Name: 培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学ぶ 培養海馬神経細胞における膜タンパク質の動態解析法。蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて、エキソサイトーシスイベントとタンパク質輸送のリアルタイム可視化を実現します。

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我々は、財政支援のためにWellcome TrustとERCに感謝しています。 IMGGはEMBOフェローです。 KLHは、BBSRCの資金博士課程の学生です。我々は、顕微鏡による保守と支援のための技術的および細胞培養支持体と博士アンドリュー·ドハーティのためにフィリップ·ルービンとパトリックTidballに感謝します。

1。細胞培養、ウイルス伝達、およびタンパク質発現<ol><li> in vitroで 14から25日（DIV）のポリ-L-リジンコートしたカバーガラス上に胎生18日（E18）仔ラットからの培養高密度海馬ニューロン。 </li><li>前の超黄道pHluorin（SEP）でタグライブの実験は、目的の膜タンパク質を含む弱毒シンドビスウイルスによる形質導入細胞の6-24。 </li><li>培地1mLのを含んでいるカバースリップに直接偽ウイルス含有培地を追加し、培養インキュベーターに戻されます。ウイルスの伝達以下のタンパク質発現のための力価と時間は、ウイルスのバッチによって異なりますし、前の生細胞の実験を開始するにバッチごとに決定されるべきである。 </li></ol> 2。 FRAP-FLIP生細胞イメージング<ol><li> 機器のセットアップ <ol><li>ツァイスAxiovert LSM 510 META共焦点顕微鏡の撮像室にカバースリップを転送します。撮影時に電力の変動を最小限に抑えるために、顕微鏡イメージングの前に少なくとも20分間、100％のレーザー出力で、オンされていることを確認。 </li><li>すぐに、140 mM NaClを含む予め温めておいた（37°C）細胞外記録液、5mMのKClを、15 mMグルコース、1.5mMのCaCl 2を 、1.5mMのMgCl 2、20〜25 mMのHEPES（pHに調整して培養液を交換するNaOHで7.4）とツァイスAxiovertの予熱段階（37℃）に室を配置します。 細胞外記録液の浸透圧があなたの培地の10浸透圧範囲内に調整されていることを確認してください。有意な蒸発実験の経時中に発生しない限り、このCO 2の独立したソリューションは、短期実験（&lt;10時間）に適しています。 1から2 mMの炭酸水素ナトリウムで補完することをお勧めします。 </li></ol></li><li> 画像のキャプチャパラメータを定義する <ol><li>まず、組換えプロを表現するニューロンを同定興味のあるテインとフォーカスにそれをもたらす。 </li><li> 63X油は反対に、低レーザパワーで488nmのレーザー光の励起を使用してセル全体のイメージを取得します。退色最小限に抑えるために、（512から512）総走査速度&lt;1秒維持速い公称速度（7-9）と低画素の解像度を使用します。 </li><li> ROIを（〜1.5から2.5倍光学ズーム）を含むフレームをキャプチャした画像とズームの樹状突起の部分を選択します。可能であれば、リファレンス·樹状突起からの測定値を得ることができるように、視野が発生している非特異的買収による退色かどうかを判断するために、いくつかのプロセスが含まれていることを確認してください。 </li><li>フィルター、ピンホール、スキャン速度と最小のレーザー励起からではなく、限られた彩度の最大の蛍光を有効にするには、検出器のゲインを調整します。大きなピンホール径（2μmのは、棘と三元樹状突起に適しています）光子コレクションを最大化するために、推奨されます。検出器のゲインは、小さな蛍光増分を検出するのに十分な強さでなければなりません退色する前に、非常に最初のイメージは、飽和ピクセルの10％を克服しないような。 </li><li>実験のプリ/ポスト·漂白剤と回復の段階に使用するこの設定を保存します。 </li><li>次の退色領域を定義し、後続の反復的な退色相の初期退色と隣接領域のROIを選択します。フランキング領域（通常は5μm以下、図を参照してください。2）スキャンの間に拡散して、リカバリを防止するために十分な幅であることを確認します。 </li><li>退色のROIの両方の漂白パラメータを調整します。初期の光退色は、光学ズームとROIのボリュームに応じて、1-5回の反復の間に必要な迅速な（0.1〜0.5秒）でなければなりません。隣接する地域では、レーザー励起は光毒性が損傷することなく、隣接領域の連続光退色を確保するために調整する必要があります。 </li><li>ガイドラインとして、我々は最初の光退色に100％のレーザー励起を使用して、反復的な退色のpHは10％ASE。 </li></ol></li><li> 画像収集 <ol><li>すべてのパラメータが設定されていたら、以下の4ブロックで説明されている変数タイムラプスイメージシーケンスとしてFRAP-FLIPの実験を、実行します。 ブロック1：3-10プレ漂白剤のベースラインイメージ、低レーザパワーで、時間がないの遅延 ブロック2：光退色完全なレーザーパワーで中心的なROI、1-5回の反復 ブロック3：3-10ポスト漂白リカバリイメージ ブロック4：1の典型的な時間間隔で画像キャプチャを持つ媒体のレーザーパワーで隣接領域の繰り返し退色 - 5秒、調査中のタンパク質の回収率に応じて。 </li><li>最後に、140mMのNaCl、5 mMの塩化カリウム、15mMのグルコース、1.5mMのCaCl 2を 、1.5mMのMgCl 2、20〜25 mMのMES（蛍光クエンチするために）または50 mMの補完を含むpH6ででバッファ記録液で細胞外記録のソリューションを置き換える90 mM塩化ナトリウム、5 mMの塩化カリウム、15mMのグルコース、1.8 mMのCaCl 2を 、0.8mMの塩化アンモニウムを含むのMgCl 2、20から25 mMのHEPES、pH7.4の（低pH細胞内貯蔵中のタンパク質を明らかにする）、（図2参照）。 </li><li>統計分析を有効にするには、それぞれの組換えタンパク質に対して少なくとも10から20のデータセットを収集します。バイアスの結果を避けるために、撮像条件は、複製され一貫した維持されていることを確認してください。任意のデータを破棄する不完全な漂白、重要な焦点面のドリフトや光毒性細胞の損傷が観察されている場所を設定します。 </li></ol></li></ol> 3。データ解析<ol><li> ImageJのソフトウェアで画像を開きます。 </li><li> Stackregプラグイン（プラグイン→stackreg→変換を用いた時系列全体で発生した可能性があり、xy平面の小さな変動を考慮するためにスタックを整列：剛体→ <ok> 。） </ok></li><li>ツァイス焦点で撮影した画像は、テキストフ​​ァイルとして、時刻の値を報告するLSM Toolboxのプラグインを使用する（プラグイン→LSMツール]→[LSMツール→ <apply stamps=""> → <apply t-stamp=""> ）および分析のスプレッドシートにこれらの値をインポートします。 </apply></apply></li><li> FRAP-FLIP実験中の蛍光の変動を測定するために、個々の画素領域（〜20pixels）に退色セグメントを分割し、各時点（F）でこれらのROIの平均蛍光を測定します。すぐにこれらの値を取得するには、ImageJの &quot;ROIマネージャ&quot;分析ツール（→ツール→ROI Managerを分析する）を使用して複数のROIを選択し、 &quot;プロットZ軸プロファイルのコマンドを実行します（使用して、ピクセルあたりの平均蛍光を報告画像→スタック→プロットZ軸のプロファイル）。 </li><li>背景は、非蛍光の領域の蛍光強度を測定するには、この手順を繰り返します。 </li><li>実験的なノイズを除去し、平均プリ漂白ベースラインの測定ですべての値を分割してバックグラウンド値を差し引くことにより、各時点で蛍光強度を正規化します。 </li><li>非特定のレベルを評価するために隣接する非退色樹状突起の蛍光強度を測定する取得中に退色。非特定の退色の補正は &quot;FRAP-FLIPのデータの解釈のために推奨され、可能な限り避けるべきである。 </li><li>大幅な回復はROIで行われた場合に計算するには、最初の5〜10の対策（ΔF）の平均値から、シーケンスの最後の5から10までの対策の平均値を減算し、統計的有意性を決定します。エキソサイトーシスのパターン（すなわち、エキソサイトーシスのホットスポットや背骨対シャフトの回復）を評価するための回復と非回復ROIを分類します。 </li></ol> 4。代表的な結果典型的なFRAP-FLIP実験の結果は、図に示されています。 2。ここでは、9月でタグ付けのAMPA型グルタミン酸受容体のサブユニットGluA2を表現するニューロンが選択的に樹状突起の領域に沿って退色しています。図2.Aは、イメージングと（ホワイトボックス領域）退色のために選択されているROIを示していますされている樹状突起の領域を示しています。番目の電子大きな白いボックス領域が二重に向かっ青矢印で強調表示された隣接するボックス領域の漂白繰り返し、続いて一回漂白されました。赤い矢印が下のパネルで高倍率に示すように、測定されたROIを示しています。 図2.Bは、実験の時間経過とともに測定したROI内の蛍光強度を示しています。この例では、1分間の回復期間は無漂白の受容体は横方向の拡散によってROIを入力できるようにするための最初の光退色後に記録した。フランキング領域を退色されている場合、受容体のこの非常に運動性の画分からの蛍光シグナルは、中央領域から遮蔽されており、地域内のものは外で希釈されています。 &quot;FLIP&quot;シーケンスにわたって観察蛍光（ΔF）の増加は、したがって、樹状シャフトのSEP-GluA2の挿入に起因することができます。低pHの洗浄とpH 7.4 +塩化アンモニウムに加え、それぞれ測定した蛍光は、表面から導出されていることを確認タンパク質や測定ROI内の細胞、隔離タンパク質の割合を明らかにした。 FRAPとは対照的に、この方法論は退色領域の蛍光の回復を大幅に低減レベル、その結果、エキソサイトーシスによる回復を分離します。ない信頼性の数学的モデルを常にないようにすると、この選択的な漂白技術を使用して記録された回復トレースを適合し、分析するために開発されました。それはモノ指数回復で回復のトレースに合うように、しかし可能です： F（T）= S 0 - E（-t /τ）の F（t）は時刻tでの蛍光である場合には、sは 、定常状態の値である0は時間0でのオフセットで、τは時定数である。回復の伸びは、挿入と拡散の間で定常状態に対応する平衡に到達するために与えられたレートで固定されています。重要なのは、時定数は、このから抽出されたnalysisはエキソサイトーシスの時定数を反映していないだけで個々のタンパク質の比較処理に使用することができます。 また、蛍光回復の予想パ​​ターンは、退色領域に沿ってサブドメインで観察される可能性がある。退色セグメント内の小さなROIの分析は、エキソサイトーシス &quot;ホットスポット&quot;を明らかにするために不可欠である可能性があり、それは計算速度に影響を与える樹状突起の間でこれらのスポットの密度のばらつきと同程度の長さの領域を解析することをお勧めします。 図3は、ビューのフィールドに複数の樹状突起を持つ大規模なセクションのROIに光退色を適用し、このプロトコルの拡張を示しています、1つだけの樹状突起の漂白選択の繰り返しが続く。このアプローチは、従来の &quot;FRAP&quot;と並行して取得するための &quot;FRAP-FLIPのデータを有効にします。この例では、海馬ニューロンは、カイニン酸クラスのグルタミン酸受容体サブユニットに感染している。GluK2 SEP-タグが付けられます。 PRIOrは、イメージング、これらのニューロンは、されたタンパク質合成をブロックするために、cylcohexamide（200μg/mlで約2時間）で処理した。それぞれの測定されたROI（図3.B）のような、蛍光回復としては、 &quot;FRAP-FLIP &#39;プロトコルに受ける樹状突起に単独でリサイクル対標準FRAPの樹状突起の側方拡散やリサイクルによる回収の割合を明らかにする。 FRAP対&quot;FRAP-FLIP&quot;の回復曲線からΔF値を比較し、リサイクル（ΔFREC = 11.05パーセント）対側方拡散（ΔF のdiff = 9.35パーセント）の相対的な寄与を推測することができます。図2とは異なり、回復はタンパク質合成の阻害に起因するではなく、定常状態のレベルを維持していませんが、観察可能な受容体プールの枯渇（に相当する約20％減少し、信号の一時的増加、ドロップオフ、後続を示しています。記録期間）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig1.jpg" /></P&gt; 図1。FRAP FRAP VS-FLIPプロトコルのプリンシパルの模式図この図は、SEP-タグ付き受容体を使用して、 &quot;FRAP-FLIP &#39;プロトコルに対する定期的なFRAPの成果を示しています。従来のFRAPの蛍光回復が左側に表示されます。中央のROIの測定蛍光回復は、リサイクルおよび/ ​​または樹状シャフトにde novoのエキソサイトーシスを介して退色ROIと受容体の挿入、外部からの側方拡散fは非退色SEP-タグ付き受容体の組み合わせに起因しています。対照的に、右側に示す隣接するROIの反復的な退色は、横方向に拡散するためにどのようにこの更新 &quot;FRAP-FLIP &#39;プロトコル無音の回復を示しています。このように、任意の測定した蛍光の回復がROIの直接挿入に起因することができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig2.jpg" /> 図2。樹状突起軸に細胞膜にSEP-GluA2の挿入 A）SEP-GluA2を発現している海馬のニューロンは、選択的に樹状突起の領域に沿って退色。回路図は、左上のパネルには、退色のために選択されているROIを浮き彫りにしながら、撮像された樹状突起の領域を示しています。大きな白いボックス領域が二重に向かっ青い矢印で強調表示され、隣接するボックス領域の漂白繰り返し、続いて一回漂白されました。このパネルには、退色する前に樹状突起を示しています。赤い矢印が下のパネルで高倍率に示すように、測定されたROIを示しています。 B）実験の時間経過とともに測定したROI内の蛍光強度、ROI内のグレーレベル（正規化されていない）としてプロットを示しています。黒い矢印のハイライトは、初期の光退色と緑色の矢印のタイムポイントは、繰り返し退色の開始を示します。 ΔFは、THを示します。樹状シャフトにSEP-GluA2の挿入による回復期間中に観察され蛍光のe増加しました。その後の低pHとpH 7.4 + NH 4 Clの洗浄、回収蛍光が発現して受容体を表面に関連していることを確認します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3747/3747fig3.jpg" /> 図3シクロヘキ治療後の樹状突起軸にリサイクル＆SEP-GluK2の横方向の拡散対のリサイクル A）海馬ニューロンは並列FRAPと独立した樹状ROIをに沿って実行&quot;FRAP-FLIPの回復プロトコルと選択的に退色SEP-GluK2を発現する。このニューロンは（200μg/ mlの2時間）タンパク質合成をブロックするために、シクロヘキサミドによる前処理の対象となった。回路図は、左側のパネルには、退色のために選択されているROIを強調しながら、撮像された樹状突起の領域を示しています。番目の電子大きな白いボックス領域が二重に向かっ青矢印で強調表示された唯一の低樹状突起の隣接ボックスの領域、の漂白繰り返し、続いて一回漂白されました。このパネルは、前の退色への樹状突起を示しています。赤い矢印は&quot;FRAP-FLIP &#39;プロトコルと従来のFRAPの蛍光回復を示す）Bで高倍率に示すように、ROIを強調表示します。回復の後期（第三パネル）における蛍光強度のレベルの比較だけではリサイクル対側方拡散やリサイクルの寄与を示しています。C）は、実験の時間経過とともに測定したROI内の蛍光強度を示し、正規化強度としてプロット値を示します。黒い矢印のハイライトは、初期の光退色と緑色の矢印のタイムポイントは、繰り返し退色の開始を示します。 ΔFRECは FRAP / FLIP樹状突起から決定受容体のリサイクルのために一時的な回復を示し、一方、ΔFdiff &#39;はFRAPのみ&quot;に樹状軸にROIをSEP-GluK2の側方拡散の寄与を測定します。一時的な増加は、シクロヘキ治療の結果として利用できる受容体のダウンの実行に対応する信号が徐々に減少し、続いています。その後の低pHとpH 7.4 + NH 4 Clの洗浄、回収蛍光が発現して受容体を表面に関連していることを確認します。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

我々は、原形質膜タンパク質輸送のコンポーネントを可視化する革新的な戦略について説明します。 SEP-tagタンパク質の退色技術のコンビナトリアルアプローチは、細胞膜の挿入イベントを評価することを選択できます。継続的に回復中にフランキング領域で膜タンパク質を退色することにより、 &quot;FRAP-FLIP &#39;メソッドは蛍光回復への小胞輸送の寄与を評価しています。この新しいアプローチは、決定される定常状態での回復が観察されたサブコンパートメントの数と回復（ΔF）の振幅の両方を有効にすると、タンパク質の膜挿入の直接録音することができます。さらに、FLIPの有無にかかわらずFRAPの比較が計算される横方向の拡散への回復の割合が起因することができます。 また、同じ実験では、隣接退色領域に隣接する非退色樹状突起の領域は、することができます質的に回復中に評価、これらの地域で観察された蛍光損失が樹状突起のこれらの非退色セグメントに退色受容体の側方拡散に起因します。 この選択退色プロトコルはそのような（例えば、樹状突起または棘）またはパラレルFRAPを行うことにより、横方向の拡散対挿入の寄与を評価し、 &quot;FRAP定義されているサブ領域で細胞膜にexcocytosisを特徴づけるように細胞輸送過程の様々な調査をするために利用することができます。隣接した樹状突起に沿って、FLIP &quot;プロトコル（図3）。 具体的なガイドラインが提示されてきたが、明らかに、各ラボでは、特定の標本や機器に係る撮像パラメータを最適化する必要があります。重要なのは、ROI内のすべての表面受容体は、退色z軸焦点面の独立したが、かなり光毒性損傷または非特定の退色せずにしておく必要があります。私達細胞体では、このプロトコルをしようとすると、ERSは、これらの地域では比較的低pH細胞内区画高いバックグラウンド蛍光の典型的結果の割合が高いので、注意が必要です。また、事前に選択的光退色実験を開始する、方法を変える我々はこの技術がどのように適用できるかを実証した一方で新しいSEP-タグ付きの構築、我々は、タグ付き受容体の初期特性は、最初アシュビーらによって前述のように、行われることをお勧めし2。 全体的に、このメソッドは、ほぼリアルタイムで評価される細胞膜に挿入イベントを有効にすると、標準FRAPプロトコルの強力かつ汎用性の高い適応したものです。

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong試薬の&gt;名前</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ番号</strong</td&gt;<td<strong&gt;コメント（オプション）</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 24ミリメートルカバーガラス</td&gt;<td&gt; VWRインターナショナル</td&gt;<td&gt; 631-0161</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ポリ-L-リジン</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; P2636</td&gt;<tdコー​​トカバーガラスにホウ酸緩衝液で&gt; 1mg/ml</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Neurobasal中</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; 21103</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; B27</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; 17504-044</td&gt;<tdニューロンのメッキと摂食媒体で&gt; 2％</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ペニシリンストレプトマイシン</td&gt;<td&gt;シグマ</td&gt;<td&gt; P0781</td&gt;<tdニューロンのメッキと摂食媒体中の&gt; 1％</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; L-グルタミン</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; 25030</td&gt;<td培地をメッキ/摂食で&gt; 2mMの/ 0.8mmの</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ウマ血清</td&gt;<td&gt; Biosera</td&gt;<td&gt; DH-291H</td&gt;<td神経メッキメディアで&gt; 10％のみ</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; pSIN ReP5クローニングベクター</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; K75001</td&gt;<td&gt;シンドビスウイルス産生のために</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LSM510 META共焦点システム</td&gt;<td&gt;ツァイス</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;画像Jソフトウェア</td&gt;<td&gt; NIH</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;オープンアクセスソフトウェアです。本明細書に記載のすべてのプラグインがご利用いただけます<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/"&gt; http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/</a</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

培養神経細胞における膜タンパク質の側方拡散とエキソサイトーシスは、蛍光回復と蛍光損失光退色を用いて評価

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

<p class="jove_content"受容体やイオンチャネルなどの&gt;膜タンパク質は、非常に偏光と形態的に複雑であるニューロンでアクティブ人身を受けています。この監督の人身売買は、提供の維持やシナプスのタンパク質を除去するために基本的に重要である。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;スーパー黄道pHluorin（SEP）は、広く細胞膜タンパク質の生細胞イメージングのために使用されているeGFPのpH感受性誘導体である<sup&gt; 1月2日</sup&gt;。低pHで、9月のプロトンは、光子吸収を減少させ、蛍光発光が不要になります。ほとんどの細胞内輸送のイベントは9月蛍光が隠蔽された低pH、SEP-タグ融合タンパク質からの蛍光信号とコンパートメントで発生した9月は、中性pH細胞外環境にさらされる原形質膜から主です。高強度9月に照らされたときに、すべての蛍光色素と同様に、（退色）不可逆的に光損傷です。<sup&gt; 3月5日</sup&gt;。重要なのは、低いpHが光子吸収を消光するため、表面だけは、細胞内のSEPが高輝度の照明による影響を受けないのに対し、9月は退色することができ表明<sup&gt; 6月10日</sup&gt;。</p&gt;<p class="jove_content"SEP-タグ融合タンパク質の&gt; FRAP（光退色後蛍光回復）は細胞膜でのタンパク質の動態を評価するための便利で強力な手法です。蛍光標識タンパク質は関心の領域に退色されている場合（ROI）の蛍光の回復が漂白された領域に漂白SEP-タグタンパク質の運動が原因で発生します。これは、横方向拡散を介して、および/またはのいずれかによって供給され、非退色受容体のエキソサイトーシスから発生する可能性があります<em&gt; de novoの</em&gt;合成やリサイクル（図1参照）。不動とモバイルタンパク質の割合を決定することができ、拡散性画分のモビリティと速度論をそのようなアゴニストのアプリケーションや、NMDAまたはKClアプリケーションなどの神経細胞活性化刺激として基礎と刺激された条件の下で問い合わせることができます。<sup&gt; 8,10</sup&gt;。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;我々は選択的にエキソサイトーシスに起因する蛍光の回復を可視化するために設計された光退色技術を説明します。簡単に言えば、ROIは隣接領域の漂白反復することによって、簡単に回復した後、続いて、標準FRAPのプロトコルと同様に一度退色しています。私たちの研究室で開発されたこの &quot;FRAP-FLIP &#39;プロトコルは、樹状突起棘でのAMPA受容体の輸送を特徴づけるために使用されている<sup&gt; 10</sup&gt;、および細胞内輸送とエキソサイトーシスを評価するための人身売買の研究の広い範囲に適用可能である。</p

このレポートでは、ニューロンの細胞膜に発現する外因性、pH感受性GFPタグ融合タンパク質の表面発現、輸送経路や人身売買の速度を決定するための生細胞イメージングと光退色技術の使用について説明します。

受容体やイオンチャネルなどの膜タンパク質は、高度に分極し形態学的に複雑な細胞であるニューロンにおいて、能動的な輸送（トラフィッキング）が行われます。これにより...

この手順の全体的な目的は、神経細胞タンパク質の細胞膜への挿入を可視化することです。これは、まず培養海馬神経細胞にシヌスウイルスを感染させ、super ecliptic、Florin、またはsepでタグ付けされた目的タンパク質を発現させることで行われます。次に、関心領域（ROI）を光退色させます。次に、関心領域（ROI）が蛍光回復する間に、その両隣のセグメントを繰り返し光退色させます。最後に、関心領域における蛍光回復を解析します。最終的に、従来のFRAP実験へのこの適応を用いることで、細胞膜における標的タンパク質の開口分泌イベントのパターンを提示します。表面バイオチニル化や抗体フィード法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、膜挿入イベントのダイナミクスを可視化できる点にあります。これらの手法は、エキソサイトーシスイベントがどこでどのように起こるかという、タンパク質輸送における重要な課題を解決するのに役立ちます。私がこの手法を考案したのは、抗体フィード法の代替手段を探し、生細胞実験においてスパインでのエキソサイトーシスイベントを研究できるようにしたいと考えたときでした。まず、胚性18日目の幼仔から高密度の海馬ニューロンを採取し、ポリリシンコートしたガラスカバースリップ上で、生細胞実験の6〜24時間前まで、in vitroで14〜25日間培養します。標的となる膜タンパク質をコードし、SUP ecliptic fluorine osepで型付けられたsymbisウイルスを用いて細胞を形質導入します。1 mLのコンディショニング培地を含むカバースリップに、擬似ウイルスを含む培地を直接添加し、細胞を培養インキュベーターに戻します。細胞をイメージングするために、イメージングの少なくとも20分前に、ZEISS Axio Observer LSM 510 Meta共焦点顕微鏡をレーザー出力100%で起動させておきます。イメージング中の電力変動を最小限に抑え、ステージを予熱します。顕微鏡の準備ができたら、63倍の対物レンズを選択し、カバースリップをイメージングチャンバーに転送して、直ちに培養液を細胞外記録液で置換し、予熱します。チャンバーを予熱した顕微鏡ステージ上に設置します。この手順で最も困難な点は、記録プロセス中に細胞の健康状態を損なわないようにすることです。このプロトコルでは、成功させるために広範囲のフォトブリーチングが必要となるため、大規模な実験を開始する前にすべてのイメージングパラメータを最適化し、高画質な画像よりも高速な取得を優先させてください。イメージキャプチャのパラメータを定義するために、目的の組換えタンパク質を発現しているニューロンを特定し、ピントを合わせます。フォトブリーチングを最小限に抑えるため、488 nanometerのレーザーを低出力で使用して、細胞全体をスキャンします。高速の公称速度と低ピクセル解像度を使用してください。総スキャン速度は1秒未満に維持します。樹状突起の撮影部位を選択し、1.5から2.5の光学ズームを使用します。非特異的な光退色が起こっているかを確認するため、関心領域を含むフレームをキャプチャします。参照用の樹状突起から測定値を得られるよう、視野内に複数の突起が含まれるようにしてください。レンジインジケーターパレットを使用して、飽和を抑えつつ、最小限のレーザー励起で最大限の蛍光が得られるように撮像パラメータを調整します。光子収集を最大化するために、ピンホールの径は大きく設定することが推奨されます。検出器のゲインは、光退色前の最初の画像において飽和画素が10%を超えない程度に、小さな蛍光増分を検出できる十分な強度に設定してください。フォーカスを調整し、中心の焦点面が得られていることを確認します。構成を設定した後、実験のプレおよびポストリカバリー相で使用するために保存します。次に、フォトブリーチ領域を定義します。最初のフォトブリーチ用の関心領域（ROI）と、その後の反復的なフォトブリーチ相用の隣接領域を選択します。最初の光退色では、中心領域と隣接領域の両方のROIを光退色させます。一方、反復的な光退色では、隣接領域のROIのみを選択します。スキャン間の拡散による回復を防ぐため、隣接領域が十分に広いことを確認してください。両方の光退色ROIのブリーチパラメータを調整します。初期の光退色は迅速に行う必要があり、光学ズームとROIの体積に応じて1〜5回の反復回数に設定します。側方領域については、光毒性による損傷を避けつつ、継続的な光退色が行われるようにレーザー励起を調整します。パラメータの設定が完了したら、まず低レーザー出力でタイムラグなしに3〜10枚のプリブリーチベースライン画像を撮影し、可変タイムラプス画像シーケンスとしてFRAフリップ実験を実施します。次に、最大レーザー出力で中心のROIを1〜5回フォトブリーチします。その後、ブリーチ後の回復画像を3〜10枚取得します。続いて、中程度のレーザー出力で隣接領域の反復フォトブリーチを行い、調査対象のタンパク質の回復速度に応じて、通常1〜5秒の時間間隔で画像をキャプチャします。最後に、蛍光を消光させるには、細胞外記録液をpH 6に緩衝した記録液に置換します。あるいは、低pHの細胞内貯蔵庫にあるタンパク質を可視化させるには、50 mMの塩化アンモニウムを添加した緩衝液を使用します。結果のバイアスを避け、統計解析を可能にするため、各組換えタンパク質について少なくとも10〜20セットのデータを収集し、反復実験間でイメージング条件が維持されるようにしてください。画像を解析するには、ファイルを開きます。Image Jソフトウェアを使用して、タイムシリーズ全体で発生した可能性のあるXY平面上のわずかな変動を補正するために、スタックの整合（アライメント）を行います。Zeiss共焦点顕微鏡で撮影された画像に対しては、stack regプラグインを使用し、LSM toolboxプラグインを用いて時間値をテキストファイルとして出力し、これらの値を解析用スプレッドシートにインポートして蛍光変動を測定します。FRAフリップ実験では、画像ROIマネージャー解析ツールを用いてフォトブリーチセグメントを個別のピクセル領域に分割し、複数のROIを選択します。次に、plot Z axis profileコマンドを使用して、各タイムポイントにおける1ピクセルあたりの平均蛍光強度を測定します。同様の手順を繰り返し、蛍光を発していない背景領域の平均蛍光強度を測定します。実験的なノイズを除去するため、各タイムポイントの蛍光強度から背景値を差し引いて正規化し、さらにすべての値を退色前のベースラインの平均値または退色直後の値で除算します。各ROIの時間に対する回復トレースを調べ、有意な回復が起こったかどうかを算出します。ROIにおいて、光退色回復シーケンスの最後の5〜10回の測定値の平均から、最初の5〜10回の測定値の平均を差し引いてdelta Fを算出します。次に、delta Fの統計的有意性を決定し、回復したROIと回復しなかったROIを特徴づけることで、エキソサイトーシスのパターンを評価します。これはエキソサイトーシスのホットスポット、あるいはスパイン対シャフトの回復を示しています。このビデオは、SERP glueを用いた一般的なFRAP-FLIP実験の代表的な結果を示しています。2つ目の。樹状突起の一領域を1回光退色させ、その後1分間の回復時間を設けます。続いて、青色の矢印で示されるように、隣接する領域の反復的な光退色を開始します。赤色の矢印は蛍光回復が観察される小さな関心領域を示しており、画面右側のパネルに拡大して表示されています。回復過程は以下のグラフで追跡されており、蛍光の全体的な増加はdelta Fとして示されています。この一連の過程で観察された蛍光の増加は、樹状突起のシャフトへのglue A twoの挿入に起因するものと考えられます。実験の終盤に見られる蛍光強度の大きな変化は、低pHおよびpH 7.4の塩化アンモニウムによる洗浄がSEP蛍光シグナルに及ぼす影響を示しています。この例では、ニューロンにSEP glue K twoを感染させています。ここでは、視野内に複数の樹状突起を含む大きなROIを光退色させ、続いて単一の樹状突起のみを選択的に繰り返し光退色させています。これらのニューロンは、タンパク質合成を阻害するために、イメージングの2時間前にシクロヘキシミドで処理されました。これにより、それぞれの測定ROIにおける蛍光回復を解析することで、標準的なFRAPを用いた樹状突起における側方拡散とリサイクリングによる回復割合と、FRAP-FLIPプロトコルを適用した樹状突起におけるリサイクリングのみによる回復割合を明らかにできます。FRAPとFRAP-flipの回復曲線のΔF値を比較することで、タンパク質合成を阻害しているため、リサイクリングと側方拡散の相対的な寄与を推論できます。回復過程では、利用可能な受容体プールが枯渇するにつれて、シグナルのその後の低下が見られます。このビデオを視聴することで、ニューロンにおけるイメージング実験のセットアップ、実施、および解析を成功させる方法について十分に理解できるはずです。これらの光退色技術を組み合わせることで、目的タンパク質の膜挿入の根拠を検討することができます。

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