Name: 合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: 学ぶHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスの可視化法。TIRF顕微鏡を用いて合成脂質二重膜上でのシグナリング分子の動態とLCKなどのタンパク質の局在を解析する手法です。

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<ol><li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics.</a> J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Bond+Dynamics+in+Contacts+between+T+Lymphocytes+and+Glass-supported+Planar+Bilayers+Reconstituted+with+the+Immunoglobulin-related+Adhesion+Molecule+CD58%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58.</a> J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).</li>
<li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li>
<li>Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+host+cell-surface-derived+molecules+by+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1.</a> Aids. 10, 1611-1620 (1996).</li>
<li>Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+adhesion+molecules+in+HIV+type+1+infection+and+their+impact+on+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, Suppl 3. S247-S254 (1998).</li>
<li>Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LFA-1+expression+on+target+cells+promotes+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission.</a> J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li>
<li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li>
<li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+virion+ICAM-1+to+human+immunodeficiency+virus+infectivity+and+sensitivity+to+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.</a> J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120-induced+partial+T-cell+receptor+signaling+creates+an+F-actin-depleted+zone+in+the+virological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse.</a> J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li>
<li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li>
</ol>

著者らは、利害の競合を宣言しません。

以前の研究では、細胞 - 細胞複合体システムの可視化VSを持っています。ただし、これらの研究は、シナプスでの超分子構造を可視化するために十分な高解像度の画像を提供していませんでした。私たちの研究室では、ウイルスエンベロープgp120と細胞接着分子ICAM-1を発現する感染細胞の表面を表現するためにガラスでサポートされている平面二重層システムを利用した。高い信号対雑音比を有する二重層の表面100から200 nm以内に蛍光シグナルを検出した全反射顕微鏡と組み合わせて、我々は、VSでのICAM-1からgp120の分子の分離を検出することができました。また、標準的な免疫染色法は、二重層システムに適用することができ、VS 15でgp120の非接触領域に、Lckがアクティブではなく、フュン島の具体的な採用を検出し、定量化するためにここで使用されていました。したがって、平面二重層は、TIRFミクロ2次元平面内のシナプスインタフェースの高分解能イメージングのための実験システムを提供していますSCOPYと同様に、ワイドフィールドまたは共焦点照明方法。ただし、システムはまた、面外曲げ、リガンドの移動を調整するように制限があり、生体膜の変動が平面二重層によって再現されていません。さらに、これは試験管内システムであり、したがって、そのような分子運動性や細胞運動を調節する感染細胞と細胞骨格の機械上に存在するであろう他の膜分子の不足など他の制限があります。また、このようなgp120の三量体対モノマーとして分子のダイナミクスおよびディストリビューションは、二重層で生理学的に表現することはできません。それにもかかわらず、さらに、これらの制限で、このシステムは、ウイルス、細胞または細胞間相互作用を研究するために依然として非常に貴重であり、これらのメソッドが認識できるではない超分子組織を検出するために高解像度の画像を探している研究者に有用なガイドとして役立つことができる従来の細胞間共役系がある。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>自分のタグ付きのHIVのgp120 </td><td>チョー先生からの贈り物</td><td></td><td> DH12 </td></tr><tr><td>自分のタグ付きのHIVのgp120 </td><td>免疫技術</td><td></td><td>様々なX4またはR5熱帯</td></tr><tr><td> HSA </td><td>ウィリアムズ医療カンパニー</td><td> 521302 </td><td>ヒト血清アルブミン25パーセント</td></tr><tr><td>アミコンウルトラ遠心フィルター</td><td>ミリポア</td><td> UFC803024 </td><td>ウルトラ-30K </td></tr><tr><td>内在LCK </td><td>細胞シグナリング</td><td> 2787 </td><td></td></tr><tr><td>ウサギpAbのP-Lckは</td><td>サンタクルーズバイオテクノロジー株式会社</td><td> SC-101728 </td><td>チロシン394 </td></tr><tr><td>フュ内在</td><td>ミリポア</td><td> 04から353 </td><td></td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 568 2°、アブ</td><td>分子プローブ</td><td> A11034 </td><td>ヤギ抗ウサギIgG（H + L） </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor®488 </td><td>分子プローブ</td><td> -20000 </td><td>カルボン酸スクシンイミジルエステル</td></tr><tr><td> FCS2商工会議所</td><td> Bioptechs </td><td> 060319-2-03 </td><td></td></tr><tr><td>スライドをMicroaqueduct </td><td> Bioptechs </td><td> 130119から5 </td><td></td></tr><tr><td> 30ミリメートルラウンドw /穴</td><td> Bioptechs </td><td> 1907-08-750 </td><td>厚さ0.75ミリメートル</td></tr><tr><td>長方形ガスケット</td><td> Bioptechs </td><td> 1907-1422-250 </td><td> 14x24 0.25ミリメートルの厚さ</td></tr><tr><td>タイゴンチューブ</td><td> Bioptechs </td><td> 20202275 </td><td> 1月16日 &quot;（25フィート） </td></tr><tr><td>三方活栓</td><td> BioRad社</td><td> 7328103 </td><td></td></tr><tr><td>双方向のコック</td><td> BioRad社</td><td> 7328102 </td><td></td></tr><tr><td>付箋スライドI 0.2ルアー</td><td> Ibidi </td><td> 80168 </td><td></td></tr><tr><td>メガネをカバー</td><td> Ibidi </td><td> 10812 </td><td></td></tr><tr><td> 1ミリリットル注射器</td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> DOGS-NTA </td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 790404C </td><td></td></tr><tr><td> DOPC </td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td> 850375C </td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td> Bioptechs </td><td> 40-1313-0319 </td><td> 40ミリメートル</td></tr><tr><td>全反射顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td> ImageJは</td><td>国立衛生研究所</td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/~~V</a> </td></tr></tbody></table>

合成脂質二重膜上でhiv-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）感染症は、セルの伝送2,10,11のセルを介して最も効率的に発生します。 CD4との間のセル転送には、この細胞+ T細胞は、CD4と感染細胞のHIV-1エンベロープgp120の婚約により形成されるF-アクチン依存性の細胞間接合でウイルス学的シナプス（VS）の形成を伴い、標的細胞8のケモカイン受容体（CKR）、CCR5またはCXCR4。彼らはウイルスに感染したドナー細胞の表面上に存在するとしてgp120およびその受容体に加えて、特に他の膜タンパク質、接着分​​子LFA-1とそのリガンド、ICAMファミリーは、VSの形成とウイルス感染で大きな役割を果たすと標的細胞と同様に、HIV-1ビリオン1,4,5,6,7,13の封筒に。 VSの形成はまた、その受容体のgp120係の結果として導入される細胞内シグナル伝達事象が付属しています。実際、我々は最近、CD4を示しています&lt;gp120を持つ&gt; + T細胞の相互作用がLckが、CD3ζ、ZAP70、LAT、SLP-76、ITKやPLCγ15を含むシグナロソームTCRに関連付けられているシグナリング分子の募集及びリン酸化を誘導する渉。 本稿では、VSの形成時に行われている超分子配列と膜近位シグナル伝達事象を可視化する手法を提案する。我々は、ウイルスエンベロープgp120と細胞接着分子ICAM-1が付いたHIV感染細胞の表面を表現するための還元のモデルとしてのガラスでサポートされている平面二層システムを利用しています。プロトコルは、相互作用する細胞に細胞内シグナル伝達分子を検出するために、HIV-1 gp120の誘起VSアセンブリとフローセルのi）二層の準備と、アセンブリを含む信号の活性化イベント、ⅱ）細胞と免疫蛍光染色の注入を監視するための一般的な手順について説明します。双方向層、IIIのHIV-1 gp120およびICAM-1）全反射顕微鏡による画像取得、NDⅳ）データ分析。このシステムは、これらのサブドメインへの採用、特定のシグナル伝達分子と一緒にVSの個々の分子成分の異なるクラスターの検出を可能にするような従来の細胞と細胞のシステムで達成、それ以上VSインターフェイスの高解像度画像を生成します。

この資料では、全内部反射蛍光（全反射）顕微鏡による平面脂質二重層をサポートしてガラス基板上にHIV-1エンベロープによって誘導されるウイルス学的シナプスの形成を可視化する方法について説明します。方法はまた、HIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプス形成時に発生するシグナル伝達分子の活性化および再配布を検出する免疫​​蛍光染色と組み合わせることができます。

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）の感染は、細胞間伝播を介して最も効率的に起こります2,10,11。この...の間の細胞間伝達は...

この手法では、感染細胞の表面を模倣した脂質二重層を作成します。一次ヒトCD4 T細胞とともに形成されるHIVウイルス学的シナプスを研究するために、まず目的のタンパク質を蛍光色素で標識し、次に脂質二重層を作成して細胞にシナプスを形成させ、さらに細胞を固定し、シグナル伝達分子を可視化するために蛍光抗体で染色します。その後、全内部反射蛍光（TIRF）顕微鏡を用いて、シナプス形成細胞内のシグナル伝達分子の画像を撮影します。ターフ画像を解析し、ウイルス学的シナプス構造に対する活性シグナル分子の局在を記述します。この実験的アプローチにより、リンパ球特異的プロテインキナーゼLCKのような細胞タンパク質がHIVウイルス学的シナプスにリクルートされるか否かを示すことができます。この手法は、どの細胞成分がウイルス学的シナプスに関与しているかなど、HIVウイルス学および免疫学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。シナプス形成における役割と、それが細胞間でのHIV伝播にどのように影響するかについて。このBierシステムは、単一平面内で高空間分解能でシナプスを可視化できる利点があり、シナプスのエンドフェーズビューを提供します。結果はシナプス構造を明確に描写しており、Bierの形成およびフローセルの組み立ては、一種の熟練した技術であり、芸術形式と言えます。ここでは、感染性ウイルスや感染細胞を用いた研究、または試薬の制限により少量のサンプルを使用する必要がある場合の、バイオオプティックフローセルにおけるビラー調製法について実演します。使い捨てのOBフローセルでも、同様のビラー調製手順を用いることができます。マイケル・クレイマーと私が、タンパク質のタグ付けの手順について実演します。LOR 4 88のように、タンパク質への結合効率が高く、顕微鏡イメージングに十分な光安定性を持ち、かつ使用する顕微鏡装置のレーザー励起波長に適合する蛍光色素を選択します。精製済みHisタグ付きGP one 20 DH 12タンパク質を用意します。分子量分画値50 kilodaltonsの遠心ろ過ユニットを用いて、タンパク質バッファーを滅菌PBSに置換します。次に、pHを確認し、最終濃度が50 millimolar、pHが約8.5になるようにpH 9.0の炭酸水素ナトリウムを加えます。その後、10倍モル過剰量の平均反応性LOR 4 88蛍光染料を加えます。この混合物を暗所で45分から1時間インキュベートします。遠心ろ過ユニットを用いて余剰な染料を除去します。カラムに新鮮な滅菌PBSを加え、遊離染料からタンパク質を洗浄し続けます。その後、GP one 20タンパク質を約1 mg/mLまで濃縮します。488 nanometersで蛍光色素の濃度を測定します。また、NanoDrop分光光度計を用い、「proteins and labels」設定でタンパク質濃度を測定します。2つの数値を除して、タンパク質分子あたりの蛍光強度を決定します。プラスチッククランプを用いて、硫酸45 mLと30%過酸化水素 15 mLからピラニア溶液を調製します。カバーガラスを15分間浸漬させます。カバーガラスをPIKA精製水で満たしたビーカーに移します。各カバーガラスを流水下で2分間（各面1分ずつ）洗浄し、ラックに置いて乾燥させます。Varonaら（2008年）が previously described した方法に従い、optics F CS 2チャンバーの組み立てを行います。次に、チップがガラスに触れないように注意しながら、バイレイヤー表面に His-GP1-20 を捕捉して提示します。1 µLのリポソーム混合液を5滴、マイクロアクアダクトスライド上に分注し、フローセルあたり5層の脂質二重層を形成させます。次に、脂質の上にカバーガラスを配置します。続いて、白い保持リングをステンレス製クランプベースユニットで覆います。装置全体を反転させて密閉します。次に、バイレイヤーの位置に印を付け、室温で10分間インキュベートします。その後、2方活栓付きのチューブを左側の灌流チューブに取り付けます。3方活栓に取り付けられたチューブに、HEPES緩衝生理食塩水で調製した1% human serum albuminを満たし、セットアップ内に気泡がないことを確認します。次に、このチューブを右側の灌流チューブに取り付け、正のメニスカスを形成させます。バッファーをフローセルにゆっくりと押し込み、バイレイヤーを塞ぎます。100 µMの塩化ニッケルENCカゼインを300 µL充填した1 mLシリンジを三方活栓に取り付け、緩やかにバッファーを押し流します。取り外す前に、両方のストップコックを閉じます。シリンジを室温で30分間インキュベートします。次に、HIV V1表面に見られるエンドクラスターの局所密度を模倣するため、Hisタグ付きLOR 4 88標識GP120を250分子（1 µmあたり20分子）ロードします。室温・暗所にて30分間インキュベートし、5 mLのHBS-BSAバッファーで繰り返し洗浄します。フローセルを37 °Cに平衡化します。1 mLシリンジを用いて、1% Human serum albumin溶液 400 µLに懸濁した活性化ヒトCD4陽性T細胞を加え、37 °Cのインキュベーターで45分間インキュベートして、細胞を脂質二重層に接着させます。次に、細胞を固定するため2%パラアルデヒドを注入し、37 °Cで10分間インキュベートします。その後、1 mLで3回洗浄します。PBSで3回（1回につき1 mL）洗浄した後、0.1% Triton X 100を注入し、室温で5分間細胞を透過処理します。5%ヤギ血清を含むカゼインを用いて25分間ブロッキングします。室温でPBSを用いて3回洗浄します。その後、一次抗体とバッファーを各フローセルに300 µLずつ添加し、20分から1時間置いておきます。PBSで3回洗浄した後、室温でバッファーに調製した適切な蛍光標識二次抗体を添加します。本実験において、コントロールとなる層サンプルには二次抗体のみを処理し、この試薬による非特異的シグナルのレベルを判定します。室温で20分間インキュベートし、その後1 mLの洗浄液で3回洗浄します。全内部反射蛍光顕微鏡を用いて、すべてのサンプルの画像を撮影します。ImageJなどの画像解析アプリケーションパッケージの「Analyze」メニューにある「Set Measurements」タブを使用して、画像の定量解析を行います。面積（area）と平均灰白値（mean gray value）のチェックボックスをオンにします。画像上で、多角形またはフリーハンドで描いた閉じた形状の関心領域（ROI）を選択します。次に、ソフトウェアでこの測定データを記録するために、解析測定（analyze measure）タブを選択します。結果テーブルで、測定項目を平均値（mean）と面積（area）に設定します。次に、各細胞トレースについて、1つの実験条件の画像を開き、関心領域（ROI）とトレースを測定し、あわせて各実験条件の背景領域も測定します。測定値をコピーし、Excelに貼り付けます。すべてのデータを収集した後、任意単位（arbitrary units）で平均強度を算出します。平均値から背景強度を差し引き、それに面積を乗じて、初期の膜近接シグナル伝達分子の活性化およびリクルートメントを測定するためのタンパク質の積分強度（任意単位）を算出します。gp120との相互作用の結果、ウイルス学的シナプスにおいて、ヒト初代CD4陽性T細胞をgp120およびICAM-1を担持するバイレイヤー上に導入しました。ICAM-1のみを担持するバイレイヤーに導入した細胞を、シグナル伝達の基底レベルを定義するためのコントロールとしました。細胞がgp120およびICAM-1を含むバイレイヤーと相互作用した後、LCKタンパク質がウイルス学的シナプス界面にリクルートされ、gp120と共局在しました。全LCKの平均強度は、ICAM 1のみの場合よりも、GP120とICAM 1の両方を含むバイレイヤーにおいて高くなっていました。興味深いことに、積分強度レベルは同程度でした。これらを総合すると。これらのデータは、LCKが中心部のクラスターに再分布することを示唆しています。CD4陽性T細胞がGP120に結合すると、TIRF顕微鏡によって検出されたリン酸化LCK tyrosine 394の平均強度および統合強度がイメージングされ、定量化されました。結果から、GP120の結合によりLCK活性化ループのチロシン394残基のリン酸化が増加したことが示された。対照的に、ICAM1のみのバイレイヤー上にある細胞の接触領域には、GP120とICAM1の両方を含むバイレイヤー上よりも多くのFinnが存在していた。したがって、Finnはウイルス学的シナプスにリクルートされなかった。したがって、HIV-1 gp120によって誘導されるウイルス学的シナプスにおいて、活性を持つキナーゼはFynではなくLCKであると結論付けられます。このビデオを視聴することで、特定のタンパク質をロードしたバイラーの調製方法、フローセル上での免疫蛍光染色、全反射照明（TIRF）顕微鏡を用いた細胞・バイラー間相互作用のイメージング、および基本的な解析方法について十分に理解できるはずです。このバイラーシステムは、ウイルス学的シナプス形成のダイナミクスを観察できる生細胞イメージングにも有用です。さらに、GFPなどの蛍光タグ付きタンパク質を細胞にトランスフェクションすることがあります。これにより、シグナル伝達分子の分布の変化やシナプスへの集積をリアルタイムで追跡することが可能になります。

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Research

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Immunology and Infection

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このビデオは、免疫学的シナプストポロジーの生細胞イメージングを実演し、Tリンパ球と蛍光抗原を運ぶ上皮細胞との間の相互作用を調査しています。蛍光顕微鏡法では、内皮細胞に赤い細胞質の変位と黄色の膜輪が見られ、免疫学的シナプスの形成が示唆されています。...

生細胞イメージングによる免疫学的Synapseトポロジーの評価

抗体の中和を評価し、効果的なワクチン免疫原の設計を導くためには、ウイルス表面抗原のコンフォメーションを理解する必要があります。ここでは、トランスフェクションされた細胞の表面に発現する三量体HIV-1...

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

ここでは、免疫学的シナプスを形成するガラス支持脂質二重膜技術と、誘導放出枯渇(STED)顕微鏡の超解像イメージング技術の組み合わせについて説明します。このプロトコルの目標は、これら 2...

グラスサポート平面脂質二重層上のナチュラルキラー細胞免疫シナプスの超解像イメージング

適応免疫は、T細胞と抗原提示細胞との間に形成される動的な「免疫学的シナプス」によって制御されます。このプロトコルは、研究が進んでいない生理学的APCとして、また新しいタイプの「平面細胞APCモデル」として、内皮細胞を調査するための方法を説明しています。...

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

ここでは、コムギ胚芽ベースのin vitro翻訳システムで合成されたYFPタグ付きGagと電気形成技術によって調製されたGUVを使用して、HIV-1 Gagと脂質膜との間の相互作用を視覚的に分析するin vitro膜結合アッセイを示します。...

巨大単層ベシクル（GUV）膜への結合HIV-1のGagの可視化

このプロトコルは、免疫学的シナプス形成とその後の分極分泌トラフィックの両方を免疫学的シナプスに向かって画像化する。細胞コンジュゲートは、超抗原パルスラジ細胞(抗原提示細胞として作用する)とユルカトクローン(エフェクターヘルパーTリンパ球として作用する)との間に形成された。...

ヒト免疫シナプスのイメージング

学ぶHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスの可視化法。TIRF顕微鏡を用いて合成脂質二重膜上でのシグナリング分子の動態とLCKなどのタンパク質の局在を解析する手法です。

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

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