移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する

この手順の全体的な目標は、EAE誘導に耐性があると言われているマウスを含む、あらゆるマウス系統でEAEを一貫して容易に誘導することです。これは、まずドナーマウスをミエリン特異的タンパク質またはペプチド抗原で免疫し、完全なフレスアジュバントで乳化することによって達成されます。10日後、ドナーマウスからリンパ節を分離し、リンパ節細胞を同じ抗原で4〜5日間培養することにより、in vitroで再刺激します。

その後、細胞はナイーブレシピエントマウスに養子縁組されます。感受性マウス系統は、8〜14日でEAEを発症し、耐性株でEAEを誘発します。養子縁組の移管から14日後、レシピエントマウスをCFAの抗原で免疫した。

この方法を使用すると、EAEは耐性マウス系統で誘導できます。EAEを誘導するための適応移植およびチャレンジプロトコルの主な利点は、信頼性の高い疾患誘導を可能にすることです。臨床疾患が100%未満になることはめったにありません。

疾患や感受性マウス株を誘導するためのプロトコルを調整することができますが、さらに重要なことは、このプロトコルを使用して、以前は病気に抵抗性があると考えられていた多くのマウス系統でEAEを誘導できることです。手順のデモンストレーション。今日は主任研究員のcha chingです。

MBPの1ミリリットルあたり2ミリグラムの溶液を準備することから始めます。PBSで。ルアーロック付きのすりガラス製シリンジを使用して、免疫するマウス1匹につき100マイクロリットルの抗原溶液を吸引します。

別の注射器を使用して、同量の完全なフロイトのアジュバントH 37 raを収集します。次に、三方活栓で2つの注射器を接続し、プランジャーを前後に押して、エマルジョンが形成されるまで抗原とアジュバントを混合します。これを確認するには、溶液をシリンジの1つに移し、空のシリンジを外します。

空のシリンジを少し後ろに引いてから、残留混合物を室温できれいな水のビーカーに一滴排出します。液滴が分散した場合は、シリンジを再度接続して混合を続けます。液滴が無傷のままで、エマルジョンを集めるためにエマルジョンが形成されている場合は、テストを繰り返します。

予防接種用。プラスチック製の1ミリリットルの注射器を、プランジャーを取り外したガラス注射器に接続します。溶液をプラスチックシリンジに慎重に移し、縁まで満たします。

次に、プラスチック製のプランジャーを挿入し、エマルジョンを排出して、ちょうど1.2ミリリットルが残るようにします。シリンジに気泡が溜まってはいけません。この手順が正しく実行されている場合。

プラスチック製のシリンジを外します。26ゲージの針で取り付け、プランジャーを1ミリリットルのマーキングに押し込んで針の空隙量を埋めます。マウスをしっかりと首筋にし、薬指と小指の間に尾を戻して、胸部と腹部に簡単にアクセスできるようにします。皮下。

右脇の下の真上の胸部に50マイクロリットルのエマルジョンを注入します。注入が正しく行われると、注入部位に小さな白い膨らみが見えます。左脇の下の上で手順を繰り返してから、尻尾を離して右足をつかみ、マウスの右側面を露出させます。

胸郭のすぐ下に50マイクロリットルの溶液を注入します。右足を離します。マウスを逆に回して、左側でインジェクションを繰り返します。

予防接種後7〜10日。安楽死させた動物からリンパ節を採取します。まず、マウスを仰向けに置き、手足を伸ばして解剖ボードにピンで固定します。

マウスにエタノールをスプレーします。次に、滅菌ツールを使用します。マウスの皮膚の下腹部からあごまで縦方向の切開部を切開します。

腹部から片方の足の下に別の切開を行います。次に、もう一方を下ります。マウスの皮膚をはがし、解剖ボードに固定します。

また、四肢に沿って皮膚をカットします。次に、皮膚フラップの上部を剥がして両側にピンで固定すると、通常は鼠径部または脇の下に近い鼠径リンパ節と腋窩リンパ節が、皮膚の真下に小さな不透明な塊として見えるはずです。2つの細い鉗子を使用して、最初のリンパ節の上の結合組織を静かに取り除きます。

その過程で血管を壊さないように注意してください。結合組織がきれいになったら、1対の鉗子をリンパ節の下に置き、体から引き離します。リンパ節を滅菌PBSを含む35ミリメートルのペトリ皿に移し、他の3つのリンパ節を同じ方法で採取します。

すべてのリンパ節が採取されたら、ペトリ皿をバイオセーフティフードに移します。滅菌シリンジプランジャーの背面を使用。リンパ節を均質化して細胞を放出し、破片を取り除き、ナイロンメッシュを介して懸濁液を濾過して円錐形のチューブに入れます。

次に、滅菌PBSで容量を50ミリリットルに調整し、細胞を10分間遠心分離します。遠心分離後、細胞を少量の温熱細胞培養培地に再懸濁し、生細胞をカウントします。濃度を1ミリリットルあたり6セルの10の4倍に調整します。

次に、細胞をウェルあたり2ミリリットルで24ウェルプレートに播種します。MVP抗原を各ウェルに添加して、最終濃度が100マイクログラム/ミリリットルになるようにします。抗原が追加されたら。

細胞を摂氏37度で5日間インキュベートします。細胞が再刺激されたら、ピペッティングで静かに上下させて回収し、50ミリリットルの円錐管に移します。細胞を1000 RPMで10分間遠心分離し、ペレットを少量の滅菌PBSに再懸濁します。

次に、細胞をカウントし、生細胞濃度をPBSで1ミリリットルあたり8番目の細胞の10倍の2.5倍に調整します。細胞をシリンジに引き込み、26ゲージの針で取り付けて養子縁組移管を行います。各マウスの尾部に0.2ミリリットルの細胞を静脈内注射して、養子縁組後数週間まで耐性マウスに挑戦します。

ドナーマウスの免疫化を行ったのと同じ方法で、200マイクロリットルのエマルジョン容量に200マイクログラムの抗原を動物に注入します。チャレンジから7〜10日後には、麻痺性疾患が発症し、その進行を監視することができます。病気は尾の脱力から始まります。

尾がたるんでいる場合、病気は等級付けされ、1つの病気が等級付けされます。2つ目は、マウスが片方の後肢に麻痺を発症した場合、3つ目は、両方の後肢が麻痺した場合です。グレード4は、両前肢が麻痺している場合です。

グレード5、マウスはより豊富です。そして6年生、ネズミは死んでいます。ここに示すように、チャレンジの7〜14日後に、マウスは単相性麻痺性疾患を発症しますが、これは古典的なEAE基準を使用して等級付けできます。

マウスは回復する可能性がありますが、自然に再発することはありません。疾患の誘発には、抗原特異的なチャレンジが必要です。CFAのみ、または無関係な抗原によるチャレンジは、病気を引き起こすことができません。

このビデオを見た後、EAEを誘発するための養子縁組とチャレンジの方法についてよく理解しているはずです。抗原特異的リンパ節細胞の適応的導入と抗原性チャレンジの増強を組み合わせることで、あらゆるマウス系統でEAEを容易に誘導することができます。この方法により、一部のマウス系統に固有の耐性メカニズムを克服できるため、耐病性の研究が可能になります。また。

この手法は、あらゆる自己免疫疾患のプロセスを研究するために簡単に適応できるはずです。