後期胚と新生児マウスの計測左心室圧

この手順の全体的な目的は、胚後期および新生児マウスの左室（LV）圧を測定することです。まず、装置を準備します。圧力トランスデューサに接続されたニードルを、超音波プローブに合わせて配置する必要があります。

次にマウスを準備し、超音波を用いて左心室（LV）を画像化します。その後、針をLV腔内に進め、拍動圧の測定値を記録します。最終的に、この超音波ガイド下での液体充填カテーテル法を用いることで、胚後期および新生児早期のマウスにおける収縮期血圧が示されます。

サーボ、無圧力測定、またはソリッドステートカテーテルなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、胎生後期および新生仔マウスにおいて、堅牢かつ再現可能な方法で圧力を測定できる点にあります。一般的に、本手法に不慣れな場合は、胚が回転するため、胚嚢内での胚の向きを維持することが困難であり、苦労することがあります。超音波プローブを適用する際は、研究対象となるマウスのステージに応じて、適切なプローブを選択し、蒸留水で満たしてください。

プローブを超音波システムの可動式スタンドに取り付けます。プラットフォームに固定されたマウスの左室（LV）長軸像が得られるようにスタンドを調整し、LV心尖部を注入アーム側に向けてください。圧力測定システムは、液体で満たされた圧力変換器、ブリッジアンプ、データ収集システム、およびLabChartで構成されています。

ソフトウェアパッケージ、およびチューブのフラッシングに使用する10%ヘパリン生理食塩水を充填した20 milliliterシリンジを用意します。チューブ内やトランスデューサ上に気泡が残らないように注意してください。トランスデューサへのチューブは、3方活栓、ルアーロック、およびホースバーブで接続します。

マノメーターを用いて圧力変換器システムを校正し、ニードルチューブとケーシングを注入アームに取り付けます。マノメーターを、チューブを注入アームに固定するためのケーシングに交換します。このケーシングは、単純に3 mLシリンジの本体を改造したものです。

圧力トランスデューサーをリングで固定します。詰まりを避けるため、イメージングプラットフォームとほぼ同じ高さに立ってください。ニードルチューブに可能な限り最大サイズの針を取り付け、数滴出るまでヘパリン加生理食塩水を注入します。

再び針を抜きます。チューブ内やトランスデューサーの上に気泡が取り込まれていないことを確認してください。次に、イメージングプラットフォームの上に超音波ジェルを盛り付けます。

3 mLシリンジ本体の針を回転させ、針の切り口（ベベル）が上を向くようにします。次に、調節可能なスタンドを使用して、針がゲルに直接刺入できるようにプローブの位置を慎重に合わせます。イメージングプローブの中心直下において、針はプローブカバーを突き破らない程度に十分に低い位置にあり、かつプローブの焦点深度内に収まる十分に近い位置にある必要があります。

必要に応じて、針が移動中の全行程で正しい平面に留まるように、手で針を曲げても構いません。アライメントを維持したまま針を後退させ、イメージングプローブを上げて、イメージングプラットフォームにマウスを配置します。マウスの麻酔に進む前に、針を交換してください。

1.5% Isofluraneを連続吸入させ、妊娠週数を合わせた母マウスまたは新生子マウスを麻酔します。新生子マウスの小さな頭に合わせるため、標準的なノーズコーンにチューブを挿入して調整してください。新生子マウスの場合、LV心尖部が注入アームに向くように、超音波診断装置のイメージングプラットフォーム上に背臥位で固定します。また、新生子マウスの体温を維持するため、外部ヒートランプを使用してください。

妊娠マウスでは、より入念な準備が必要です。四肢に超音波ジェルを塗布し、装着したECG検出器との接合性を確保して心拍数をモニターします。また、フィードバックを得るために直腸温度計を挿入します。

体温の制御を行う。除毛クリームで腹部の毛を除去し、水で洗い流す。解剖用ハサミと曲げピンセットを用いて腹部を切開する。

片側の子宮角を外部に露出させ、温 saline を含ませたガーゼパッドの上に置きます。この手順の間、すべての胚および母体のお腹を湿った状態に保ってください。温 saline を適宜補充しながら、超音波プローブを用いて左室（LV）の胸骨傍長軸像を得るために、胚を慎重に適切な位置に操作します。胚の向きを維持するために、丸めたガーゼを使用しても構いません。

片側の子宮角にあるすべての胚の圧力を測定し終えてから、もう一方の子宮角で同様の操作を繰り返します。まず、あらかじめ温めておいたDegas超音波用ゲルを、マウスの胚または新生児に塗布します。イメージングプローブを下げ、イメージングプラットフォームの角度を調整して、最適な胸骨傍左室長軸像を得ます。

針のアライメントが失われるため、プローブの角度を調整しないでください。超音波画面でLV画像を確認しながら、針がプローブの底部付近に達するまでゆっくりと進めます。アライメントにずれが生じた場合は、必要に応じて針とプローブの位置を調整してください。

新生仔マウスの画像は、胚では達成が困難な、lvにとって理想的な向きを示しています。圧力データの記録を開始します。針を生理食塩水で緩やかに洗浄し、20 mLシリンジおよび大気へのストップコックを閉じます。

圧力を観察します。針への圧力が最小限になるよう、プログラムで設定を上げてください。超音波画像のエッジに針が見えるまで、ゆっくりと針を進めます。ただし、この時点ではまだlv内に入らないようにしてください。

必要に応じて、針の位置を調整し、心尖部から左室（LV）に刺入します。針の鮮明な画像を維持できるよう、必要に応じてプローブの位置を調整してください。超音波画像で針の位置をモニタリングしながら、圧力データを記録しつつ、針を左室腔内へ進めます。

圧力トランスデューサーからの拍動性の記録が開始されれば、LV腔内の位置にあることが確認されます。針がLV腔内にあると思われるが圧力記録が拍動性でない場合は、圧力の上昇が検出されるまで、シリンジプランジャーを軽く叩いて針をフラッシュしてください。圧力測定中に心臓の挙動が変化するのを避けるため、液体によるフラッシュは最小限にする必要があります。

圧力値に依然として拍動が見られない場合は、針が正しい平面より上または下にあり、LV腔内に挿入されていない可能性があります。針を後退させ、生理食塩水でフラッシュしてから、再度挿入してください。

拍動性の測定値が依然として得られない場合は、次のマウスに移り、新しいマウスには常に新しい針を使用してください。胚および新生児へのストレスを最小限に抑えるため、全工程をできるだけ迅速に実施する必要があります。C57BL/6Jマウスの心室圧を、E18のマウスで測定しました。

予想通り、針が左心室（LV）の外にあるときは圧力はほぼゼロであり、P 14の高齢マウスの左心室内に挿入したときは脈動的な値を示しました。圧力の大きさが増し、心拍数が高くなったため、圧力の読み取り値は減衰しました。心拍数は、E 18からP 14までの様々な週齢における脈動的な圧力読み取り値の周波数から決定しました。

心拍数を測定し、LV収縮期圧を算出した。この手順を行う際は、胚を定期的に湿らせ、母体（母マウス）の状態を確認することが重要である。本手法は、心血管生理学の研究者が、発育中のマウスにおける血圧変化を探索するための道を切り開くものである。