpmでチューブを遠心し、上清を捨てる。 </li><li>ストレプトアビジンなどの細胞を染色するために500μLのPBS、2％FBSに示されている希釈します。 <ul type="disc"><li> APC-Cy7 1:300に結合したストレプトアビジン</li></ul></li><li>チューブへの解決策を追加します。ピペッティングによって単一細胞懸濁液に解離する。 </li><li> 4℃で暗所で10分間細胞をインキュベート</li><li> PBS 14 mLおよび2％FBSで2回細胞を洗浄します。 </li><li> 5分間1,500 rpmでチューブを遠心し、上清を捨てる。 </li><li> PBS、2％FBSを500μLに細胞を再懸濁します。 </li><li>イーライするために、新しい5 mlチューブに細胞懸濁液を移し、フィルタリングソート手順を妨げる可能性の細胞凝集体をminate。 </li><li>ソートされた集団から7-AAD +死細胞を除外するために、細胞懸濁液に7-AADの5μL（それは1:100に希釈し使用）を追加します。 </li><li>以下の表現型に基づいてBD FACSAriaでソート細胞： <ul type="disc"><li> LKS細胞：LIN -のc-Kit + Sca-1は+ </li><li> LT-造血幹細胞：LKS CD34 - </li><li> ST-造血幹細胞：CD34 + LKS </li><li> GMPに：LIN -のc-Kit + Sca-1は低 FcγRと高い CD34 + </li><li>欧州議会：LIN -のc-Kit + Sca-1は低 FcγRと低い CD34 - </li><li>のCMP：LIN - CD34のc-Kit + Sca-1は低 FcγRと低い+ </li></ul></li></ol> 5。代表的な結果 1に示すように、電子ゲー手順の例を図スコアリンなどの一般的なリンパ球前駆細胞（CLPの） - / c-KitのLO /インターロイキン（IL）-7R +細胞;林- / c-Kitの+ / SCA-1 +（LKS）とリン- / c-Kitの+ / SCA -1 LO（のc-Kit +）細胞は、c-Kitの+ゲートから、共通の骨髄前駆細胞（CMPの）はFcγRとLO CD34 +細胞は、FcγRとハイ CD34 +細胞および/ ​​巨核球などの顆粒球/単球前駆細胞（GMPに）として識別されます。 FcγRとLO CD34などの赤血球前駆細胞（MEPS） -細胞; -それぞれとCD34 +細胞、LKSゲート、LT-HSCとST-HSCからCD34として同定されています。その後、上記の表現型に基づいてCD34の発現だけでなく、他の前駆細胞に応じて並べ替えることができLT-HSCとST-HSC、この骨髄細胞懸濁液を磁気ビーズ（ 図2）のc-Kit +細胞を濃縮することができます。 HSCはANAになります<html> 図4に示すように、ライブイメージング共焦点顕微鏡で溶菌ここで、CD34 -細胞はヌクレオチド結合化合物キナクリン11と同様に核赤（DRAQ5）で染色した。造血幹細胞ではなく、GMPには、キナクリン陽性小胞は細胞質12に表示されます。 + LT-HSCの暴露プリンP2受容体の活性化による細胞内Ca 2の増加を示し、図5に示すようにまた、ソートされた造血幹細胞は、機能の実験で使用することができアデノシン三リン酸（ATP）とイオノマイシン12。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig1.jpg" /> 図1 LIN-BM細胞の代表的なドットプロット解析。プロトコルのテキストで説明したように骨髄細胞懸濁液から造血前駆細胞と造血幹細胞を識別し、得点するためのフローサイトメーターでの電子ゲートの手順では、染色した。 pload/3736/3736fig2.jpg &quot;/&gt; 図2骨髄からのc-Kit +細胞の選択的濃縮のためのスキーム。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig3.jpg" /> 図3電子ゲートLKS CD34の細胞周期分析-健常者とKi-67抗体およびDAPIで染色したIBDを有するマウスにおける造血幹細胞。細胞が溶解/修正し、1μg/ mlでFITCコンジュゲートのKi-67およびDAPIで染色し、続いてバッファーをパーマで固定し、浸透させた。 LKS CD34内のすべての検出可能であればサイクリング細胞がほとんどです-健常者の造血幹細胞コンパートメント12。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig4.jpg" /> 図4 CD34をソートFACSのイメージング共焦点顕微鏡をライブ- HSCとGMPには、ヌクレオチド結合化合物のキナクリンと核赤（DRAQ5）で染色した。小さいの象限は、キナクリンposを表示itive小胞は造血幹細胞の細胞質内に検出されましたが、GMPにはありません。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3736/3736fig5.jpg" /> 図5。ソートされた造血幹細胞における細胞内Ca 2 +上昇がフラ-2をロードおよびATPとイオノマイシンで刺激した。単一細胞からのトレースが表示されます。すべての細胞は細胞外ATPは細胞質ゾルのCa 2の顕著な増加を示す+ ATPの添加後に反応した。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

ここで説明する方法は、個々のマウス（ 図1）における造血の迅速かつ正確な分析を可能にします。マウス炎症モデルでは、自己免疫疾患、免疫不全、変性疾患、代謝性疾患および癌を含む様々な実験設定ではこの分析は、造血における病理学的条件の影響に対処することができます。 図3は、電子的にゲートLKSにおける細胞周期活性の分析を示しています。 CD34 - Ki-67のmAb及びDAPIで染色することにより炎症性腸疾患（IBD）13と、健康なマウスとマウス由来の細胞。後者は、細胞周期のS / G 2 / M期の細胞の有意な増加が表示されます。フローサイトメトリーでこの分析では、HSCのサイクリング活動12のT細胞媒介性の炎症の影響を示しています。 フローcytometrの細胞選別でのc-Kitを発現する骨髄細胞の磁気標識と充実の組み合わせyは非常に造血系前駆細胞と造血幹細胞を精製分離することができます。得られた細胞集団は細胞生物学（ 図4）、<...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td>ギブコ</td><td> 42401 </td></tr><tr><td> MEM NEAA 100X </td><td>ギブコ</td><td> 11140 </td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>ギブコ</td><td> 11360 </td></tr><tr><td> PenStrep </td><td>ギブコ</td><td> 15070 </td></tr><tr><td> PBS </td><td>ギブコ</td><td> 20012 </td></tr><tr><td> FBS </td><td>ギブコ</td><td> 16000 </td></tr><tr><td>セルストレーナーは40μm </td><td> BDファルコン</td><td> 352340 </td></tr><tr><td> 7-AAD染色液</td><td> BD Pharmingen社</td><td> 559925 </td></tr><tr><td>バッファを溶解/修正</td><td> BD Pharmingen社</td><td> 558049 </td></tr><tr><td>バッファIIIをパーマ</td><td> BD Pharmingen社</td><td> 558050 </td> &lt;/ TR&gt; <tr><td> Ki-67の</td><td> BD Pharmingen社</td><td> 556026 </td></tr><tr><td> DAPI </td><td>インビトロジェン</td><td> D21490 </td></tr><tr><td> CD4（GK1.5） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 150041 </td></tr><tr><td> CD8（53から6.7） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 150081 </td></tr><tr><td> CD3（145-2C11） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 150031 </td></tr><tr><td> CD45R（RA3-6B2） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 150452 </td></tr><tr><td> CD19（6D5） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 150193 </td></tr><tr><td> GR1（RB6-8C5） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 155931 </td></tr><tr><td> Tre119（TER-119） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 155921 </td></tr><tr><td> NK-1.1（PK136） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 455941 </td></tr><tr><td>のc-Kit（2B8） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 171171 </td></tr><tr><td> SCA-1（D7） </td><td> eBiosciENCE </td><td> 135981 </td></tr><tr><td> CD34（RAM34） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 110341 </td></tr><tr><td> FcγRと（2.4G2） </td><td>ベイバイオサイエンス</td><td> 553145 </td></tr><tr><td>抗APC MicroBeadsは</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-090-855 </td></tr><tr><td> LSカラム</td><td>ミルテニーバイオテク</td><td> 130-042-401 </td></tr></tbody></table>

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

骨髄は、造血幹細胞とより成熟した血液細胞系列の前駆細胞が存在すると成人生体内で分化する主要なサイトです。造血幹細胞は、生命時間1のすべての血液細胞系列を生成することができる多能性細胞の分細胞集団を構成しています。骨髄中の造血幹細胞恒常性の分子解剖は、造血、腫瘍学、再生医療において重要な意味を持っています。我々は個々のマウス（ 図1）造血前駆細胞サブセットと造血幹細胞の分布を獲得するためにフローサイトメトリーで蛍光抗体、電子ゲートの手順でラベルプロトコルを記述します。加えて、我々は広範囲に造血前駆細胞と同様に長期的（LT）およびc-Kitを発現する細胞の磁気濃縮によりプールされた骨髄細胞懸濁液から造血幹細胞を再構成する短期（ST）を豊かにする方法について説明します。得られた細胞調製物は、in vitroで選択したサブセットをソートするために使用することができ、生体機能研究である（ 図2）。 両方の海綿骨芽細胞2,3と類 ​​洞内皮4は、骨髄中の造血幹細胞をサポートする機能的なニッチを構成しています。そのリガンドであるアンジオポエチン-1 5とN-カドヘリン+骨芽細胞3とHSCで発現する受容体チロシンキナーゼTie2の相互作用のサブセットを含む、骨芽細胞ニッチのいくつかのメカニズムは、造血幹細胞の休止を決定する際に同意する。骨髄中の&quot;休止状態&quot;は、レプリケーションや過度のサイクリング活動の6時の最終的な疲労から造血幹細胞を保護するために重要である。そのようなToll様受容体リガンドとしての自然免疫系の細胞7、インターフェロン-α6に作用する外因性の刺激はまた系統コミットされた前駆細胞に造血幹細胞の増殖と分化を誘導することができる。最近では、LIN内で休眠中のマウスの造血幹細胞の集団-のc-Kit + Sca-1は+ CD150 + CD48 - CD34 -人口が8に記載されています。ここで説明したように造血前駆細胞に富む細胞懸濁液からCD34の発現に基づいてセルの並べ替えは、静止自己再生LT-HSCとST-HSCの9の両方の分離を可能にします。系統陽性細胞の枯渇とCD48とFlk2抗体とLT-HSCのソートに基づいて同様の手順では、以前に10に記載されている。本報告では、表現型の特性と異なる生理学的および病理学的条件下で造血を監視するために有用である造血前駆細胞のex vivoでの細胞周期解析のためのプロトコルを提供しています。さらに、細胞生物学、シグナル伝達アッセイと同様に移植のために彼らの自己再生、拡大と分化を制御する要因とメカニズムを定義するために使用することができ造血幹細胞、の手順をソートFACSを説明します。

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit +細胞と細胞および分子研究のための造血幹細胞を精製するために細胞選別の磁気濃縮に基づいています。

骨髄は、成体において造血幹細胞（HSC）およびより成熟した血球系前駆細胞が生存し、分化する主要な部位である。HSCは...

このビデオでは、磁気ビーズを用いた分離および蛍光活性化セルソーティングを用いた、造血前駆細胞の単離と表現型解析のプロトコルを実演します。まず、マウスから後肢、大腿骨、脛骨、および脊髄を摘出し、均質化して骨髄細胞懸濁液を調製します。その後、磁気マイクロビーズフローを用いて、C kitを発現する細胞を濃縮します。濃縮された集団のサイトメトリー解析により、本手法が高純度の造血系細胞、前駆細胞、および造血幹細胞を回収できることが示されており、これらはin vitroおよびin vivoの機能研究に使用可能です。骨髄フラッシングなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、骨髄細胞をより効率的かつ迅速に回収できることです。本技術は、造血前駆細胞の表現型特性評価およびex vivo機能解析を可能にするため、炎症、自己免疫疾患、免疫不全症、退行性疾患、代謝異常、およびがん免疫モデルの治療や診断への応用が期待されます。したがって、この手法は、さまざまな生理学的および病理学的条件下での造血作用のモニタリングに洞察を与えることができます。また、特定の前駆細胞サブセットにおける細胞生物学的シグナル伝達や、発生的に調節される遺伝子発現の研究にも利用可能です。まず、安楽死させたマウスをステンレス製パンに入れます。細胞源となる骨を採取するため、腹部と背中を70%ethanolでスプレーします。ハサミを使用して後肢の皮膚に2箇所の小さな切開を加え、ピンセットを用いて大腿骨を脱臼させます。その後、マウスを仰向けにし、皮膚を縦方向に切開します。脊柱を露出させるため、脊柱を取り出します。次に、尖端の鋭いハサミを使用して、脊柱からすべての軟組織残渣を慎重に取り除きます。大腿骨と脛骨から軟組織残渣を取り除くには、ガーゼを使用してください。次に、骨を30 mLのサプリメント添加RPMI培地を含む50 mLコニカルチューブに入れます。滅菌乳鉢に4/5インチの滅菌フィルターを数枚敷きます。その後、ピンセットを使用して骨を乳鉢に移し、さらにフィルターの層で覆って摩擦面を作成します。次に、40 µmのセルストレーナーフィルターを50 mLコニカルチューブに入れます。続いて、ペッスルを用いて、均質な細胞懸濁液が得られるまで骨を砕きます。そして、ピペットを使用して、懸濁液をセルフィルターに転送します。次に、新鮮なサプリメント添加RPMIを5 mL乳鉢に加え、ピペッティングによって残った細胞を洗浄および回収します。その後、そのRPMIをフィルターの入ったチューブに加えます。均質化された骨が透明に見えるまで、以上の2つの手順を繰り返します。溶液がフィルターを通過したら、新しい50 mLチューブに移し、再度ろ過して残りの組織片を除去します。4°Cで500 ×gで5分間遠心分離し、吸引によって上清を慎重に取り除きます。この際、細胞ペレットを乱さないように注意してください。手順の次のステップは、造血前駆細胞の表現型を特性評価することです。まず、各マウスから得られた細胞ペレットを15 mLのPBSおよび2% FBSに再懸濁します。次に、チューブを4 °Cで500 ×g、5分間遠心分離し、上清を吸引により慎重に除去します。ペレットを乱さないようにしてください。5 mLのPBSおよび2% FBSでペレットを懸濁し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。細胞濃度が確定したら、96ウェル丸底プレートの各ウェルに、細胞1×10⁵個分を分注します。次に、プレートを500 ×gで5分間遠心分離します。遠心分離中に、細胞を染色するために、ここに記載した表面マーカーに対するモノクローナル抗体をPBSおよび2% FBSで混合して調製します。遠心分離が完了したら、プレートを反転させて上清を除去し、各ウェルに抗体混合液を50 µLずつ加えます。次に、マルチチャンネルピペットを使用してピぺッティングを行い、単一細胞懸濁液に解離させます。細胞を4°Cの暗所で20分間インキュベートします。インキュベーション後、150 µLのPBSおよび2%FBSで細胞を2回洗浄します。その後、プレートを500 ×gで5分間遠心分離します。次に、プレートを反転させてセンナを廃棄します。続いて、2% FBS含有PBSで希釈した1:300のAP 3 size 7 strept adinを各ウェルに50 µL加え、ピペッティングによって単一細胞懸濁液に分散させます。細胞を4 °Cの暗所で10分間インキュベートし、インキュベーション後、次の工程へ進みます。150 µLのPBSおよび2%FBSで細胞を2回洗浄します。プレートを遠心分離して上清を除去した後、細胞を100 µLのPBSおよび2%FBSに再懸濁し、サイトメトリーでサンプルを分析します。次に、造血細胞の選択したサブセットを分取するため、骨髄に対して磁気濃縮を行い、c-kit陽性細胞を濃縮します。少なくとも10匹のマウスから得られた骨髄の細胞ペレットを、1/50に希釈したPE標識c-kitモノクローナル抗体を含む1 mLの緩衝液で再懸濁します。インキュベーション後、細胞を4°Cの暗所で20分間インキュベートします。40 mLの緩衝液で細胞を2回洗浄します。遠心分離後、上清を吸引して慎重に取り除きます。次に、マウス1匹あたり50 µLのanti A PC microbeadsをペレットに直接加えます。よく混合し、暗所、4 °Cで20分間インキュベートした後、前述と同様に洗浄および遠心分離を行います。その後、細胞ペレットを4 mLの緩衝液で再懸濁します。マウス3匹につき、適切なmax separatorの磁場内にmax LS columnsを配置してください。4 Lの緩衝液でカラムを洗浄して調製します。次に、細胞懸濁液を適用し、通過してくる未標識細胞を回収チューブに回収します。その後、緩衝液を数リットル用いて、カラムを3回洗浄します。カラムのリザーバーが空になったら、新しいバッファーを追加します。すべての溶液が流出した後、流出液を廃棄し、セパレーターからカラムを取り出して、それぞれ15 mLコニカルチューブの上に配置します。各カラムに4 mLのバッファー溶液をピペットで加え、すぐにプランジャーをカラムに押し込んで、磁気標識された細胞を洗い出します。チューブを500 ×gで5分間遠心分離します。吸引法を用いて上清を慎重に取り除きます。各ペレットを1 mLの緩衝液で再懸濁し、単一の15 mLコニカルチューブにまとめて回収します。Sca-1陽性細胞集団を濃縮した後、FACSを用いて細胞の染色および分取を行います。磁気ビーズを用いてSca-1陽性細胞を濃縮した骨髄懸濁液から、本ビデオで説明した表面分子の発現に基づき、LT-HSCおよびST-HSCなどの造血前駆細胞および造血幹細胞を分取しました。この図は、共通リンパ球前駆細胞（CLP）をLin⁻としてスコア化するための電子ゲーティング手順の例を示しています。interleukin seven R陽性細胞のlow画分を確認します。Lin陰性c-kit陽性Sca-1陽性、およびLin陰性c-kit陽性Sca-1陰性の細胞、そしてc-kit陽性ゲートからのlow細胞を確認してください。共通骨髄系前駆細胞は、FC gamma R.Low CD 34陽性細胞として同定されます。また、C kit陽性ゲートにおいて、顆粒球・単球前駆細胞はFC gamma R high CD 34陽性細胞として、巨核球・赤血球前駆細胞はFC gamma R low CD 34陰性細胞として同定されます。LKS分画からは、L-T-H-S-CおよびS-T-H-S-CがそれぞれCD 34陰性およびCD 34陽性細胞として同定されます。これにより、生理的に低頻度でしか存在しない2つの濃縮および高度に精製された集団が得られ、対照群および炎症性腸疾患モデルマウスのHSCにおける自己免疫が造血に及ぼす影響を検討することが可能となります。ここに示されているように、KI 67抗体およびDPIで染色しました。健康なコントロール群のLKS CD 34陰性造血幹細胞分画では、細胞周期にある細胞はほとんど、あるいは全く検出されません。対照的に、IBD発症時には同一の細胞サブセットが有意に増加し、相当数のHSCが細胞周期のSG2 M期に検出されます。このように、T細胞介在性の慢性炎症がHSCの細胞周期への進入を決定していることが示唆されます。小胞に貯蔵されたATPの存在を評価するため、健康なマウス由来のCD34陰性細胞をヌクレオチド結合化合物であるキニンの染色に供しました。生細胞共焦点顕微鏡による核赤色分析の結果、GMPではなくHSCの細胞質においてキニン陽性の小胞が観察されました。HSCが細胞外ATPに反応するかを判断するため、4-0-2をロードしATPおよびイオノマイシンで刺激した分取済み造血幹細胞のカルシウム応答を、ここに示すように分析しました。単一細胞のカルシウム上昇波形は、ピューリナージックP2受容体の活性化により、LT-HSCにおいて細胞質カルシウムが増加したことを示しています。細胞質内カルシウム濃度の上昇が小胞性ATPの放出を誘導するため、ATPにさらされると……。この実験は、ATPが造血幹細胞（HSC）からの自身の放出を調節している可能性を示唆しており、本手順がHSCの機能研究に利用可能であることを実証しています。このビデオを視聴することで、機能解析に向けた神経幹細胞および系統決定済み前駆細胞の分離方法について十分に理解できるはずです。本手順に続き、非照射レシピエントマウスへの再構成などの他の手法を行うことで、定常状態または炎症環境から精製された造血幹細胞の再構成能など、さらなる疑問を解明することが可能です。

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このプロトコルの詳細マウス胚性幹細胞（ESC）と致死量の放射線照射、レシピエントマウスへの彼らのその後の注射から移植造血幹細胞の派生。簡単に言うと、ESCは、レトロウイルスHoxB4とOP9ストローマ細胞と造血サイトカインとの共培養に感染している胚様体、として区別されます。...

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

このビデオでは、胚から卵黄嚢と大動脈 - 生殖腺 -...

マウス卵黄嚢とAGMから早期の造血幹細胞の分離

造血幹細胞および前駆細胞のマーキングコンビナトリアル5蛍光タンパク質は、再生中に、骨髄の造血アーキテクチャへの洞察を提供し、共焦点および2光子顕微鏡を経由して、生体内のクローン追跡になります。この方法は、移植後の時間の大規模な期間、無傷の組織におけるスペクトル的にコード化されたHSPCs由来細胞の非侵襲的な運命のマッピングが可能になります。...

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

造血幹細胞および前駆細胞（HSPC）は、まだ少しはいくつかの内皮細胞は、血液が形成になることを指定するプロセスについて知られている、開発中に特殊な（造血）内皮細胞に由来します。我々は、マウス胚組織から造血内皮細胞およびHSPCの同時分離を可能にするフローサイトメトリーベースの方法を示しています。...

マウス胚性造血内皮細胞の単離

ここでマウスの萌芽期の開発中に造血幹細胞前駆体のクローンの解析手法を提案する.内皮細胞共培養と表現型特性と単一造血前駆細胞の生着を潜在的な特徴への移植胚大動脈性腺発生地域から単一セルの並べ替えインデックスを組み合わせています。...

並べ替え内皮細胞ニッチ共培養と組み合わせて 1 つのセル インデックスを使用して胚性造血幹細胞前駆体のクローン解析

識別し、並べ替え (MAC および FACS) 蛍光と磁気の組み合わせを使ってマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の 6 のサブセットを分離する方法を示します。このプロトコルは、体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化)、養子の転送実験生体内RNA ・...

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

我々 は遺伝子組み換えの造血細胞の悪性の可能性を評価するために造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植) の使用について説明します。造血幹細胞移植、マウス骨髄異形成症候群 (MDS) や白血病の新規治療法を評価するための大規模コホートの生成し同様、生体内で様々...

骨髄異形成症候群の起源を評価するために造血幹細胞移植の使用

この方法は、マウス大腿骨、脛骨、および骨盤骨からのMEPおよびMKpのフローサイトメトリーによる精製を記述する。...

マウスメガ核球前駆細胞の分離

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。...

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

Hoxb5レポーターシステムを使用して、長期造血幹細胞(LT-HSC)および短期造血幹細胞(ST-HSC)を分離するための段階的なプロトコルを提示します。...

長期および短期造血幹細胞の単離方法

ここでは、細胞分裂の数、表面細胞の表現型、および細胞の親族関係を同時に測定できるフローサイトメトリーベースの技術を紹介します。これらのプロパティは、順列ベースのフレームワークを使用して統計的にテストできます。...

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

学ぶマウス骨髄造血幹細胞と前駆細胞の磁気ビーズ分離とフローサイトメトリーによる表現型解析法。この効率的な技術は高純度細胞分離と機能研究に応用可能です。

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

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