ヒト血液の小さなサンプルから単球および樹状細胞のlineage特異的Toll様受容体を介するシグナル伝達の定量的イメージング

本実験の全体的な目的は、明確に定義された患者コホート由来の一次免疫細胞における細胞メカニズムを定量化するためのイメージストリーム技術の使用法を実証することです。これは、まず患者または健康なボランティアから採取した血液サンプルから末梢血単核細胞（pbmc）を単離することによって達成されます。単離後、細胞を活性化させ、蛍光ラベルを付加します。

次に、細胞を流体力学的に集光させ、レーザー光で励起し、タイムディレイインテグレーション（TDI）CCDカメラで撮像します。最後に、イメージストリームサイトメーターを用いて画像を収集し、NF kappa bを定量します。

各細胞画像のトランスロケーションは、ideasソフトウェアを用いて行います。最終的に、ドットプロット、ヒストグラム、および細胞画像の解析を通じて、各被験者群間の差を判定することができます。イメージストリームの利点は、フローサイトメトリーのデータと免疫蛍光法を組み合わせられる点にあります。

少量の血液サンプルのみから、単一細胞または集団レベルで、系統特異的な細胞シグナル伝達経路を解析することが可能です。この手法は、シグナル伝達中間体を局在化および定量化することで、知見における重要な疑問への回答に寄与します。例えば、転写因子の核移行を介した作用の調査や、細胞生物学における老化の影響の検討に利用できます。

当研究室のリーダーが、ヒトボランティアから得られた末梢血単核球（PBMC）を分離した後、その手法を実演します。回収したPBMCを培地0.6 mLあたり3×10⁶ cellsの密度で再懸濁し、細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移します。次に、一部の細胞をここに示すTLR8アゴニストのR848などの活性化剤で刺激し、すべての細胞を5% CO₂インキュベーター内で37 °C、10〜60分間インキュベートします。

インキュベーション後、室温で500 ×gで5分間遠心分離して細胞をペレットにし、上清を捨てます。単球またはDC系に特異的な表面抗体カクテルを用いて、4 °Cで20分間細胞をラベルします。この際、コンペンセーションコントロールとして使用する、単色コンジュゲートでラベルした細胞のチューブも含めてください。その後、4% PFA-PBS中で室温で10分間細胞を固定します。室温で500 ×gで10分間遠心分離した後、pbmcを凍結緩衝液に再懸濁し、アッセイ当日の解析まで-80 °Cで保存します。

37°Cのウォーターバスで細胞を急速解凍し、遠心分離して凍結保存液を除去した後、100 µLのBD perm wash bufferで透過処理を行います。次に、ここに示すanti NF kappa BP 65抗体などの細胞内シグナル伝達成分に対する抗体を用い、室温で20分間ラベル付けします。細胞をペレットにした後、goat anti rabbit IgGを含む100 µLのBD perm wash bufferで再懸濁します。

Alexa 647を加え、PBMCを室温でさらに20分間インキュベートします。イメージングの直前に、核染色剤で細胞を対比染色します。まずImageStreamの電源を入れ、Inspireソフトウェアを起動します。次に、[Load Default Template]をクリックし、[Initialize Fluidics]を選択します。

次に、イメージギャラリーメニューをクリックして「すべて選択」を選択します。続いて「run set up」を押し、ビーズのイメージングを開始し、明視野チャネルを選択します。スピードビーズが動作したら、「assist」タブの「start all」をクリックして、装置のキャリブレーションとテストを行います。

ImageStreamシステムのキャリブレーション完了後、[flush, lock and load]ボタンを押して、最も明るいサンプルを装置にロードします。次に、ドットプロットで測定される各FloraChromeの最大画素値が104,000カウントになるようにレーザー出力を設定します。その後、細胞の分類基準を設定してください。

次に「run」および「acquire」をクリックして、実験データファイルを収集し保存します。データファイルを解析するには、まず解析ソフトウェアを開きます。補正済み画像ファイルを作成し、次に、核染色の強度が正常で、核染色のアスペクト比が高いイベントでゲートを設定します。R1ゲート内の単一細胞をデブリや多細胞イベントから区別します。単球はCD14陽性細胞のゲート内に見られ、CD11cが高く、CD4およびlin1マーカーが低い骨髄系樹状細胞はR3ゲート内にあります。

最後に、IDEASソフトウェアを使用して、細胞質転写因子NF kappa Bと核染色の共局在を判定します。NF kappa Bと核染色の高い相関は、これら2つのマーカーの共局在を示しており、高い類似性スコアとして反映され、細胞の活性化度合いを示します。異なる処理群または患者集団間における高い類似性イベントの割合を比較することで、細胞の相対的な機能効率を評価できます。

その後、ソフトウェアを使用して、集団ヒストグラムの主要なセグメントから細胞の画像を表示させることができます。ImageStreamを用いることで、pbmcから直接細胞サブセットのゲーティングを行い、ゲート済みでソートされていない細胞集団から細胞応答のイメージングを行うことが可能です。ここでは、lin one 陰性、CD four dim、CD 11 C 陽性の骨髄系DCにおける、TLRシグナル伝達がNF kappa BP 65の核局在に及ぼす影響をベースラインで定量化しました。

刺激前の細胞では、細胞質に転写因子NF kappa BP 65を持つ細胞が高い割合で観察されました。刺激後、処理した細胞において、NF Kappa BP 65と核染色剤PIの類似性スコアが有意に高くなったことが判明し、これは刺激後にNF Kappa BP 65が核内へ移行したことを示しています。未処理の細胞群とR 8 48刺激細胞群を同時に収集したデジタル画像には、代表的な細胞と、細胞核へ移行したNF kappa Bの強度が表示されています。未処理の細胞と比較して、R 8 48刺激群ではNF Kappa BおよびPI染色の強度がより明るくなっていることに注目してください。

私たちは、異なる年齢のドナーから得られた細胞にこの手法を適用し、TLRを介したNF kappa B活性化経路に差異があることを示しました。この手法を習得すれば、画像解析に要する時間を除けば1日以内に完了させることができ、複数の局在画像と集団統計の両方を得ることが可能です。さらに、物理的な分離を行うことなく、複数の細胞集団から直接応答を画像化できます。イメージストリームは多くの細胞メカニズムに広く適用でき、トランスレーショナルリサーチにおいて非常に有用であると考えられます。