合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

この方法では、感染した細胞表面を模倣した脂質二重層を作成します。初代ヒトCDで形成されたHIVウイルス学的シナプスを研究するために、最初に目的のタンパク質を蛍光色素で標識するための4つのT細胞、次に脂質二重層を作成し、細胞がシナプスを形成するようにし、細胞を蛍光抗体で固定して染色し、シグナル伝達分子を視覚化します。次に、全反射顕微鏡、蛍光顕微鏡、または芝顕微鏡を使用して、シナプス形成細胞内のシグナル伝達分子の画像を取得します。

芝生の画像を解析して、ウイルス学的シナプス構造に対する活性シグナル伝達分子の局在を明らかにします。この実験的アプローチは、リンパ球特異的タンパク質キナーゼLCKのような細胞タンパク質がHIVウイルス学的シナプスに動員されているかどうかを示すことができます。この方法は、どの細胞成分がウイルス学的シナプスに関与しているかなど、HIVウイルス学および免疫学における重要な問題に対処するのに役立ちます。

シナプス形成における役割と、それが細胞から細胞へのHIV移動にどのように影響するか。このビアシステムは、シナプスを単一の平面で高い特殊解像度で視覚化するという利点により、シナプスの最終位相ビューを提供します。その結果は、シナプス構造をはっきりと描写し、棺を形成し、フローセルを組み立てるというキンター、芸術形式です。

ここでは、感染性ウイルスや感染細胞を用いた研究や、試薬が限られているために少量を使用する必要がある場合に、バイオオプティックフローセル上でのビラール調製を実演します。使い捨てのOBフローセルは、同じビラー調製手順で使用できます。Michael Kramerと私は、タンパク質のタグ付けの手順を実演します。

タンパク質への結合に効果的なLOR4 88のような一部の蛍光色素は、顕微鏡イメージングに十分な光安定性があり、顕微鏡装置で利用可能なレーザーの励起波長と一致します。彼のタグ付きGP one 20 DH 12タンパク質を精製することから始めます。分子量カットオフが50キロダルトンの遠心フィルターユニットを使用して、タンパク質バッファーを滅菌PBSに交換します。

次に、pHを確認し、重炭酸ナトリウムpH 9.0を添加して、pH約8.5の重炭酸ナトリウムの最終濃度を50ミリモルにします。次に、平均反応性 LOR 4 88 蛍光色素を 10 モル過剰に添加します。この混合物を暗所で45分から1時間インキュベー

遠心フィルターユニットで余分な染料の除去に進みます。新鮮な滅菌PBSをカラムに加え、遊離色素からタンパク質を引き続き洗浄します。次に、GP one 20タンパク質を1ミリリットルあたり約1ミリグラムに濃縮します。

488ナノメートルの蛍光色素の濃度を測定します。また、NanoDrop分光光度計でタンパク質濃度を測定します。タンパク質とラベルの設定を使用します。

2つの数値を除算して、タンパク質の分子あたりの蛍光強度を決定します。プラスチッククランプを使用して、45ミリリットル、硫酸、15ミリリットル、30%過酸化水素のピラニア溶液を準備します。カバースリップを15分間浸します。

カバースリップをPIKA精製水で満たされたビーカーに移します各カバースリップを両側を流水で1分間2分間洗い、ラックに置いて乾かします。光学F CSによって、varona et al 2008によって以前に記載されたように、2つのチャンバーを組み立てることに進みます。次に、ヒスGP one 20をガラスに先端を触れることなく、二重層表面に捕捉して提示します。

マイクロ水道橋スライドにリポソーム混合物の5つの1マイクロリットル滴をピペットで固定します フローセルごとに5つの二重層を準備します。次に、脂質の上にカバースリップを置きます。次に、白いリテーニングリングをステンレス製のクランプベースユニットで覆います。

装置全体を裏返し、密封します。次に、二重層の位置をマークし、室温で10分間インキュベートします。次に、2ウェイストップコック付きのチューブを左の灌流チューブに取り付けます。

三方向ストップコックに取り付けられたチューブに1%ヒト血清アルブミンをハイス緩衝生理食塩水に充填し、セットアップに気泡がないことを確認します。次に、このチューブを右側の灌流チューブに取り付け、正の半月板を生成します。バッファをフローセルにそっと押し込み、バイレイヤーをブロックします。

300マイクロリットルの100マイクロモル塩化ニッケルENCカゼインが入った1ミリリットルの注射器を3方向ストップコックに取り付け、バッファーを静かに押し込みます。どちらもコックを止めてから離れます。シリンジを室温で30分間インキュベートします。

次に、HISタグ付きLOR4 88の250分子をロードし、GPを1ミクロンあたり20とラベル付けして、HIV V 1つの表面に見られる末端クラスターの局所密度を模倣します。室温で暗所で30分間インキュベートし、5ミリリットルのH-B-S-H-S-A緩衝液で層ごとに洗浄します。フローセルを摂氏37度に平衡化します。

1ミリリットルのシリンジを使用して、活性化されたヒトCDの4つの陽性T細胞を400マイクロリットルの1%ヒト血清アルブミン溶液に加え、摂氏37度のインキュベーターで45分間インキュベートし、細胞が層ごとに脂質に付着できるようにします。次に、細胞を固定するために2%のパラアルデヒドを注入し、摂氏37度で10分間インキュベートします。1ミリリットルで3回洗ってください。

次に、PBSは、5%ヤギ血清を含むカゼインを含むPBSブロックで1ミリリットルを3回洗浄した後、0.1%Triton X 100を室温で5分間注入することにより細胞を透過します。室温でPBSで3回洗ってください。次に、一次抗体とフローセルあたり300 μLのバッファーを20分から1時間加えます。

PBSを3回洗浄した後、室温で、適切な蛍光標識二次抗体をバッファーに添加します。この実験では、層別コントロールサンプルを二次抗体のみで処理し、この試薬からの非特異的シグナルのレベルを決定します。室温で20分間インキュベートした後、1ミリリットルで3回洗浄します。

PBSは、全反射法により全サンプルの画像を取得します。蛍光顕微鏡。画像解析アプリケーションパッケージ([解析セット測定値]タブの画像Jなど)を使用して、画像の定量解析を実行します。

[area] と [mean gray] の値のチェックボックスをオンにします。画像上の関心領域 (多角形またはフリーハンドでトレースされた閉じた形状) を選択します。次に、ソフトウェアの「測定の解析」タブを選択して、この測定からのデータを記録します。

結果テーブルで、測定値を平均と面積に設定し、各細胞トレースの1つの実験条件の画像を開き、関心領域とトレースを測定し、各実験条件の背景領域も測定します。測定値をコピーしてExcelに貼り付けます。すべてのデータが収集されたら、任意の単位で平均強度を計算します。

平均からバックグラウンド強度を差し引き、次に面積を掛けて任意の単位でタンパク質の統合強度を取得し、初期膜近位シグナル伝達分子の活性化と動員を測定します。ウイルス学的シナプスヒト初代CDにおけるGP one 20との相互作用の結果として、4つの陽性T細胞がG one 20を有する二重層に導入され、ICAM oneのみの二重層に導入されたICAM one細胞は、シグナル伝達の基礎レベルを定義するためのコントロールとして機能した。細胞がGP one 20およびICAM one 1を含む二重層と相互作用した後、LCKタンパク質1個をウイルス学的シナプス界面に動員し、GP one 20に局在したcolに動員した。

総LCKの平均強度は、GP one 20とICAMの両方を含む二重層の方が、ICAM単独の場合よりも高かった。興味深いことに、積分強度レベルは類似していました。まとめると。

これらのデータは、LCK が中央クラスタに再分散されていることを示唆しています。CDに4つの陽性T細胞がGPに結合すると、20。ここでは、芝の顕微鏡法で検出された平均および統合されたリン酸化LCKチロシン3 94強度を画像化し、定量化しました。

結果は、GP one 20結合がLCK活性化ループにおける残基チロシン3 94のリン酸化を増加させることを示している。対照的に、GP one 20とICAM oneの両方を含む二重層よりも、ICAM one one単独の二重層の細胞の接触領域により多くのフィンが存在しました。したがって、フィンはウイルス学的シナプスにリクルートされませんでした。

その結果、HIV one GP one 20 誘発ウイルス学的シナプスの活性キナーゼは、Finn ではなく LCK であると結論付けます。このビデオを見れば、特定のタンパク質を充填したビアの選好方法、全反射顕微鏡を用いたフローセル画像細胞のビラー相互作用に対する免疫蛍光染色、および基本的な分析方法について十分に理解できるはずです。このbilarシステムは、ウイルス学的サインアップ形成のダイナミクスをモニターできるライブセルイメージングにも役立ちます。

さらに、細胞にGFPs Z 70などの蛍光標識タンパク質をトランスフェクションしてもよい。これにより、シナプスへのシグナル伝達分子の分布と動員の変化をリアルタイムで追跡できます。