マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

このビデオでは、磁気ビーズベースの分離と蛍光活性化細胞ソーシングを使用した造血前駆細胞の単離と表現型特性評価のプロトコールを示しています。まず、マウスから後肢、大腿骨、脛骨、脊髄を解剖し、均質化して骨髄細胞懸濁液を生成します。その後、磁気マイクロビーズフローを使用してCキットを発現する細胞に集団を濃縮します。

濃縮集団のサイトメトリー解析により、この方法では高度に精製された造血系統、前駆細胞、造血幹細胞が得られ、これらはin vitroおよびin vivoの機能研究に使用できることが示されています。骨フラッシングのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、骨髄細胞のより効率的で迅速な回復を可能にすることです。この手法の意味するところは、造血前駆細胞の表現型の特徴付けとex vivo機能解析を可能にするため、炎症、自己免疫、免疫不全、変性疾患、代謝障害、およびがん免疫モデルの治療または診断にまで及びます。

したがって、この方法は、さまざまな生理学的および病理学的状態での造血のモニタリングに関する洞察を提供できます。また、細胞生物学のシグナルトランザクションや、異なる前駆サブセットにおける発生的に制御された遺伝子発現の研究にも使用できます。安楽死させたマウスをステンレス製の鍋に入れることから始めます。

腹部と背中に70%エタノールをスプレーして、細胞の供給源として使用される骨を収集します。ハサミを使用して、鉗子の助けを借りて後肢の皮膚に2つの小さな開口部を作り、大腿骨を脱臼させ、マウスを逆さまにして皮膚を縦方向に切ります。脊柱を表示するには、脊柱を取り外します。

次に、鋭利な先端のはさみを使用します。脊柱からすべての軟部組織の残留物を慎重に取り除きます。ガーゼを使用して、大腿骨と脛骨から軟部組織の残留物を取り除きます。

次に、30ミリリットルのRPMIを補充した50ミリリットルの円錐形チューブに骨を入れます。中程度。滅菌乳鉢にいくつかの5分の4の滅菌フィルターを置きます。次に、鉗子を使用して骨をモルタルに移し、フィルターの別の層でそれらを覆って摩擦面を組み立てます。

次に、40ミクロンのセルストレーナーフィルターを50ミリリットルの円錐管に入れます。次に、乳棒を使用して、均質な細胞懸濁液が得られるまで骨を粉砕します。そして、ピペットを使用して、懸濁液を細胞フィルターに移します。

次に、5ミリリットルの新鮮な補充RPMIを乳鉢に加え、残りの細胞を洗浄して収穫します。次に、フィルター付きのチューブにRPMIを追加します。均質化された骨がはっきり見えるまで、最後の2つのポイントを繰り返します。

溶液がフィルターを通過したら、新しい50ミリリットルのチューブとフィルターに移し、このプロセスを繰り返して残りの組織の破片を取り除きます。セントリフ。チューブをGの500倍で摂氏4度で5分間使用し、吸引して仰臥位を慎重に取り除きます。細胞ペレットを乱さないように注意してください。

手順の次のステップは、造血前駆細胞の表現型を特徴付けることです。まず、Resusが各マウスの細胞口蓋を15ミリリットルのPBSと2%FBSに懸濁させます。次に、チューブをGの500倍で摂氏4度で5分間遠心分離し、吸引によって仰臥位を慎重に除去します。

ペレットを邪魔しないでください。リースは、ペレットを5ミリリットルのPBSと2%FBSで曲げ、ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントしました。細胞濃度が決定されたら、6つの細胞のうち1セントを96ウェルの丸い底板上の各ウェルに移します。

次に、プレートをGの500倍で5分間遠心分離します。スピン中に、ここに挙げたPBSおよび2%FBSの表面マーカーに対するモノクローナル抗体の混合物を調製し、細胞を染色します。スピンが完了したら、プレートを反転させて仰臥位を廃棄し、各ウェルに50マイクロリットルの抗体ミックスを加えます。

次に、マルチチャンネルピペッターピペットを上下に使用して、単一細胞懸濁液に解離します。インキュベーション後、暗所で4°Cで細胞を20分間インキュベートし、150マイクロリットルのPBSと2%FBSで細胞を2回洗浄します。次に、プレートをGの500倍で5分間遠心分離します。

次に、プレートを反転させてセンナを捨てます。次に、希釈した1〜300 APの3サイズ7ストレプトアジンをPBS中に2%FBSで希釈した50マイクロリットルを、ピペッティングにより各ウェルを単細胞懸濁液に解離させます。インキュベーション後、暗所で摂氏4度で細胞を10分間インキュベートします。

150マイクロリットルのPBSと2%FBSで細胞を2回洗浄します プレートを遠心分離した後、S上清を廃棄し、100マイクロリットルのPBSと2%FBSで細胞を再懸濁し、サイトメトリーでサンプルを分析します。次に、造血細胞の選択されたサブセットを選別するために、骨髄に対して磁気濃縮を行い、秘密の陽性細胞を濃縮します。リースは、少なくとも10匹のマウスに由来する骨マローの細胞パルを、1〜50に希釈したPCに結合したCキットモノクローナル抗体を含む1ミリリットルの緩衝液に費やします。

インキュベーション後、暗所で摂氏4度で細胞を20分間インキュベートします。細胞を40ミリリットルの緩衝液で2回洗浄します。遠心分離後、仰臥位のナタムを吸引して慎重に除去します。

次に、マウスあたり50マイクロリットルの抗A PCマイクロビーズをペレットに直接加えます。よく混合し、インキュベーション後、暗所で摂氏4度で20分間インキュベートし、前と同じように細胞を洗浄して回転させます。次に、細胞ペレットを4ミリリットルの緩衝液に再懸濁します マウス3匹ごとに、最大LSカラムを適切な最大セパレーターの磁場に配置します。

4リットルの緩衝液ですすいでカラムを調製します。次に、細胞懸濁液を塗布し、通過する非標識細胞を収集チューブに収集します。カラムを1リットルの緩衝液で3回洗浄します。

カラムリザーバーが空になったら、新しいバッファーを追加します。すべての溶液が流れたら、廃棄フロースルーで、セパレーターからカラムを取り外し、15ミリリットルの円錐管の上に各カラムを置きます。各カラムに4ミリリットルの緩衝液をピペットで注入し、プランジャーをカラムに押し込むことにより、磁気的に標識された細胞をすぐに洗い流します。

チューブをGの500倍で5分間遠心分離します。吸引してSUPナタムを慎重に取り外します。各ペレットを1ミリリットルの緩衝液で再懸濁し、ペレットを1本の15ミリリットルの円錐管にグループ化します。

シーキット陽性細胞集団が濃縮されたら、細胞を染色し、事実に基づいて選別します。このビデオで説明されているように、磁気ビーズとLT HSCおよびTHSCを使用してシーキット陽性細胞に濃縮された骨髄懸濁液からの造血前駆細胞と造血幹細胞を、表面分子の発現に従って選別しました。この図は、一般的なリンパ系前駆細胞をリニンとしてスコアリングする電子ゲーティング手順の例を示しています。

それを参照してください 低インターロイキン 7 R 陽性細胞。リンマイナスは、それプラスの傷跡1つとリニンは、キットポジティブの傷跡1を参照してください。SEEキットの陽性歩行からの低細胞。

一般的な骨髄系前駆細胞は、FC γ R.Low CD 34陽性細胞として同定されます。また、Cキット陽性歩行顆粒球単球前駆細胞はFCガンマとして同定され、高CD34陽性細胞および巨核球赤血球前駆細胞はFCガンマとして同定され、低CD34陰性細胞はLKSから8つのL-T-H-S-CおよびS-T-H-S-CがそれぞれCD34陰性細胞およびCD34陽性細胞として同定される。したがって、炎症性腸疾患の対照およびマウスからの造血幹細胞に対する自己免疫の影響に対処するために、生理学的に少ない数で存在する2つの濃縮および高度に精製された集団が得られます。

ここに見られるように、KI 67抗体とDPIで染色しました。サイクリング細胞は、健康なコントロールのLKS CD 34陰性造血幹細胞コンパートメントでは、たとえあったとしても、ほとんど検出できません。対照的に、IBD中に同じ細胞サブセットが有意に増加し、細胞周期のSG2つのM期でかなりの数のHSCが検出されます。

したがって、T細胞媒介性慢性炎症がHSCの細胞周期への侵入を決定することが示唆されています。健康なマウスのCD34陰性細胞をヌクレオチド結合化合物キニーネで染色し、生細胞共焦点顕微鏡による核レッド分析により、小胞CDに保存されたTPの存在を評価するために、GMPではなくHSCでは、HSCが細胞外A TPに応答するかどうかを決定するために、細胞質に陽性小胞が見えることが明らかになりました。4 0 2をロードし、TPおよびイオンマイシンで刺激した選別造血幹細胞のカルシウム応答を、ここで見られるように解析した。単一細胞カルシウム上昇の痕跡は、純粋なアネルグ性P 2受容体の活性化により、LT HSCの細胞質カルシウムが増加したことを示しています。

細胞質カルシウムの上昇により水疱性A TPの放出が誘発されるため、TPにさらされると。この実験は、TPがHSCからの自身の放出を調節する可能性があることを示唆しており、この手順がHSCの機能研究に使用できることを示しています。このビデオを見れば、機能アッセイのためにニューロントポ幹細胞を単離し、系統コミットされた前駆細胞を単離する方法を十分に理解できるはずです。この手順に続いて、C状態または炎症環境から精製された造血幹細胞の再構成の可能性などの追加の質問に答えるために、非放射線被曝レシピエントマウスの再構成などの他の方法を実行できます。