土壌中の微生物の残留決定のためのAldononitrile酢酸誘導体化グルコサミンとムラミン酸のGCベースの検出

このビデオの目的は、土壌から抽出したグルコサミンおよびムコン酸のAldonニトリル酢酸誘導体のGC分析について詳細な説明を提供することです。このプロセスは、酸消化から始まり、有機ポリマーを分解してグルコサミンとムコン酸を遊離させます。その後、混合溶液からアミノ糖モノマーを単離および精製します。

続いて、ガスクロマトグラフィーによる分析のために、これらのアミノ糖を揮発性のアルドンニトリルアセテートに変換する誘導体化を行います。本手順の最終ステップは、液液抽出およびGCによる定量です。最終的に、水素炎イオン化検出器を用いたGCにより、myoおよびacetolとメチルグルタミン標準品の間に溶出するアルドンニトリルアセテートアミノ糖のベースライン分離を示す結果を得ることができます。

この手法の他の方法に対する主な利点は、精度、感度、簡便さ、良好なクロマトグラフィー分離能、および試料保存時の安定性が最適にバランスされていることです。本手法は、安定した土壌炭素プールに対するSSE微生物の寄与など、地球規模の炭素循環分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。また、本手法は土壌中の微生物デトリタスの蓄積に関する知見や情報を提供できるだけでなく、海洋系、生物組織、さらには地球外試料などの他のマトリックスにも適用可能です。

本プロトコルを開始するには、採取した土壌試料を凍結乾燥させ、ボールミル式土壌粉砕機または乳鉢と乳棒を用いて粉砕し、均質化します。粉砕した土壌試料を25 milliliterの加水分解フラスコに秤量します。各加水分解フラスコに6 molarの塩酸を10 milliliters加え、窒素ガスで満たしてからしっかりと蓋を閉めます。

インキュベーターを用いて105 °Cで8時間加水分解します。オートタイマースイッチを使用して、フラスコをインキュベーターから取り出し、室温まで冷却します。

各フラスコに内標準物質としてmyo-アセトールを100 µL加えます。プラスチック製漏斗を200 mLの梨形フラスコに差し込み、旋回させて混ぜ合わせます。安定させるため、標準テーパーサイズ24/40のすり合わせ接合部をプラスチックカップの上に設置します。

Whatman No.2定性ろ過円筒ろ紙を4等分に折り畳み、漏斗にセットします。各加水分解フラスコを撹拌し、スラリーを漏斗に注ぎます。各サンプルのろ過後、真空回転蒸発装置を用いて、約45 °Cでろ液を乾燥させます。

各ペアフラスコの乾燥残渣を3〜5 mLの水で懸濁し、40 mLのテフロンチューブに注ぎます。2回目の水で各フラスコを洗浄します。金属イオンやその他の有機分子を沈殿させるため、1 M水酸化カリウム溶液を用いて、試料のpHを6.6〜6.8に調整します。その後、2000 ×gで10分間遠心分離し、沈殿物を除去します。

上清を40 mLのガラスチューブに注ぎ、チューブの開口部をパラフィルムで密閉して上清を凍結させ、その後、パラフィルムに穴を開けます。凍結させた上清を凍結乾燥させ、すべての液体を除去します。上清の乾燥後、残渣を3 mLの脱水メタノールで溶解させます。

十分にボルテックスした後、チューブにキャップをし、2000 ×gで10分間遠心分離します。塩を沈殿させるため、上清を3 mLのコニカル反応バイアルに移し、高速真空濃縮機を用いて45 °Cで、または乾燥窒素ガスを緩やかに流して乾固させます。蒸発後、各バイアルに100 µLのリカバリー標準品およびメチルグルタミンと、1 mLの水を加えます。

次に、誘導体化を開始する前にサンプルを凍結させます。書面の手順に従って標準試料を作成し、サンプルと標準試料の両方を凍結乾燥させます。32 mg/mL のヒドロキシルアミン塩酸塩と 40 mg/mL を含む誘導体化試薬を調製します。

4-ジメチルアミノプリンのメタノール溶液を用意します。各反応バイアルに誘導体化試薬を300 µL加え、蓋をしっかりと閉めて十分にボルテックスします。密閉したバイアルを75〜80 °Cの恒温水槽で35分間静置します。

バイアルをウォーターバスから取り出し、室温まで冷却します。その後、3 mLの反応用バイアルそれぞれに無水酢酸を1 mL加え、蓋をしっかりと閉めて十分にボルテックスします。続いて、75～80 °Cのウォーターバスで25分間、2回目のインキュベーションを行います。

バイアルをウォーターバスから取り出し、室温まで冷却します。分離および測定を開始するために、各チューブに1.5 millilitersのジクロロメタンを加え、ボルテックスします。各バイアルに1 molarの塩酸を1 milliliter加え、十分にボルテックスした後、2つの相が分離するまで静置します。

上層の水相を吸引して廃棄します。同様に1000 µLピペッターを用いて有機相を3回抽出しますが、最後の洗浄ステップでは1 mLの水を使用します。上層の水相が完全に除去されていることを十分に確認してください。

45°Cで急速真空蒸発器（VAP）を使用するか、または窒素ガス流を用いて最終溶液を乾燥させ、各サンプルを300 µLのエチル酢酸／ヘキサンに溶解させます。その後、少量用インサートを備えた2 mLの琥珀色スクリューキャップバイアルに移し、しっかりと蓋をします。記述されたプロトコルに従い、DB-5などの縮合シリカ非極性キャピラリーカラムを備えた水素炎イオン化検出器付きガスクロマトグラフィーを用いて定量分析を行います。標準的なランと分析の後、キャリアガスの流量を調整し、アセトイルグルコサミンおよびムコ酸誘導体が250°Cで溶出し、エンドメチルグルタミンが270°Cで溶出するようにします。

ガスクロマトグラフィーの分析に続き、GCインレットを250 °Cに設定し、オートサンプラーを用いて1 µLの30:1スプリット注入を行います。本手順の最終ステップとして、書面プロトコルで述べられているクロマトグラフィーおよびスペクトロメトリー法を用いて、誘導体のバリデーションを実施します。標準試料および土壌サンプルを用いたグルコサミンおよび尿酸の分析例をここに示します。また、正確な量の標準物質の添加量と2つの内部標準それぞれの応答係数に基づいた本手法を用いることで、グルコサミンおよびムチン酸に加えて、グルコサミンの2つの異性体であるオサミンおよびガラクトサミンを同時に定量することが可能です。

土壌試料中のこれらのバイオマーカー量を測定することができます。また、回収標準物質を用いて誘導体化プロセスを定性的にモニタリングしました。アルドンニトリル酢酸エステル、グルコサミン誘導体、およびムコン酸の生成スキームをここに示します。

1番はニトリル反応を、2番はアセチル化を表しています。電子衝撃イオン化により生成されたイオンフラグメントの推定構造について、さまざまな同位体標識を用いて調製した試料のイオンスペクトルを比較することで検討しました。ここでは、グルコサミンのアルドンニトリルアセテート誘導体の主要イオンにおける、異なるシナリオでの質量シフトを示しています。

この例では、ラベルなしの試薬に加えて、同位体標識した無水酢酸および同位体標識したグルコサミンを用いて調製しました。化学構造式の星印は、重同位体原子または同位体基を表しています。この手順を行う際は、誘導体化の間、厳格に無水条件を維持することが重要です。

この段階で使用する有機溶媒とガラス器具は、ともに乾燥している必要があります。多くの販売業者から脱水溶媒が販売されていますが、手元にある溶媒は、硫酸マグネシウムなどの乾燥剤を含むカラムを通過させることで乾燥させることができます。この手順に続き、比質量分析などの他の手法を実施することで、マクロビューティー（macro beauty）がどのように反応するか、あるいは、成長後の生細胞と死細胞を区別することにより、炭素や窒素が土壌中でどのように代謝され蓄積するかといった追加の疑問を明らかにすることが可能です。

この手法は、マクロ生態学、土壌生物学、および土壌化学の分野の研究者が、自然または管理された陸域システムにおける土壌有機物へのマクロな寄与および隔離について探求するための道を切り開きました。