リビングでの動的動原体タンパク質の挙動と染色体の動きを図解して有糸分裂チェックポイントを勉強

この実験の目的は、タイムラプス共焦点顕微鏡を用いて、生きたショウジョウバエ胚におけるin vivoのタンパク質ダイナミクスおよび局在パターンの可視化を実証することです。まず、維持されているショウジョウバエ系統から胚を回収します。次に、胚をスライドグラス上に移し、胚から繭を手作業で取り除いて、コーティングされた胚にします。

その後、適切に準備したスライド上に規則正しくマウントし、実験に応じて、適切な紡錘体チェックポイント誘導試薬をマイクロインジェクションします。この手順の最終ステップは、共焦点顕微鏡を用いて胚のタイムラプスイメージングを行うことです。最終的に、タイムラプスイメージングおよび共焦点顕微鏡を用いて、紡錘体チェックポイントタンパク質の共局在、染色体の挙動、およびチェックポイント関連の形質転換oph系統におけるチェックポイント誘導剤の効果を明らかにします。

この手法は、遺伝子系統を用いて紡錘体チェックポイントタンパク質の変異や欠損が他のチェックポイント構成要素の共局在に及ぼす影響や、それが紡錘体形成チェックポイントの効率的な機能にどのような結果をもたらすかなど、ME制御分野における重要な疑問への解答に寄与します。形質転換ショウジョウバエは、ショウジョウバエ用培地を入れたプラスチックバイアル内で25 °Cに維持され、上部に乾燥酵母粉末を追加します。バイアルは、飼育条件に応じて通常2〜3週間ごとに交換します。

ショウジョウバエの餌を準備するには、ペリスタティックポンプを用いて、成分を溶解させるため適切量の餌ミックスを絶えず攪拌しながら加熱し、この培地をスラリー状に各プラスチックバイアルに8〜10 mLずつ分注します。餌のスラリーが凝固し、室温まで冷却されたら、各バイアルに綿フォームプラグを詰めます。これらの餌バイアルをトレーに入れ、プラスチック袋で密封し、小規模な卵回収のために4 °Cで保存します。

胚を産み付けさせるため、2〜3日齢の成虫約50ペアを、表面に乾燥酵母粉末を追加した新しい餌入りバイアルに移します。空調によって維持されている25°Cでインキュベートします。1時間ごとに、ハエを新しいバイアルに移し、胚を30分間放置します。

回収した胚の一部が核分裂周期8〜10付近にあることを確実にするため、通常、最初の1時間の回収分は廃棄します。これは、産卵に適さない条件下で雌の体内に保持されていた、成熟しすぎた胚がしばしば含まれるためです。したがって、本実験では2時間目以降に転送された胚のみを使用します。

この手順では、顕微鏡スライドガラスと50 by 22 mmのカバーガラスを使用します。まず、カバーガラスを用意し、湿らせた細いペンブラシを用いて、片側の四隅に極少量の水をつけます。その後、カバーガラスを顕微鏡スライドガラスの上に置きます。

薄い液膜による毛細管表面張力により、カバーガラスの移動が抑制されるはずです。カバーガラスの中央にヘプタン接着剤を細く塗布します。ヘプタンは数秒で蒸発し、カバーガラスに接着剤が残ります。

次に、ダイヤモンドペンを用いて、別のカバーガラスを約1.5 mm四方の小さな正方形に切り分けます。切り分けた正方形を1枚取り、接着ストリップの端に配置します。これは、マイクロインジェクションが必要な際に、ニードルの先端を開くために使用します。

別の顕微鏡スライドガラスを用意し、2 cmの長さの両面テープを貼り付け、カバー紙を剥がして胚のコーティング手順を開始します。湿らせた細いペンブラシを用いて、ショウジョウバエを新しい餌入りバイアルに移します。準備したスライド上の両面テープに、約50個の卵を転写します。

卵が広がる程度の適当な量の液体を使用します。液体が蒸発すると、解剖顕微鏡下で卵がテープに付着します。ピンセットの片側の外側を用いて、卵の長軸に沿って数回そっと触れ、コリオロン（卵膜）を突き破って開口させます。

急速な脱水を防ぐため、胚をコリアンシェルに入れたままにします。10個から20個の卵に処理が行き渡るまで、この操作を繰り返します。次に、胚を一つずつコリアンシェルから取り出し、垂直ストリップに緩やかに配置します。

グルーストリップ上に配置します。胚を、グルーストリップの長辺に対して反平行になるように並べます。胚をデシケーションチャンバーに3〜8分間置きます。

最後に、マイクロインジェクション前の過剰な脱水を防ぐため、胚を適切な量のvolter left tennis oilで覆います。マイクロインジェクションはこの手順の中で最も困難な工程です。マイクロインジェクションを可能な限り簡単かつ効率的に行うために、スライド標本作成の特定のプロトコルに従ってください。

胚をマイクロインジェクションに最適な状態にするため、慎重に調製する必要があります。胚のマイクロインジェクションに使用する針は、事前に準備しておきます。細いローディングチップを用いて、注入バッファーで調製した適切な濃度の試薬を1〜2 µL、針の後方に充填します。

Leica TCSP 2 倒立共焦点顕微鏡のニードルホルダーにニードルを装着し、圧力パイプをインジェクション制御システムに接続します。40倍対物レンズで胚を探します。次に、焦点面を変えずにニードルの影を確認します。

これは、針を視野の中心に移動させ、右焦点面まで徐々に下げることで行います。顕微鏡ステージを非常にゆっくりと動かし、接着ストリップの一端に予め取り付けられているカバーガラスの小さな正方形を探します。針先を非常にゆっくりと動かし、小さな正方形のカバーガラスの端に当たり、静かに割れるまで操作します。

ステージを移動させて胚を再び視野に入れ、注入に適した齢の胚を選択します。胚を慎重に針に近づけ、胚と針の両方の焦点面を再調整します。胚を針の中に移動させます。

胚の側面に試薬を1滴注入し、その後、胚を移動させます。生存している胚のタイムラプス画像または単一画像は、40倍の油浸対物レンズを備えたLeica TCSS SP 2倒立共焦点顕微鏡システムを用いて収集します。スペクトルが重複し、同一の胚に共発現している複数の蛍光分子をイメージングする場合、各蛍光タンパク質の放出波長を順次収集します。

これらの画像は、タイムラプスイメージングの時間枠を設定した際に後から得られたものです。これらの要因を考慮する必要があります。通常、1枚の画像は2本のスキャンラインの平均として取得されます。

平均2回のフレームスキャンを行う場合、同時スキャンモードでは512×512ピクセルの画像をスキャンし、十分なS/N比を得るまでに最低6.3秒かかり、順次スキャンモードでは15.44秒かかります。ピンホールは通常1〜2 au（エアリー単位）に設定し、顕著な光退色を避けるため、レーザー出力は可能な限り最低レベルに調整します。この代表的なタイムラプス動画は、生きた雌魚の胚におけるCDC 20の動的なキネトコアリクルートメントと染色体の動きを示しています。

GFP-CDC20（緑色で表示）およびRFP-his stone 2B（赤色で表示）を共発現する形質転換初期胚からタイムラプス画像を取得した。核分裂サイクル中、10秒ごとに7〜8フレームを撮影し、細胞がすでに前相にあるフレームを時間点0とした。この図はタイムラプス動画の各フレームを示しており、画像3および4の白矢印で示すように、GFP-CDC20が前相および前中期キネトコアに容易に観察され、さらに画像5および6で観察されるように、中期および後期キネトコアに持続的に存在することがわかる。

画像1の白矢印で示される界面核からG-F-P-C-D-C 20は排除されており、画像2に示されるように、前期の初期までに核内へ進入します。画像8から14では、共発現させたRFP histone two Bをマーカーとして、マージ画像を用いてクロマチンの形態を判定しました。画像は最下段に表示されています。

本プロトコルを用いれば、抗体、蛍光標識タンパク質、またはSACを誘発する可能性のある目的の化学物質を微量注入して胚を操作することで、紡錘体形成チェックポイント（SAC）の機能を解析できます。本例では、コルヒジンを用いて微小管を脱重合させ、SACを誘発させ、GFP CDC 20またはGFP MADを観察しています。細胞周期の進行マーカーとして、2つのキネティックコアシグナルを使用しました。

上段のパネルにおいて、ARESは画像2から6における停止した紡錘体を示しています。画像1で矢印で示された領域は、コルヒチン処理前であり、G-F-P-C-D-C 20が後期インターフェース核から除外されていることを示しています。中段のパネルの画像は、内因性MAD2が存在しない場合、画像7から12の矢印で示されるG-F-P-C-D-C 20が、核への出入りおよびキネトコアへの結合と解離を繰り返し続けていることを示しています。

細胞質分裂に欠損が見られますが、これはコルヒチン処理に対する細胞停止におけるSAC機能の不全を示唆しています。娘核の分離不全の例は、画像10で観察されます。最後に、画像14から18の下パネルの矢印は、GFP MA two融合タンパク質が蓄積した静止したキネトコアを示しており、これは機能的なGFP MA twoがMA two変異胚におけるsac欠損表現型を回復させることを示唆しています。

画像13の矢印は、後期インターフェース核におけるGFP MAD 2の蓄積を示しています。これらのビデオを視聴することで、維持されている柄から2つのソフトウェア胚を採取する方法、および共焦点顕微鏡を用いたin vivoタイムラプスイメージングのためのマイクロ注入用スライドを準備する前に、手動で胚を分離させる方法について十分に理解できるはずです。