移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する

本手順の全体的な目的は、EAE誘導への耐性があるとされる系統を含むあらゆるマウス系統において、一貫して容易にEAEを誘導することです。これは、まずドナーマウスに、完全フロイントアジュバントで乳化させたミエリン特異的タンパク質またはペプチド抗原を免疫させることで達成されます。10日後、ドナーマウスからリンパ節を分離し、得られたリンパ節細胞を同一の抗原とともに4～5日間培養することで、in vitroで再刺激します。

次に、これらの細胞をナイーブなレシピエントマウスに養子移入します。感受性マウス系統では8〜14日でEAEを発症しますが、耐性系統でEAEを誘発させる場合もあります。養子移入の14日後、レシピエントマウスにCFA中の抗原を免疫しました。

この方法を用いることで、耐性を持つマウス系統においてもEAEを誘導することが可能です。EAE誘導における養法的転移およびチャレンジプロトコルの主な利点は、疾患を確実に誘導できる点にあります。臨床的な発症率が100%を下回ることは極めて稀です。

このプロトコルは、疾患の誘導や感受性マウス系統に合わせて調整可能ですが、より重要なのは、これまで疾患に耐性があると考えられていた多くのマウス系統においてEAEを誘導できる点です。手順を実演します。本日の担当は、リード・リサーチ・アソシエイトのCha Chingです。

まず、PBSを用いて2 mg/mLのMBP溶液を調製します。ルアーロック付のすり合わせガラス製シリンジを使用し、免疫させるマウス1匹あたり100 µLの抗原溶液を吸い上げます。

別のシリンジを用いて、同量の完全フロイントアジュバント H 37 ra を採取します。次に、三方活栓で2本のシリンジを接続し、プランジャーを前後に繰り返し動かして、乳化するまで抗原とアジュバントを混合します。乳化が完了していることを確認するため、溶液を一方のシリンジに移し、空になったシリンジを取り外します。

空のシリンジのプランジャーをわずかに引き戻し、残った混合液を室温の清潔な水が入ったビーカーに一滴滴下します。滴が分散する場合は、シリンジを再接続し、混合を続けます。滴がそのまま残り、エマルションが形成されている場合は、エマルションを回収するためにこのテストを繰り返します。

免疫に使用します。プランジャーを外したガラス製シリンジに、プラスチック製の1 mLシリンジを接続します。溶液を慎重にプラスチック製シリンジに移し、縁まで満たします。

次に、プラスチックプランジャーを挿入し、エマルションを一部排出し、正確に1.2 millilitersが残るようにします。シリンジ内に気泡が混入していないことを確認してください。この手順が正しく行われた場合。

プラスチック製シリンジを取り外します。26ゲージの針を装着し、プランジャーを1 mLの目盛りまで押し込んで、針の死腔を充填します。マウスをしっかりと固定し、胸部と腹部に容易にアクセスできるよう、薬指と小指で尾を後ろに保持します。皮下に投与します。

エマルション50 µLを、右脇の下のすぐ上の胸部に注入します。正しく注入されていれば、注入部位に小さな白い膨らみが見えます。左脇の下でも同様の手順を繰り返し、その後、尾を離して右足を掴み、マウスの右側腹部を露出させます。

溶液50 µLを肋骨の直下に注入します。右足を離します。マウスを反対側に向け、左側にも同様に注入します。

免疫から7〜10日後、安楽死させた動物からリンパ節を採取します。まず、マウスを仰向けにし、四肢を伸ばしてピンで解剖台に固定します。

マウスにエタノールをスプレーします。次に、滅菌済み器具を用いて、下腹部から顎にかけてマウスの皮膚を縦に切開します。

腹部から片脚に向かって、もう一度切開します。次に、もう一方の脚も同様に切開します。マウスの皮膚を剥ぎ取り、解剖板にピンで固定します。

また、4本の肢に沿って皮膚を切開します。次に、皮膚フラップの上部を剥がし、両側をピンで固定します。通常、鼠径部または腋窩の近くにある鼠径リンパ節および腋窩リンパ節が、皮膚の直下に小さな不透明な塊として見えるはずです。2本の精細鑷子を用いて、最初のリンパ節の上にある結合組織を慎重に除去します。

その際、血管を損傷しないように注意します。結合組織を除去した後、鉗子を1組リンパ節の下に差し込み、体から引き離します。リンパ節を滅菌PBSが入った35 millimeterのペトリ皿に移し、残りの3つのリンパ節も同様の方法で採取します。

すべてのリンパ節を回収した後、ペトリ皿をバイオセーフティフードに移します。滅菌済み注射器のプランジャーの背面を使用して、リンパ節を均質化して細胞を遊離させ、デブリを除去するため、懸濁液をナイロンメッシュでろ過してコニカルチューブに回収します。

その後、滅菌済みのPBSで液量を50 millilitersに調整し、細胞を10分間遠心分離します。遠心分離後、あらかじめ温めておいた少量の細胞培養培地で細胞を再懸濁し、生存細胞数をカウントします。細胞濃度を4 × 10⁶ cells/milliliterに調整します。

次に、24ウェルプレートに細胞を1ウェルあたり2 mLずつ播種します。各ウェルにMVP抗原を加え、最終濃度が100 µg/mLとなるようにします。抗原の添加が完了したら。

細胞を37°Cで5日間インキュベートします。細胞を再刺激した後、緩やかにピペッティングして回収し、50 mLコニカルチューブに移します。細胞を1000 RPMで10分間遠心分離し、ペレットを少量の滅菌PBSで再懸濁します。

次に、細胞数をカウントし、PBSを用いて生存細胞濃度を2.5 × 10⁸ cells/mLに調整します。細胞をシリンジで吸い上げ、26Gの針を装着して養子移入を行います。各マウスの尾静脈に細胞を0.2 mL静脈注射し、養子移入の2週間後に耐性マウスへのチャレンジを行います。

ドナーマウスの免疫と同様の方法で、200 µLのエマルションに溶解した200 µgの抗原を動物に注射します。チャレンジから7〜10日後に麻痺性疾患が発症し、その進行をモニタリングすることができます。疾患は尾の脱力から始まります。

尾が弛緩している場合はグレード1、マウスの後肢片側に麻痺が生じた場合はグレード2、両側の後肢が麻痺した場合はグレード3と判定します。両側の前肢まで麻痺が及んだ場合はグレード4となります。

グレード5では、マウスの症状がより顕著になります。そしてグレード6では、マウスが死亡します。ここで示されているように、チャレンジから7～14日後に、マウスに単相性麻痺性疾患が発症し、これは古典的なEAE基準を用いてグレード分けすることができます。

マウスは回復する可能性がありますが、自然に再発することはありません。疾患を誘発するには、抗原特異的な刺激が必要です。CFAのみによる刺激や、無関係な抗原による刺激では、疾患は誘発されません。

このビデオを視聴することで、EAEを誘導するための養道的移入およびチャレンジ法の詳細について理解を深めることができます。抗原特異的なリンパ節細胞の養道的移入と、ブースト用の抗原チャレンジを組み合わせることで、あらゆるマウス系統において容易にEAEを誘導することが可能です。この手法により、一部のマウス系統に固有の抵抗性メカニズムを克服できるため、疾患抵抗性の研究が可能となります。

この手法は、あらゆる自己免疫疾患のプロセスを研究するために容易に応用できるはずです。