Name: 監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 学ぶヒト胚性幹細胞からインスリン産生細胞への多段階分化プロトコル。内皮細胞との共培養により膵前駆細胞の成熟を促進し、従来法より高いインスリン発現と収率を達成する革新的な幹細胞工学手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我々は116520 DP2 NIHの新しいイノベーター賞とORAUラルフポウジュニア教員強化賞からのサポートを認める。

1。細胞維持<ol><li>メディアは毎日変更でのH1 hESCの（WiCell）は、mTeSR1媒体でhESCの資格をマトリゲル被覆ウェル上で維持した。 F12：ウェルズは、DMEM 25 mlにhESCのマトリゲルの300μlを添加して調製希釈マトリゲルソリューションによって被覆されていた。このマトリゲル溶液1mlは、6ウェルプレートの各ウェルに添加し、または400μlを12ウェルプレートの各ウェルに添加し、室温で1時間コートさせた。細胞は機械的に彼らが1の間で、直径1.5ミリメートルに達した後、コロニーを掻き取ることにより、1:4の分割比で継代した。 </li><li> RHMVEC（VEC技術）が一日おきに変更するメディアとMCDB-131培地中で維持されていた。 80％の合流が1:3の分割比で到達した後、細胞をトリプシン処理によって分割された。通路3と7の間の内皮細胞は、この研究のために使用された。 </li></ol> 2。ストック溶液の調製<ol><li>アクチビンは、滅菌Pの濃度50μg/ mLで再構成したBSは、アルブミン0.1％ウシ血清を含む。溶液は-20℃で小分けして保存されていた</li><li> EGFは、無菌の10mM酢酸で500μg/ mlで再構成した。溶液は-20℃で小分けして保存されていた</li><li>インスリンは10mlの水に0.1ミリリットルの氷酢酸を添加することによって調製した酸性化し、H 2 O（pHが≤2）を追加して10 mg / mlで再構成した。 </li><li> DAPTは、18 mg / mlをDMSOに再構成した。 F12は、分注して-20℃で保存し：それはさらにDMEMで300μMの濃度に希釈した</li><li> KAAD-シクロパミンは5mg/mlでDMSOに再構成した。 F12は、分注して-20℃で保存し：それはさらにDMEMで2μMの濃度に希釈した</li><li>オールトランスレチノイン酸は、95％エタノールで2.7 mg / mlを再構成した。 、F12注し、-80℃で保存し：それはさらにDMEMで2mMの濃度に希釈した</li></ol> 3。胚体内胚葉（DE）と膵臓前駆（PP）の誘導<ol><li> H回直径1〜1.5ミリメートルに達したESCコロニー、DE誘導をDMEMを加えることによって行った：F12はB27を補充し、0.2％BSA、100 ng / mlのアクチビンのメディアと、4日間のために1μMのウォルトマニン（0日目·4日目）毎日変更します。 </li><li> DEの誘導が完了した後、膵臓の前駆細胞の誘導は、DMEMにメディアを変更することにより誘発された：F12は、24時間0.2μM濃度（4日目 - 5日）でB27、0.2％BSAとKAAD-シクロパミンを添加した。 </li><li> 24時間後、メディアはDMEMに変更されました：F12は、補充したB27、0.2％BSA、メディアは毎日変更と3日間0.2μMの濃度2μMの濃度で全トランスレチノイン酸（5日·8日目）でKAAD-シクロパミン。 </li></ol> 4。膵臓の成熟<ol><li> PPの誘導の後、すべてのグループをDMEMから成る成熟メディアに変更されました：F12、2 dのB27、0.2％BSA、10mMのニコチンアミド、25μg/ mlのインスリン、30nMでのNa 2 SEO 3〜50μg/ mlのトランスフェリンを添加したメディアとAYSは（8日·10日）毎日変更します。 </li><li>成熟培地中の2日後、最終的な成熟のステップは、並列比較のために、いくつかの異なる条件を使用して行われます。 （i）の制御などの内皮細胞がなく、唯一の共培養メディアを使用すると、（iii）RHMVEC細胞と接触共培養を用いたノッチ阻害剤DAPT（II）を使用して：分化は、以下の条件の下で誘導された。細胞は、メディアは毎日変更で（10日·17日目）週間DAPTまたは共培養培地中で維持した。 <ol><li> DAPTメディアは30μMのDAPTと成熟メディアを補完することにより調製した。このグループ内の細胞を6日間（11日·17日目）の最初の24時間MCDB131を完了するために露出し、その後DAPTメディアに暴露した。 </li><li>共培養培地は、B27とMCDB-131メディア、0.2％BSA、10mMのニコチンアミド、10 ng / mlのEGF、1μg/ mlのヒドロコルチゾン、10 mgのEndoGro、90μg/ mlのヘパリンを補完することにより調製した。メディアコントロール条件では分化細胞が露出したメディアが6日（11日目 - 17日目）（NO内皮細胞）の共培養培地に変更された後、24時間MCDB-131完全培地（10日·11日）まで。 </li><li>接触共培養条件については、100万RHMVECは、添付ファイルを許可するように24時間完全MCDB-131培地中の分化細胞（VEC技術）（10日·11日目）に添加した。 24時間後、メディアはメディアが毎日変更で6日間（11日·17日目）の共培養培地に変更されました。 </li></ol></li></ol> 5。定量RT-PCR解析<ol><li>分化の各段階（;膵臓前駆細胞、内胚葉の成熟膵島）の終わりに溶解し、RNAは、製造元の指示に従って、NucleoSpin RNA II抽出キットを用いて抽出した。 </li><li> RNA品質はSmartSpecプラス分光光度計を用いてRNAの定量に続いて、260 nmと280 nmでのRNAの吸光度をチェックして分析した。 </li><li>逆転写ImProm II逆転写kを用いて行ったそれは製造元の指示に従って。すべての反応は、RNA 100ngので行われた。 </li><li>定量RT-PCRは、製造元の指示に従ってMx3005P QPCRシステム（アジレント）とブリリアントIIのSYBR Green QPCRマスターミックスを用いて行った。用いたプライマーは表1に記載されています。初期化ステップを95に続いて2分間50°C°Cで10分間で行われた。 50増幅サイクルは、次のように行った：95℃30秒C、54°、30秒と1分間72℃のC。 </li><li>未分化細胞上の標的mRNA発現の倍数変化は、次の式を用いてCT値から算出した。 ΔCT（マーカーI）= CT（マーカーI） - CT（GAPDH） ΔΔCT（マーカーI）=ΔCT（マーカi）から（サンプル） - ΔCT（マーカi）から（未分化細胞） 相対式（マーカーI）= 2-ΔΔCT（マーカーI） </li></ol> 6。免疫細胞化学<ol><li>分化の各段階（;膵臓前駆細胞、内胚葉の成熟膵島）の終了時に細胞は、室温で15分間、4％ホルムアルデヒドで固定した。 </li><li>固定した細胞を15分間トリトンX-100（TX）0.25％を使用して浸透させた。 </li><li>非特異的染色を30分間TXを0.05％、10％ロバ血清中でインキュベートすることによりブロックされました。 </li><li>一次抗体のインキュベーションを4℃で一晩実施した、推奨抗体希釈（表1を参照）をブロッキングバッファーで°C。 </li><li>細胞を5分間0.05パーセントTXで3回洗浄した。 </li><li>二次抗体のインキュベーションは、ブロッキング緩衝液で希釈し、適切な抗体を用いて暗所に室温で1時間行った。 </li><li>細胞を5分間0.05パーセントTXで3回洗浄した。 </li><li>核染色は、PBSで1:1000に希釈した染色Hoeschtとのインキュベーションを行ったPBSで3回洗浄し、続いて5分間。 </li><li>固定および染色した細胞はオリンパスIX81倒立顕微鏡およびMetaMorphイメージングソフトウェアを使用して撮像した。 </li></ol> 7。代表的な結果 DEマーカーSOX17、CXCR4、およびFoxa2のために定量RT-PCR分析により確認し、 図2に示すように、SOX17のために免疫染色としてアクチビンの追加は、4日間のために未分化hESCのに増感剤は、胚体内胚葉を誘導する。シクロパミンとレチノイン酸の添加後、膵臓前駆細胞への分化は、膵臓前駆細胞のマーカーと、図3に示すように、PDX1の免疫染色の定量RT-PCRにより確認した。 分化の最終段階で、強くhESCの派生した膵臓の前駆細胞でのインスリン発現のアップレギュレーションを誘導RHMVEC細胞と共培養にお問い合わせください。共培養による分化の効率が共同で分析したDAPTを使用して、コントロール条件でmparing。それが現在膵臓の成熟を達成するために最も広く使用されている方法の一つですので、DAPTは、ポジティブコントロールとして使用されていました。共培養は、内皮細胞の支持要因によって補わ変更されたメディアで行われたので、追加のコントロールは、分化のメディアの効果を確認する内皮細胞の不在下でメディアを用いて行った。この分析の詳細については、図4に示されています。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3759/3759fig1.jpg" /> 図1インスリンを発現する細胞にhESCの分化のための多段階のプロトコルです。 <img alt="図2。" src="/files/ftp_upload/3759/3759fig2.jpg" /> 図2：ヒト胚性幹細胞の胚体内胚葉誘導。とウォルトマニン4日間アクチビンにさらさhESCの細胞の代表的なDEマーカーのA）定量RT-PCR解析。その結果、AR<html> eは未分化hESCのに関して正規化。 B）SOX17染色（緑）およびDAPI（青）SOX17の核発現を示しています。スケールバー：50μmである。 <img alt="図3。" src="/files/ftp_upload/3759/3759fig3.jpg" /> 内胚葉細胞由来の胚性幹細胞の図3。膵臓前駆細胞の誘導。 DE誘導後4日間シクロパミンとレチノイン酸にさらされるのhESC由来の内胚葉細胞の早期膵臓マーカーのA）定量RT-PCR解析。結果は、未分化hESCのに関して正規化。 B）PDX1染色（紫）およびDAPI（青）PDX1の核発現を示しています。スケールバー：50μmである。 &quot;&gt; <img alt="図4。" src="/files/ftp_upload/3759/3759fig4.jpg" /> 図4膵臓成熟段階）定量RT-PCR hESCの膵ホルモンの分析DAPTを使用して、膵臓の成熟した後、共培養または共培養培地（コントロール）に連絡してください。結果は、未分化hESCのに関して正規化。 p値はStudentのt-検定によって得られた。 B）RHMVEC（赤）標識ディル-AC-LDLとの共培養は、空のスペースは（上）がある場合は、ECSはプレートに取り付け、他のRHMVECが差別ESC（下）に直接接触して見つけることができる領域を示しています。共培養法を用いて分化した細胞のC）C-ペプチド（緑）染色。スケールバー：12.5ミクロン（上）と50μm（下）D）RHMVECの免疫染色では、RHMVECにはインスリンの発現を示していません。 <table border="1"><tbody><tr><td> マーカー </td><td> Primer1（5 &#39;から3&#39;）&lt;/ TD&gt; <td> Primer2（5 &#39;から3&#39;） </td><td> 参照 </td></tr><tr><td> SOX17 </td><td> CTCTGCCTCCTCCACGAA </td><td> CAGAATCCAGACCTGCACAA </td><td> 12 </td></tr><tr><td> CXCR4 </td><td> CACCGCATCTGGAGAACCA </td><td> GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT </td><td> 4 </td></tr><tr><td> FOXA2 </td><td> GGAGCGGTGAAGATGGAA </td><td> TACGTGTTCATGCCGTTCAT </td><td> 12 </td></tr><tr><td> PDX1 </td><td> AAGTCTACCAAAGCTCACGCG </td><td> GTAGGCGCCGCCTGC </td><td> 4 </td></tr><tr><td> PTF1 </td><td> CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG </td><td> GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC </td><td> 12 </td></tr><tr><td> HLXB9 </td><td> CACCGCGGGCATGATC </td><td> ACTTCCCCAGGAGGTTCGA </td><td> 4 </td></tr><tr><td> HNF6 </td><td> TGTGGAAGTGGCTGCAGGA </td><td> TGTGAAGACCAACCTGGGCT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> PAX6 </td><td> CGAATTCTGCAGGTGTCCAA </td><td> ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT </td><td> 5 </td></tr><tr><td> NKX6.1 </td><td> AGACCCACTTTTTCCGGACA </td><td> CCAACGAATAGGCCAAACGA </td><td> 5 </td></tr><tr><td> ISL1 </td><td> GATCTATGTCACCTCGCAAGG </td><td> TACAACCACCATTTCACTG </td><td> 12 </td></tr><tr><td>グルカゴン</td><td> AGGCAGACCCACTCAGTGA </td><td> AACAATGGCGACCTCTTCTG </td><td> 4 </td></tr><tr><td>インスリン</td><td> AAGAGGCCATCAAGCAGATCA </td><td> CAGGAGGCGCATCCACA </td><td> 12 </td></tr></tbody></table> 表1。定量PCR反応に用いたプライマー。

<ol><li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+%3A+de+la+transgression+de+l%27embryon+humain+%C3%A1+la+m%C3%A9decine+r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9ratrice+de+demain%5BTitle%5D)+AND+%22Gyn%C3%A9cologie+Obst%C3%A9trique+%26+Fertilit%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain.</a> Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+Signals%2C+and+Lineages+in+Pancreas+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131, 1651-1662 (2004).</li>
<li>D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).</li>
<li>Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+human+ES+cells+and+iPS+cells+into+mature+pancreatic+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells.</a> Cell Res. 19, 429-438 (2009).</li>
<li>Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Transplantation+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).</li>
<li>Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -P., Chipperfield, H., Tan, E. -K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+the+Pancreatic+Endocrine+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage.</a> Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).</li>
<li>Kim, S. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+is+promoted+by+cyclopamine%2C+a+Hedgehog+signaling+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).</li>
<li>Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+islets+of+Langerhans%3A+implications+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus.</a> Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).</li>
<li>Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -P., Ferrara, N., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vascular+Basement+Membrane%3A+A+Niche+for+Insulin+Gene+Expression+and+%5Bbeta%5D%3E+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation.</a> Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).</li>
<li>Yoshitomi, H., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+interactions+initiate+dorsal+pancreas+development+by+selectively+inducing+the+transcription+factor+Ptf1a%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a.</a> Development. 131, 807-817 (2004).</li>
<li>Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+differentiation+propensity+among+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines.</a> Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).</li>
<li>Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+co-culture+on+pancreatic+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

膵臓の開発中に、差別膵臓細胞では、大動脈からの内皮細胞と近接している。さらに、膵島は、血糖と膵島ホルモンの迅速な交換を促進するために密に血管があります。これらの事実を考えれば、内皮細胞が膵臓器官形成の過程において重要な役割を果たしていることは驚くべきことではない。膵臓の開発中の血管内皮細胞の重要性はますます高く評価されている間、胚細胞のin vitro分化におけるその役割はあまり検討されている。私たちの以前の報告では、マウス胚性幹細胞13の膵臓の成熟における内皮細胞の積極的な役割を確立した。現在の研究ではヒト胚性幹細胞の分化に内皮細胞シグナリングの効果を調べる。 複数の内皮細胞は、このプロトコルで使用されていた、そのうちのすべては、同様の全体的な効果althouの結果分化の効率の変化とGH。現在のレポートでは、ラット心臓微小血管内皮細胞（RHMVEC）との共培養のhESC由来の膵臓前駆細胞の効果を提示します。内皮細胞は内皮細胞に特異的であるAC-LDL染色によって、便利に可視化することができる。あらかじめ染色された内皮細胞との差別化ESCの共...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 濃度 </td></tr><tr><td> mTeSR1（サプリメント付き） </td><td>セル技術を幹</td><td> 5850 </td><td></td></tr><tr><td> hESCの修飾されたマトリゲル</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 354277 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM：F12 </td><td>インビトロジェン</td><td> 11330-032 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131 </td><td>インビトロジェン</td><td> 10372019 </td><td></td></tr><tr><td> MCDB-131（コンプリート） </td><td> VECテクノロジー</td><td> MCDB-131 </td><td></td></tr><tr><td> B27サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17504044 </td><td></td></tr><tr><td>アクチビン</td><td>研究開発</td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-AC</a> </td><td> 100ng/mlの</td></tr><tr><td>ワートマニン</td><td>インビトロジェン</td><td> W3144 </td><td> 1μM </td></tr><tr><td> KAAD-Cyclopamie </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> C4116 </td><td> 0.2μmの</td></tr><tr><td>オールトランス型レチノイン酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> R2625 </td><td> 2μM </td></tr><tr><td> DAPT </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> D5942 </td><td> 30μM </td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> N0636 </td><td> 10mMの</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> S5261 </td><td> 30nMの</td></tr><tr><td>インスリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> I1882 </td><td> 25μg/ mlの</td></tr><tr><td>トランスフェリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> T8158 </td><td> 50μg/ mlの</td></tr><tr><td> EGF </td><td>研究開発</td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG</a> </td><td>ガラス上培養</td></tr><tr><td> EndoGro </td><td> VECテクノロジー</td><td> ENDOGRO </td><td> 10mgの</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H3149 </td><td> 90μg/ml </td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H0888 </td><td> 1μg/mlの</td></tr><tr><td> NucleoSpin RNA II </td><td>マシュレナーゲル</td><td> 740955 </td><td></td></tr><tr><td> ImProm II逆転写システム</td><td>プロメガ</td><td> A3800 </td><td></td></tr><tr><td>ブリリアントIIのSYBR Green QPCRマスターミックス</td><td> Straragene </td><td> 600548 </td><td></td></tr><tr><td> SOX17ヤギポリクローナルIgG </td><td>サンタクルス</td><td> SC-17355 </td><td> 500分の1 </td></tr><tr><td> PDX1ヤギポリクローナルIgG </td><td>サンタクルス</td><td> SC-14662 </td><td> 500分の1 </td></tr><tr><td>ポリクローナルC-ペプチドのウサギ</td><td>細胞シグナリング</td><td> 4593 </td><td> 500分の1 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 488ロバ抗ウサギIgG </td><td>インビトロジェン</td><td> - 21206 </td><td> 1000分の1 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 647ロバ抗ヤギIgG </td><td>インビトロジェン</td><td> - 21447 </td><td> 1000分の1 </td></tr></tbody></table>表2。試薬およびキット。

監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

胚性幹細胞（ESC）は、2つの主な特徴を持っている：彼らはいつまでもこのように複数の系統に分化する可能性を有する未分化の状態でin vitroで増殖させ、彼らが多能性であることができます。このような性質は、細胞ベースの治療と再生治療のアプリケーション1のESCのは非常に魅力的です。しかし、実現するための最大限の可能性のために細胞は骨の折れる作業である成熟した機能的な表現型に分化する必要があります。細胞分化を誘導するのに有望なアプローチは密接にin vitroでの設定で器官形成のパスを模倣することである。膵臓の開発は、肝臓や膵臓など、いくつかの臓器に開発することができます内胚葉から始まる、特定のステージ2で発生することが知られています。内胚葉誘導は4月7日 、いくつかの成長因子との組み合わせで3アクチビンの添加によりリンパ節転移経路の変調によって達成することができる</&gt; supの。胚体内胚葉細胞は、シクロパミン8の添加によってin vitroで達成することができますソニック·ザ·ヘッジホッグ阻害の阻害による膵のコミットメントを受けています。膵臓の成熟は、ノッチシグナル伝達の阻害を含むいくつかの並列イベントによって媒介される、3次元のクラスタに膵臓の前駆細胞の凝集、血管新生の誘導、いくつかの名前を指定する。これまで最も成功したESC由来の膵臓前駆細胞の体外成熟によってDAPT補充9でNotchシグナル伝達の阻害を介して達成されている。成功したものの、減少している機能を持つ成熟した表現型の低収率でこの結果。以下の研究領域は、ますます、生体内の膵島成熟10,11の重要な要因として評価されている膵臓の成熟にシグナリング内皮細胞の効果である。 現在の研究では、endothelのような効果を探るIAL細胞は膵島様細胞をインスリン産生にヒトESC由来の膵臓前駆細胞の成熟にシグナル伝達。我々は、ヒトESCが最初にPI3K経路を阻害するとともに、アクチビンによって内胚葉に向かって誘導される多段階の指示分化プロトコルを報告する。内胚葉細胞の膵臓の仕様は、レチノイン酸を添加することによりレチノイド誘導とともに、シクロパミンによってソニック·ザ·ヘッジホッグシグナル伝達の阻害によって達成されます。成熟の最終段階は、共培養の構成によって達成さ内皮細胞のシグナル伝達によって誘導される。いくつかの内皮細胞の共培養でテストされているが、ここに我々は、主に分析を容易にするために、ラット心臓微小血管内皮細胞（RHMVEC）で我々のデータを提示します。

現在の研究では、ヒト胚性幹細胞の膵臓の分化誘導の指示分化のアプローチについて説明します。大きな意義のインスリン発現する細胞に膵臓の前駆細胞由来のヒト胚性幹細胞の発見、その内皮細胞の共培養を仲介する成熟である。

胚性幹細胞（ESC）には2つの大きな特徴がある。1つは、未分化状態でin vitroで無限に増殖させることができることであり、もう1つは...

本プロトコルでは、従来のプロトコルよりも高い収率でインスリン産生細胞を得るための有効な手法として、ヒト胚性幹細胞の多段階分化を提示します。まず、Activin AおよびPI3K阻害剤を用いて決定的な内胚葉を誘導します。次に、膵前駆細胞の誘導を促進するため、細胞をTamin Aおよびレチノイン酸に曝露させます。その後、内皮細胞と共培養し、膵前駆細胞からインスリン発現細胞への成熟を媒介させます。免疫蛍光顕微鏡観察およびQPCRによる機能解析を行い、C-ペプチドの発現とインスリンのアップレギュレーションを実証します。既存の手法と比較した本手法の主な利点は、インスリンのより高いアップレギュレーションが得られるとともに、発現細胞の培養においてより高いcpepの収量が得られることです。ヒト胚性幹細胞コロニーを直径1から1.5 mmのサイズまで育成し、細胞をCO 12まで培養します。ウェルプレートの各ウェルに、D-M-E-M-F 12培地で希釈したHESC matrigelを1 mLずつ入れておきます。その間に、HSCから培地を吸引し、mTroneに交換します。その後、スクレイピングにより細胞を回収します。回収した細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、新鮮なmTroneを加えてから、あらかじめmatrigelでコーティングした12ウェルプレートに1:4の分割比で播種します。増殖細胞の直径が1～1.5 mmに達したら、activin AおよびPI3K阻害剤であるWortmanninを含む定常内胚葉誘導培地を添加し、分化を開始させます。そのまま4日間培養します。培地を毎日補充します。まず、0.2 µMのKAAD-cycl dopamineを含む完全D-M-E-M-F 12で24時間培養し、膵前駆細胞への誘導に進みます。次に、培地を0.2 µMのKAAD-cycl dopamineおよび2 µMのオールトランスレチノイン酸を含む完全D-M-E-M-F 12に交換し、培地を毎日補充しながら3日間培養します。ESC由来膵前駆細胞のin vivo成熟のポジティブコントロールとして、分割前にNotch阻害剤DAPTを用いて、最終成熟ステップを行う2日前から成熟培地で細胞を培養します。顕微鏡下で血管内皮細胞を確認し、コンタクト共培養条件に向けて細胞をトリプシン処理してカウントします。完全MCDB 131培地を用いて、分化細胞に100万個のラット心臓微小血管内皮細胞を添加します。また、血管内皮細胞のみを含む共培養培地を用いて、コントロール培養液を準備します。すべての処理条件をインキュベーターに入れ、培地交換を行いながら6日間培養します。分化プロセスの各段階の終了時に、毎日サンプル細胞を回収します。製造元の指示に従い、nucleus spin E-R-R-N-A抽出キットを用いて、Endo dam、膵前駆細胞および成熟アイレット抽出物のRNAを抽出します。SmartSpec Plus分光光度計とクオーツキュベットを使用し、260 nm対280 nmの吸光度比によってRNAの品質を判定します。また、1サンプルあたり100 ngのRNAテンプレートとなるよう、サンプルの濃度を算出します。即席逆転写キットを用いてRT反応を行います。次に、提示されたプライマーを使用してQPCRのセットアップを行い、反応液をサーモサイクラーにロードしてQPCRプログラムを実行します。その後、CT値を用いて、分化の各段階の終了時における未分化細胞に対する標的mRNA発現の倍率変化（fold change）を算出します。室温で4% formaldehydeを用いて細胞を15分間固定する。次に、非特異的染色のブロッキングのため、0.25% Triton X 100で10分間透過処理を行う。0.05% TXに含まれる10% donkey serumを加え、30分間置く。次に、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体を加え、4 °Cで一晩インキュベートします。サンプルを0.05% Triton Xで5分間洗浄します。その後、ブロッキングバッファーで希釈した二次抗体を加え、室温の暗所で1時間インキュベートします。0.05% x-to-stay 溶液で核を3回、各5分間洗浄します。1:1000に希釈したホースステイン（PBS希釈）で5分間インキュベートした後、PBSで3回洗浄します。倒立顕微鏡とイメージングソフトウェアを使用して、固定および染色された細胞の画像を撮影します。未分化ヒト胚性幹細胞にアクチブAおよびウォートマンを4日間添加することで、確定的内胚葉を誘導します。Q-R-T-P-C-R解析により、期待される確定的内胚葉マーカーであるSOX 17、CXCR 4、およびFox A 2の存在が確認されました。緑色のSOX 17免疫染色は、ここにある青色のDPI染色された核との共局在を示しています。シクロヘキシミド、アミン、およびレチノイン酸の添加後、膵前駆細胞への分化が、膵前駆細胞マーカーのQ-R-T-P-C-RおよびPDX 1の免疫染色によって確認されました。分化の最終段階において、ラット心臓微小血管内皮細胞との接触共培養により、HESC由来膵前駆細胞におけるインスリン発現の強力なアップレギュレーションが誘導されました。RHM VECで標識したAC LDLとLを共培養すると、ECSがプレートに接着している領域が認められます。空白部分がある場合、予想通り、分化中のESCに直接接触している他のRHM VECを確認できます。RHM VECの免疫染色の結果、インスリンの発現は検出されませんでした。Eptide染色は、共培養法を用いた細胞分化における有用なマーカーとしても機能します。この手法により、幹細胞分化の過程における細胞間相互作用の調査が可能となり、成熟した表現型の機能性が明らかに向上することが示されました。

endothelial-cell-co-culture-mediates-maturation-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

単離するためのプロトコルは、ヒト胎児膵臓細胞由来培養し、画像膵島細胞クラスター（ICCは）が記載されている。方法は、組織、文化単層として、または凝集体懸濁液中、および増殖のマーカーと膵臓細胞運命決定のための画像からのICCを生成するために必要な手順を詳しく説明します。...

ヒト胎児膵臓細胞クラスターの単離、培養、およびイメージング

ここでは、成体の皮膚線維芽細胞をインスリン分泌細胞に変換する新しい方法が紹介されています。この技術はエピジェネティックな変換に基づいており、レトロウイルスベクターの使用や安定した多能性状態の獲得を伴いません。したがって、トランスレーショナルメディシンの応用に非常に有望です。...

大人の皮膚線維芽細胞からのインスリン分泌細胞を得るために安全かつ簡便な方法として、エピジェネティック変換

ここでは、in vitroで NKX6-1 +膵臓前駆細胞にヒト胚性幹細胞を区別するために4段階のプロトコルを記述します。このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞株の多様に適用することができます。...

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

iCRISPRプラットフォームを使用HPSC変異株を作製し、グルコース応答性β様細胞にhPSCsを区別するためのプロトコルが記載されています。 HPSC指向分化にゲノム編集技術を組み合わせることにより、人間開発と疾患の進行中の系譜決定因子の役割の体系的な分析のための強力なプラットフォームを提供します。...

ヒト膵臓の開発にリネージュの決定要因を問い合わせるためのゲノム編集とhPSCsの指向性分化

このプロトコルは、ヒト歯髄幹細胞(hDpSC)を...

インビトロ 膵臓系統に向けたヒト歯髄幹細胞の誘導

本プロトコルは、平面単層におけるヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する膵臓前駆細胞におけるPDX1およびNKX6.1転写因子の共発現を増加させるための増強された方法を記載する。これは、新鮮なマトリックスを補充し、細胞密度を操作し、内胚葉細胞を解離することによって達成される。...

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

幹細胞の膵島細胞への分化は、従来の糖尿病治療や疾患モデリングに代わるソリューションを提供します。市販の分化キットと以前に検証された方法を組み合わせて、インスリン分泌性幹細胞由来の膵島を皿で産生するのに役立つ詳細な幹細胞培養プロトコルについて説明します。...

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

この記事はセルのようなβ細胞の指示された微分そして機能分析のためのプロトコルを示す。インスリン産生膵細胞を作製する前のヒト多能性幹細胞の最適な培養条件と継代について記述します。6段階の分化は、決定的な内胚葉の形成から、グルコースに反応してインスリンを分泌する機能的なβ細胞様細胞へと進行します。...

ヒト多能性幹細胞から機能的な膵臓インシュリン分泌細胞を生成するための最適化されたプロトコル

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

このビデオでは、我々の研究室は、日常的にトリプシンとの色合いのヒト胚性幹細胞株を通路方法を示します。...

トリプシンで継代色合いヒト胚性幹細胞、線

学ぶヒト胚性幹細胞からインスリン産生細胞への多段階分化プロトコル。内皮細胞との共培養により膵前駆細胞の成熟を促進し、従来法より高いインスリン発現と収率を達成する革新的な幹細胞工学手法です。

監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟

さらに動画を探す