三次元混合細胞スフェロイド共培養から乳腺上皮細胞の分離

この手順の全体的な目的は、ストローマ線維芽細胞が上皮細胞の生物学に及ぼす影響を分析するために、三次元混合細胞組織培養から上皮細胞を誘導することです。これは、まず三次元混合細胞ステロイド共培養を構築することによって達成されます。その後、共培養後の上皮細胞を単離するために、スフィアをマトリックス培養から分離します。

次のステップは、解析に供するまで、共培養後の上皮細胞を継代することです。最終的に、3次元培養における線維芽細胞への曝露が上皮細胞の挙動に及ぼす影響は、培養物の顕微鏡イメージングおよび共培養後の解析を通じて評価できます。上皮細胞について、ここではマトリックス浸潤の蛍光イメージングやTranswell移行能試験などの解析例を示します。共培養を構築した翌日に行うこの手順については、私の研究室のリサーチアソシエイトであるQuinが実演します。

Matrigelをフリーザーから取り出し、4°Cの冷蔵庫内で氷上に置いて一晩解凍します。実験当日は、Matrigelと混合する少なくとも1時間前に、培地を氷上に置いておきます。解凍したMatrigelを希釈します。

共培養に必要な量の半分に相当する氷冷 H Mac medium を、氷上の滅菌チューブに加えます。次に、チューブを氷上に保持したまま、同量の融解した matrigel を加えて 1:1 の希釈液を作成します。続いて、24ウェルプレートの指定されたウェルの中央に 50 µL の matrigel 培地混合液を滴下し、加湿空気および 5% CO2 を備えた 37 °C のインキュベーターで 10 分間インキュベートします。

その後、ウェルにさらに450 µLのMatrigel培地混合液を加え、さらに60分間インキュベートします。2回目のインキュベーションの間に、線維芽細胞と上皮細胞を1:1の割合で、H me培地0.5 mLあたり0.5 × 10⁵ cellsの濃度になるように懸濁液を調製します。Matrigel培地混合液が凝固したら、細胞懸濁液をゲルの上に静かに滴下し、培養容器をインキュベーターに戻して2日間培養します。

2〜3日ごとに、ウェルの端から培地を非常に穏やかに吸引し、新しいHEC培地と慎重に交換します。顕微鏡下で毎日スフェロイドの形成を確認し、必要に応じて明視野顕微鏡または蛍光顕微鏡を用いて画像を撮影します。まず、滅菌済みの2 mLガラスピペットを用いて、培養液を10回ピペッティングします。次に、ガラスピペットで培養液を滅菌済みの15 mL遠心チューブに移し、室温で350 ×gで10分間遠心分離します。遠心分離後、細胞スフェロイドがチューブの底に沈殿します。

滅菌済みのパスツールピペットチップを使用して、遠心管上部の破砕されたマトリゲルを慎重に取り除きます。準備として、ペレット化したステロイドに1 mLのH mac培地を加え、滅菌済みの2 mLガラスピペットで2～3回ピペッティングし、培養物を24ウェル組織培養プレートのウェルに転移させます。培地を交換する前に、ステロイドを少なくとも48時間皿に接着させておいてください。

時間の経過とともに、細胞は球状構造から脱し、単層として増殖します。細胞培養が50% Confluenceに達した後、標準化プロトコルを用いて35 millimeterディッシュに継代し、2～4日間培養した後、さらに細胞分析を行う前に100 millimeterディッシュに継代して3～5日間培養します。滅菌済みパスターピペットを使用して培地を吸引し、残留しているスフェロイドを可能な限り手動で除去します。図D、E、Fに示される、TM oneサイレンシングを導入した線維芽細胞を用いた3次元スフェロイド共培養では、図A、B、Cのコントロール線維芽細胞と比較して、乳腺上皮細胞によるマトリックス浸潤の増加が誘導されます。図DおよびFの矢印で示されているように、TM oneサイレンシング線維芽細胞を含むスフェロイドにおいて、マトリックス内に浸潤する上皮細胞の突出に注目してください。一方、図J、K、Lに示されるTM oneの過剰発現を導入した線維芽細胞では、図G、H、Iのコントロール線維芽細胞と比較して、乳癌細胞株sum 1 59による浸潤の減少が誘導されました。共培養スフェロイドが形成された後、図GおよびIの矢印で示されるコントロール線維芽細胞を含むものと、TM one導入線維芽細胞を含むものとで、上皮細胞の突出が見られないことを比較してください。

細胞集団は、二次元的な環境で再播種することにより、ステロイドから単離することができます。この合成画像は、Matrigel培養から単離した後の、光学顕微鏡および蛍光顕微鏡下での培養様子を示しています。0日目は単離直後のイメージングであり、1日目、2日目、および5日目は単離後の経過日数を示しています。

このステロイドから離脱する細胞のコロナが、時間の経過とともに増加することに注目してください。最終的に、矢印で示されているように、細胞がほとんど残っていないゴーストステロイドが残ります。ゴーストの除去と継代後には、ステロイドはごくわずかしか残りません。

テストした細胞の相対的な増殖率によって異なります。継代を繰り返すことで純粋な集団が得られる場合もありますし、適切な細胞マーカーを用いて分取することも可能です。この例では、サンプルをフローサイトメトリーで解析し、緑色蛍光と赤色蛍光を用いて、それぞれGFP発現線維芽細胞とmCherry発現上皮細胞を特定することで、上皮細胞と線維芽細胞の相対的な集団比率を決定しています。

3D共培養から単離した後も、上皮細胞は長期間にわたって線維芽細胞との共培養によって付与された特性を保持するため、十分に分析を行うことが可能です。この例では、TM one欠損線維芽細胞への曝露により、共培養したH maxの遊走能が亢進し、3D共培養から単離した後も数週間にわたってその状態が持続しました。これは、ここでCと表記されるコントロール線維芽細胞への曝露と比較した結果です。この手順に続き、遺伝子発現の変化やエピジェネティックな標識を分析するなどの他の手法を用いることで、線維芽細胞が上皮細胞に及ぼす影響に関するさらなる疑問を解明することができます。