Name: 移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぶ、EAE抵抗性マウス系統で実験的自己免疫性脳脊髄炎を誘導する方法。リンパ節細胞の移入と抗原チャレンジにより、多発性硬化症のモデルにおける自己免疫応答のメカニズムを研究できます。

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国立衛生研究所からの助成金（R01 NS37253とN01 NS055167）と全国多発性硬化症協会（RG 3288-A6）によって部分的にサポートされています。

1。 CFA乳化抗原を準備する<ol><li> 2 mg / mLの濃度でリン酸緩衝液（PBS）でモルモットMBP（Swanborg1の方法に従って調製し、4℃で凍結乾燥された形式で格納°C）を溶解する。合成されたMBPペプチド（MBP 60から80、SHHAARTTHYGSLPQKSQR 2）が使用されている場合は 、2 mg / mLの溶液を調製。ルアーロック付きガラスシリンジに抗原溶液（マウス1匹あたり0.1mlを免疫するために）適切な量を描画します。 </li><li>ルアーロックを備えた別のガラスシリンジに抗原溶液に等しい完全フロイントアジュバントH37Ra（0.1重量％）（CFA、ディフコ）の音量を上げて描画します。 </li><li>三方活栓を持つ2つのガラスシリンジを接続します。前後にプランジャーを押すことにより、CFAのMBPソリューションを混在させること。エマルジョンが形成されるまで運動を続ける。 </li><li>エマルジョンが形成されるかどうかをテストするには、1つの注射器に混合物のすべてを押してください。空のシリンジを外し、tを引く彼が戻って少しプランジャと、室温で清潔な水のビーカーに残留エマルションの液滴を除去してください。エマルジョン滴の水の表面にそのまま残っている場合は、エマルジョンが形成される。エマルジョン滴分散する場合は、シリンジを接続し直して、混合の動きを続けています。 </li><li>抗原の正確な用量の配信を保証するために予防接種プロセスのために1 mLのプラスチック製の注射器を使用しています。プラスチックシリンジに抗原エマルジョンを転送するには、プランジャーを引き出して、前のガラスシリンジは1.4のように切断された三方活栓の開口部に、空のプラスチック製の注射器を挿入します。 </li><li>ガラスシリンジのプランジャーを押すことにより、リムにプラスチックシリンジを記入してください。背面のプラスチックシリンジのプランジャーを挿入し、プラスチックシリンジで1.2 mlのマークに到達するまで戻って過剰なエマルジョンを押してください。この操作は気泡をプラスチックシリンジ内に閉じ込められていないことを保証します。 </li><li>三方活栓からプラスチック製シリンジを取り外します。アッタ＃26ゲージの針CHプラスチックシリンジへ。エマルジョンは今針の空隙容積を埋めるように、1 mLの標線までプランジャーを押してください。 </li></ol> 2。ドナーマウスの予防接種注：雌C57BL / 6マウスは、通常、当初は国立衛生研究所のMcFarlinのグループ3で設計された方法に従って、側面の4つのサイト内の抗原エマルジ ​​ョンを注入されています。経験豊かな研究者のために、一人は、全体のタスクを実行することができます。初心者のための、ヘルプが一人は、マウスを保持し、他の人が注射を行うよう要請することができます。また、マウスは注射用の麻酔をすることができます。 <ol><li>首の皮でしっかりとマウスを保持し、胸部と腹部が容易にアクセス可能であることを、例えば4 番目と5 番目の指の間に尾を抑える。 </li><li> （MOの少し右の脇の下上胸部のサイトで1mLのプラスチック注射器の針を置く使用）と抗原エマルジョン0.05 mLを皮下に注入します。白っぽいCFAの小さな膨らみが薄い皮膚を通して見ることができます。わずかに左脇の下上胸部のサイトに対しても同じことを繰り返します。 </li><li>尾を解放し、右足（マウスの）を手に取り、それを回すと4 番目と5 番目の指の間それを保持します。右脇腹のちょうど肋骨の場合、以下のサイトを見つけて、抗原エマルジョンを0.05 mLを注入します。 </li><li> 、右足を離してマウスを他の方法にして、4 番目と5 番目の指の間に左足を（マウスの）を押し続けます。左脇腹のちょうど肋骨の場合、以下のサイトを見つけて、抗原エマルジョンを0.05 mLを注入します。 </li><li> 10匹のマウスの注射後に新鮮な針に変更するか、針が鈍くなった場合。 </li></ol> 3。 7〜10日予防接種後の組織培養のためのリンパ節細胞の分離<ol><li> 7〜10日間の免疫後、マウスを犠牲にと所属リンパ節を削除します。安楽死の好ましい方法は、CO 2吸入によるものである。犠牲にした後、ピンと伸ばして、ボードに固定された手足の解剖ボードに背の上にマウスを置く。マウスは70％エタノールのスプレーで湿らされています。 </li><li>まで滅菌ハサミとピンセットで顎に腹部の下端から中央に長手方向に皮膚にスリットをカットします。 </li><li>各脚の下に鼠径部の領域から腹部の皮膚を切り取ります。戻って皮をむき、鼠径部リンパ節を公開し、皮膚を突き止める。 </li><li>皮膚が剥がれると脇の下の近くに腋窩リンパ節を公開するために釘付けにすることができるように前肢（左と右）に沿って皮膚を切り取ります。 </li><li>一緒に仕事を鉗子の2ペアで、カバーすると鼠径部リンパ節周囲結合組織を引き離します。結合組織がクリアされると、リンパ節の下に鉗子のペアを1つ配置し、本体から引き離します。配置滅菌PBSを充填した35ミリメートルのペトリ皿のリンパ節。 </li><li>鉗子の2ペアを使用して、2つの腋窩リンパ節を覆う結合組織を引き離します。リンパ節を分離し、ペトリ皿に置きます。出血が非常に困難なリンパ節を識別できますように領域を横断する血管を壊さないように十分注意してください。 </li><li>すべてのリンパ節が収集された後、バイオセーフティフードにペトリ皿を移動します。他のに対して1を粉砕し、鉗子の2ペアでリンパ節を分割し、いじめる。また、リンパ節は、ペトリ皿の底のリンパ節を押圧する3 mLのプラスチックシリンジのプランジャの平らな端を使用して分割することができます。 </li><li>膜や破片を除去するためにナイロンメッシュを介してからかったリンパ節細胞懸濁液を渡します。 </li><li>滅菌したPBSを使用して50mLにリンパ節細胞懸濁液を作る。 10分間1000rpmで遠心します。培養液中にペレットを再懸濁します。実行可​​能なCを行うエルは4×10 6細胞/ mLの濃度をカウントし、調整します。 UseRPMI 1640 10％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、1mM MEMピルビン酸ナトリウム、0.1 mMのMEM非必須アミノ酸、100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、10mMのHepes緩衝液、5×を添加した10 -5 M 2-ME。細胞を再懸濁する前に、事前に暖かい文化。 </li><li>ウェルあたり2mLのボリュームで24ウェル培養プレート（最終細胞濃度8×10 6細胞/ウェル）で細胞を培養。は100μg/ mLの最終濃度で各ウェルに抗原を追加します。 5％CO 2で37℃のインキュベーター内で培養プレートを配置します。 5日間細胞をインキュベートします。 </li></ol> 4。 5日培養開始後、培養したリンパ節細胞を採取する<ol><li>パスツールピペット、ガラスまたは少量をピペットでピペッティングすることにより、各ウェル中に細胞を混ぜます。 50 mLの遠心チューブに細胞を回収。 </li><li> 10分間1000rpmで遠心します。 ResusPBSの小さなボリュームに細胞ペレットを保留する。 </li><li>細胞をカウントし、滅菌PBSで2.5×10 8細胞/ mLに生存細胞濃度を調整します。 ＃26ゲージの針を備えたシリンジにセルを描画します。 </li><li>尾静脈を拡張するためのレシピエントマウスのケージの上にヒートランプを配置します。 </li><li>マウスホルダーを使用して、ホルダーのスリットを介してマウスの尾を拡張します。尻尾を拡張するために引き出します。静脈の位置を確認します。 </li><li> 5×10 7細胞に等しい、細胞懸濁液0.2 mLの/マウスを注入します。 </li></ol> 5。レシピエントマウスの抗原チャレンジ20日後に細胞の移動と病気の症状の開発<ol><li>抗原と病気の兆しを見せていないレシピエントマウスに挑戦しています。手順は、 &quot;ドナーマウスの免疫化&quot;のセクション2と同じです。 </li><li> 7〜10日、抗原チャレンジ後の麻痺性疾患の発症を観察します。 <ol><li>この病気は尾の弱点で始まります。病気は1として評価されている尾は弛緩になったとき。この疾患は、マウスが1つの後肢に麻痺している2として評価されている。両後肢が麻痺し、前方のクロール時にマウスが両方の後肢をドラッグしているとき病気は3等級されています。マウスマウスが全く動かないまま、両方の前肢の使用を失ったときに病気が4等級されています。マウスが瀕死であると体が丸くなったときに病気が5等級されています。死は、悪性度疾患6 4として採点しています。 </li></ol></li><li>このプロトコルは以下のC57BL / 6マウスに誘導されるMBP特異的EAEは相性です。マウスは、病気から回復するかもしれませんが、自発的再発を起こさない。 </li></ol> 6。代表的な結果下塗りとin vitroで展開されたドナーのリンパ節細胞に投与したマウスは、疾患の誘導への抵抗を反映して、EAEの疾患の症状を開発していませんでした。しかし、重篤な疾患は抗原チャレンジの能力を実証し、抗原チャレンジ（ 表I）の後に開発耐性機構を逆転させるインチ抗原チャレンジの2つの特殊な機能は、抗原の投与量と病気を誘発することが課題の動態についても説明します。 表IIIに示すように、抗原の非常に低用量が必要となります。抗原（ 表IV）でチャレンジしたときに驚くべきことに、前年ドナー細胞を投与したマウスは依然として深刻な疾患を発症する可能性があります。これら二つの観測が強くEAE抵抗を維持するために &quot;長命の&quot; T細胞の関与を示唆している。このプロトコルは、多くのEAE耐性マウス系統4に適用されます。 <img alt="図1。" src="/files/ftp_upload/3778/3778fig1.jpg" /> 有名な耐性のマウス系統におけるEAEの誘導のための実験デザインの図1のフローチャート。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> 臨床EAE 移入後の </td><td colspan="3"><stroNG&gt;臨床EAE 抗原チャレンジ後</td></tr><tr><td> 歪み </td><td> 抗原 </td><td> 発生率 </td><td> AV。病気のグレード （範囲） </td><td> AV。発症日 （範囲） </td><td> 発生率 </td><td> AV。病気のグレード （範囲） </td><td> AV。発症日 （範囲） </td></tr><tr><td> SJL </td><td> MBP </td><td> 21分の21 </td><td> 4.0（3-5） </td><td> 8.0（6-10） </td><td> ND </td><td> ND </td><td> ND </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP </td><td> 0/10 </td><td> - </td><td> - </td><td> 7月7日</td><td> 3.85（3-5） </td><td> 9.28（9-10） </td></tr><tr><td> BALB / c系</td><td> MBP </td><td> 0/7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 5月5日</td><td> 3.2（3-4） </td><td> 7.0（7） </td></tr><tr><td>のC3H/HeJ </td&gt; <td> MBP </td><td> 0/7 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4月4日</td><td> 3.2（3-4） </td><td> 8.0（8） </td></tr><tr><td> C57BL / 6 </td><td> MBP 60から80 </td><td> 0/4 </td><td> - </td><td> - </td><td> 4月4日</td><td> 2.75（2-4） </td><td> 10.2（9-11） </td></tr></tbody></table> 表I。C57BL / 6マウスではMBP-媒介EAEの誘導。下塗りとin vitroで展開されたドナー細胞はC57BL / 6マウスではEAEを誘導しなかったでの養子免疫伝達。抗原チャレンジ後のセルの転送は、疾患の誘導に影響を受けやすいマウスをレンダリングされます。 AV、平均。 ND、行われません。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> 抗原チャレンジ後の臨床EAE </td></tr><tr><td> プライミング抗原 </td><td> チャレンジ抗原 </td><td> 発生率 </td><td> AV。病気のグレード （範囲）</td><td> AV。発症日 （範囲） </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> CFA単独で</td><td> 0/3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> OVA-CFA </td><td> 0/3 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> MBP-CFA </td><td> 3月3日</td><td> 4.0（4.0） </td><td> 7.7（7-9） </td></tr></tbody></table>抗原チャレンジの表II。特異性。レシピエントマウスは、プライミング抗原だけでなく、他の無関係の抗原とチャレンジした。のみプライミング抗原は、重篤な疾患を誘発した。 OVA：ニワトリ卵白アルブミン。 AV、平均。 <table border="1"><tbody&gt; <tr><td></td><td></td><td colspan="3"> 抗原チャレンジ後の臨床EAE </td></tr><tr><td> チャレンジ抗原用量（μg/マウス） </td><td> 発生率 </td><td> AV。病気のグレード （範囲） </td><td> AV。発症日 （範囲） </td></tr><tr><td> 200 </td><td> 4月4日</td><td> 3.75（3-4） </td><td> 8.25（7-9） </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 4月4日</td><td> 3.67（3-4） </td><td> 7.5（7-8） </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 4月4日</td><td> 3.25（3-4） </td><td> 8.25（7-10） </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 4月4日</td><td> 3.0（3.0） </td><td> 8.25（8-9） </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 4月4日</td><td> 3.0（3.0） </td><td> 8.76（8-9） </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 4月4日</td><td> 2.5（2-3） </td><td> 9.75（9-10） </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2月4日</td><td> 1.0（1.0） </td><td&gt; 16（14-18） </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 0/4 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> 表III。チャレンジ抗原の用量は、疾患の誘導に必要です。レシピエントマウスに挑戦するために使用されるMBPの種々の濃度を試験した。 AV、平均。 <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="3"> 抗原チャレンジ後の臨床EAE </td></tr><tr><td> チャレンジ抗原 </td><td> チャレンジの日 </td><td> 発生率 </td><td> AV。病気のグレード （範囲） </td><td> AV。発症日 （範囲） </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 5 </td><td> 3月4日</td><td> 1.33（1-2） </td><td> 9.67（9-10） </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 10 </TD&gt; <td> 4月4日</td><td> 3.0（3.0） </td><td> 8.25（7-9） </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 15 </td><td> 4月4日</td><td> 3.75（3-4） </td><td> 7.25（7-8） </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 25 </td><td> 4月4日</td><td> 4.0（4.0） </td><td> 8.0（7-9） </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 35 </td><td> 4月4日</td><td> 3.5（3-4） </td><td> 7.5（7-8） </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 60 </td><td> 4月4日</td><td> 3.75（3-4） </td><td> 9.0（8-10） </td></tr><tr><td colspan="5"> -------------------------- </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 343 </td><td> 3月3日</td><td> 3.0（3.0） </td><td> 10.33（10-11） </td></tr><tr><td> MBP-CFA </td><td> 445 </td><td> 3月3日</td><td> 3.0（3.0） </td><td> 7.0（7.0） </td></tr></tbody></table> 表IV。抗原チャレンジの動力学。レシピエントマウスを採用する様々な時点ポストにチャレンジしたIVEセル転送。 AV、平均。

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</ol>

ない財務情報開示。

マウスではEAEの研究は、しばしばneuroantigens、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、プロテオリピドタンパク質（PLP）またはミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質（MOG）を利用しています。以前の研究では、主にMBPを使用していました。 PLPは、SJLマウスから強い、一貫した応答を刺激する。最近では、MOGはB6マウスではこの抗原と疾患の誘導の影響を受けやすいので、使用される一般的な神経抗原である。遺伝子標的マウス系統の多くは、B6遺伝的背景にあります。興味深いことに、B6マウスはMOGで誘導をEAEに感受性であるが、MBPと病気の誘発に耐性がある。 多くの疾患の誘導機構、サイトカイン産生および5-7制御性T細胞により媒介される回復の効果を中心にEAEの機構解明の前の努力。 EAE耐性のマウスは、疾患の誘導を破壊するにはどうすればよい評判、一方では、広く研究されていませんでした。これは、uを定量化することの難しさが原因である可能性がありnresponsiveness。アルノン8は 1981年に最初のシクロホスファミドとB6...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>モルモット脊髄</td><td>ロックランド免疫化学薬品株式会社 ギルバーツヴィル、ペンシルバニア州19525 <a href="http://www.rockland-inc.com" target="_blank">www.rockland-inc.com</a> </td><td> GP-T065 </td><td>凍結</td></tr><tr><td>フロイントアジュバント、完全H37Ra </td><td>ディフコ デトロイト、ミシガン</td><td> 231131 </td><td></td></tr><tr><td> MULTIFIT交換可能なシリンジ</td><td> BD <a href="http://www.bd.com/us" target="_blank">www.bd.com /問い合わせ</a> </td><td> 512133 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td>メディアテック（株） マナッサス、バージニア州 <a href="http://www.cellgro.com" target="_blank">www.cellgro.com</a> </td><td> 10から040-CM </td><td></td></tr><tr><td> OVA </td><td> Sigma-Aldrich社 <a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a> </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td>マウス</td><td>ジャクソン研究所 バーハーバー、メイン州</td><td> B6マウス：0000664 </td><td></td></tr></tbody></table>

移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（eae）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する

Overcoming Unresponsiveness in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Resistant Mouse Strains by Adoptive Transfer and Antigenic Challenge

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は中枢神経系（CNS）の炎症性疾患であり、ヒト脱髄性疾患、多発性硬化症（MS）の研究のための動物モデルとして使用されています。 EAEは中枢神経系への単核細胞の病理学的浸潤と麻痺性疾患の臨床症状によって特徴付けられる。他の耐性がありながら、MSと同様に、EAEは、その特定のマウス系統の遺伝的制御下にもあり、疾患の誘導に影響を受けています。通常、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）と免疫C57BL / 6（H-2 b）のマウスは、麻痺の兆候を開発するために失敗します。この無反応は、実験的なプロトコルがここで説明したように、確かに抗原処理やMBPの抗原提示の欠陥によるものではないC57BL / 6マウスと同様に他の有名な耐性マウス系統に深刻なEAEを誘導するために使用されていた。さらに、MBPに対する反応性C57BL / 6およびBALB / cマウスから脳炎誘発性T細胞クローンは成功していた完全に分離し、伝播されます。 実験プロトコルは、（200μg/マウス）MBP-プライミングC57BL / 6ドナーリンパ節細胞が単離され、MBP特異的T細胞のプールを拡大する抗原で5日間培養した細胞の養子免疫伝達システムを使用して含まれます。培養期間の終了時に50万人の生細胞を尾静脈を通してナイーブ同系の受信者に転送されます。ので、通常処理されたレシピエントマウスは、このように、その耐性状況を再確認し、EAEを発症しない、彼らはいつまでも通常のままでかまいません。十日後にセル転送、レシピエントマウスは、完全フロイントアジュバント（CFA）乳化側面の4つのサイトではMBPでチャレンジされています。厳しいEAEは10〜14日チャレンジ後、これらのマウスでの開発を開始します。結果は、疾患の誘導は無関係の抗原が疾患の臨床徴候を誘発しなかったとの課題として、特定の抗原であることを示した。重要なのは、抗原の投与量の滴定に使用される挑戦レシピエントマウスは、5μg/マウスのように低くなることを示した。さらに、抗原チャレンジのタイミングの運動研究では、病気を誘発するその挑戦は、5日後に抗原チャレンジと445日後に抗原チャレンジを介している限り、早ければ効果的であることが判明した。これらのデータは強く無反応を維持するために &quot;長寿命の&quot; T細胞集団の関与に向かって指しています。このシステムでは制御性T細胞（Tregの）の関与が定義されていません。

特定のマウス系統では、ミエリン塩基性タンパク質で実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）の誘導に抵抗することができます。ここで説明するには、無反応を逆にし、いくつかの典型的なEAE耐性マウスの汚れに麻痺性疾患を引き起こす単純な予防接種プロトコルです。

移入、抗原チャレンジにより実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）抵抗性マウス系統の応答がないことを克服する

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、中枢神経系（CNS）の炎症性疾患であり、……の動物モデルとして利用されてきました。

本手順の全体的な目的は、EAE誘導への耐性があるとされる系統を含むあらゆるマウス系統において、一貫して容易にEAEを誘導することです。これは、まずドナーマウスに、完全フロイントアジュバントで乳化させたミエリン特異的タンパク質またはペプチド抗原を免疫させることで達成されます。10日後、ドナーマウスからリンパ節を分離し、得られたリンパ節細胞を同一の抗原とともに4～5日間培養することで、in vitroで再刺激します。次に、これらの細胞をナイーブなレシピエントマウスに養子移入します。感受性マウス系統では8〜14日でEAEを発症しますが、耐性系統でEAEを誘発させる場合もあります。養子移入の14日後、レシピエントマウスにCFA中の抗原を免疫しました。この方法を用いることで、耐性を持つマウス系統においてもEAEを誘導することが可能です。EAE誘導における養法的転移およびチャレンジプロトコルの主な利点は、疾患を確実に誘導できる点にあります。臨床的な発症率が100%を下回ることは極めて稀です。このプロトコルは、疾患の誘導や感受性マウス系統に合わせて調整可能ですが、より重要なのは、これまで疾患に耐性があると考えられていた多くのマウス系統においてEAEを誘導できる点です。手順を実演します。本日の担当は、リード・リサーチ・アソシエイトのCha Chingです。まず、PBSを用いて2 mg/mLのMBP溶液を調製します。ルアーロック付のすり合わせガラス製シリンジを使用し、免疫させるマウス1匹あたり100 µLの抗原溶液を吸い上げます。別のシリンジを用いて、同量の完全フロイントアジュバント H 37 ra を採取します。次に、三方活栓で2本のシリンジを接続し、プランジャーを前後に繰り返し動かして、乳化するまで抗原とアジュバントを混合します。乳化が完了していることを確認するため、溶液を一方のシリンジに移し、空になったシリンジを取り外します。空のシリンジのプランジャーをわずかに引き戻し、残った混合液を室温の清潔な水が入ったビーカーに一滴滴下します。滴が分散する場合は、シリンジを再接続し、混合を続けます。滴がそのまま残り、エマルションが形成されている場合は、エマルションを回収するためにこのテストを繰り返します。免疫に使用します。プランジャーを外したガラス製シリンジに、プラスチック製の1 mLシリンジを接続します。溶液を慎重にプラスチック製シリンジに移し、縁まで満たします。次に、プラスチックプランジャーを挿入し、エマルションを一部排出し、正確に1.2 millilitersが残るようにします。シリンジ内に気泡が混入していないことを確認してください。この手順が正しく行われた場合。プラスチック製シリンジを取り外します。26ゲージの針を装着し、プランジャーを1 mLの目盛りまで押し込んで、針の死腔を充填します。マウスをしっかりと固定し、胸部と腹部に容易にアクセスできるよう、薬指と小指で尾を後ろに保持します。皮下に投与します。エマルション50 µLを、右脇の下のすぐ上の胸部に注入します。正しく注入されていれば、注入部位に小さな白い膨らみが見えます。左脇の下でも同様の手順を繰り返し、その後、尾を離して右足を掴み、マウスの右側腹部を露出させます。溶液50 µLを肋骨の直下に注入します。右足を離します。マウスを反対側に向け、左側にも同様に注入します。免疫から7〜10日後、安楽死させた動物からリンパ節を採取します。まず、マウスを仰向けにし、四肢を伸ばしてピンで解剖台に固定します。マウスにエタノールをスプレーします。次に、滅菌済み器具を用いて、下腹部から顎にかけてマウスの皮膚を縦に切開します。腹部から片脚に向かって、もう一度切開します。次に、もう一方の脚も同様に切開します。マウスの皮膚を剥ぎ取り、解剖板にピンで固定します。また、4本の肢に沿って皮膚を切開します。次に、皮膚フラップの上部を剥がし、両側をピンで固定します。通常、鼠径部または腋窩の近くにある鼠径リンパ節および腋窩リンパ節が、皮膚の直下に小さな不透明な塊として見えるはずです。2本の精細鑷子を用いて、最初のリンパ節の上にある結合組織を慎重に除去します。その際、血管を損傷しないように注意します。結合組織を除去した後、鉗子を1組リンパ節の下に差し込み、体から引き離します。リンパ節を滅菌PBSが入った35 millimeterのペトリ皿に移し、残りの3つのリンパ節も同様の方法で採取します。すべてのリンパ節を回収した後、ペトリ皿をバイオセーフティフードに移します。滅菌済み注射器のプランジャーの背面を使用して、リンパ節を均質化して細胞を遊離させ、デブリを除去するため、懸濁液をナイロンメッシュでろ過してコニカルチューブに回収します。その後、滅菌済みのPBSで液量を50 millilitersに調整し、細胞を10分間遠心分離します。遠心分離後、あらかじめ温めておいた少量の細胞培養培地で細胞を再懸濁し、生存細胞数をカウントします。細胞濃度を4 × 10⁶ cells/milliliterに調整します。次に、24ウェルプレートに細胞を1ウェルあたり2 mLずつ播種します。各ウェルにMVP抗原を加え、最終濃度が100 µg/mLとなるようにします。抗原の添加が完了したら。細胞を37°Cで5日間インキュベートします。細胞を再刺激した後、緩やかにピペッティングして回収し、50 mLコニカルチューブに移します。細胞を1000 RPMで10分間遠心分離し、ペレットを少量の滅菌PBSで再懸濁します。次に、細胞数をカウントし、PBSを用いて生存細胞濃度を2.5 × 10⁸ cells/mLに調整します。細胞をシリンジで吸い上げ、26Gの針を装着して養子移入を行います。各マウスの尾静脈に細胞を0.2 mL静脈注射し、養子移入の2週間後に耐性マウスへのチャレンジを行います。ドナーマウスの免疫と同様の方法で、200 µLのエマルションに溶解した200 µgの抗原を動物に注射します。チャレンジから7〜10日後に麻痺性疾患が発症し、その進行をモニタリングすることができます。疾患は尾の脱力から始まります。尾が弛緩している場合はグレード1、マウスの後肢片側に麻痺が生じた場合はグレード2、両側の後肢が麻痺した場合はグレード3と判定します。両側の前肢まで麻痺が及んだ場合はグレード4となります。グレード5では、マウスの症状がより顕著になります。そしてグレード6では、マウスが死亡します。ここで示されているように、チャレンジから7～14日後に、マウスに単相性麻痺性疾患が発症し、これは古典的なEAE基準を用いてグレード分けすることができます。マウスは回復する可能性がありますが、自然に再発することはありません。疾患を誘発するには、抗原特異的な刺激が必要です。CFAのみによる刺激や、無関係な抗原による刺激では、疾患は誘発されません。このビデオを視聴することで、EAEを誘導するための養道的移入およびチャレンジ法の詳細について理解を深めることができます。抗原特異的なリンパ節細胞の養道的移入と、ブースト用の抗原チャレンジを組み合わせることで、あらゆるマウス系統において容易にEAEを誘導することが可能です。この手法により、一部のマウス系統に固有の抵抗性メカニズムを克服できるため、疾患抵抗性の研究が可能となります。この手法は、あらゆる自己免疫疾患のプロセスを研究するために容易に応用できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオは、マウスモデルで実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発するための抗原アジュバントエマルジョンを生成する効率的な均質化技術を示しています。このエマルジョンは、水相に自己抗原であるミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG)を含み、不活化病原菌を含む連続的な油相に囲まれています。エマルジョンは、抗原の持続的な放出を確保し、免疫応答を持続させます。...

自己免疫性脳脊髄炎を誘発するための抗原アジュバントエマルジョンの調製

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マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

このビデオは、ミエリン由来のペプチドにアジュバントを注入して自己反応性T細胞を活性化し、脳に移動することにより、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘発する方法を示しています。百日咳毒素は、血液脳関門の透過性を高めるために投与され、これらのT細胞や他の免疫細胞が脳に入ることを可能にします。これらの免疫細胞は脱髄を引き起こし、神経伝達の障害とEAEの発症につながります。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の生成

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を使用して多発性硬化症のマウスモデルを確立しています。マウスにニューロンペプチドとアジュバントを含むエマルジョンを注入すると、自己反応性T細胞を活性化する免疫応答が引き起こされます。これに続いて、百日咳毒素(PTX)を注射して血液脳関門の透過性を高め、自己反応性T細胞が脳に浸潤できるようにします。この浸潤は、最終的にミエリン損傷をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し、多発性硬化症の脱髄状態を模倣しています。...

実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）は、多発性硬化症の確立された動物モデルである。 C57BL / 6マウスは、中枢神経系における自己反応性免疫細胞によって引き起こさ昇順弛緩性麻痺をもたらす、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG）ペプチド35-55（MOG 35-55）で免疫する。疾患の誘導およびモニタリングのためのプロトコルを説明する。...

ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（MOG<sub&gt; 35〜55</sub&gt;）C57BL / 6マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）誘発

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生体内で実験的自己免疫性脳脊髄炎時単位の内皮細胞およびグリアの障壁の障害の可視化

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