Name: プライマリーヒト線維芽細胞の導出のために皮膚パンチ生検植文化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 学ぶヒト皮膚パンチ生検からの線維芽細胞導出培養法。ゼラチンコート培地で組織を培養し、4〜8週間で1,500〜2,000万個の低世代細胞を確立・保存する確実な技術です。

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このプロトコルの開発は再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM、TR1-01246）とパーキンソンアライアンスによって資金を供給された。

標準手順3（ 例えば 4ミリメートルラウンドVisipunch器で得られた）を使用して得皮膚パンチ生検は、氷の上で完全DMEM 20％FBS培地で保たれるべきである。いったんサンプルは実験室に到着した、できるだけ早く生検を処理する。 1。皮膚パンチ生検の準備 STEPS 1.1から1.3には、バイオセーフティキャビネット内で実行されるべきである <ol><li>予め調製：6ウェルプレートの各ウェルに0.1％ゼラチンを1 mlを加える。 30-60分間脇にプレートを設定します。ゼラチン溶液を吸引除去し、各ウェルに完全DMEM/20％FBS培地800μlのを追加します。ウェルの表面全体がメディアで覆われていることを確認してください。 </li><li>滅菌10センチ組織培養皿の蓋を反転し、蓋の中央にDMEM / 20％FBS培地1.5mlのを追加し、血清ピペットの先端とメディアドロップを広げる。 </li><li>滅菌ピンセットを使用して、場所T彼は皮膚皿にメディアで作品を生検。 </li></ol> 2。皮膚パンチ生検の解剖 STEPS 9 2.1から2.2、水平層流フード内で実行されるべきである <ol><li>反転した蓋の上に10センチ皿の底の部分を置き、層流フード内解剖顕微鏡に皮膚生検を転送します。 </li><li>場所で生検を保持するために、1メスを使用し、一つの方向に転動でカットすることが第二のメス等分にピースをカットして、シャープなエッジを持つ12-15均等なサイズの部分に4ミリラウンド皮膚生検を解剖。不規則なエッジを持つ個貧しいアタッチメント/細胞伸長に貢献しています。 </li></ol> 3。組織培養プレートに解剖皮膚生検個の譲渡 STEPSは、3.1から3.6バイオセーフティキャビネット内で実行されるべきである <ol><li> 10センチ組織培養皿の底部を配置する反転蓋の上に、とバイオセーフティキャビネットにに戻っ皿を移す。 </li><li>ドライウェルに800μlのではなく、を含む調製された6ウェルプレートの各ウェルに尖った鉗子、場所2-3生検部分を使用して。井戸の底に付着する部分を取得するにはタップまたはスライドモーションを使用してください。メスは、鉗子からの生の部分を除去するのに有用である。 </li><li> 37℃のインキュベーター内で6ウェルプレートを置きます。メディアコーティングのフィルムは最初の週のために井戸の底があることを確認するために、毎日監視し、任意の蒸発メディアを交換するには2日ごとに〜200μLを加える。 </li><li> 1週間後、2〜3日ごとに完全なDMEM/20％FBS 2mlのにメディアの量を増加させ、メディアを変更してください。 </li><li>一度線維芽細胞は線維芽細胞が2X T75フラスコ（継代1）に入っても、トリプシン処理及び通路6ウェルプレートの縁に達している点に、各ウェルに合流されています。組織片も同様に転送することができる。彼らは、Oを添付せず、洗浄することが次のメディア変更時UT。 </li><li>一度線維芽細胞がコンフルエントあり、バイアルあたり1×10 6細胞/ mlで完全DMEM培地プラス10％のDMSOで凍結、3X T175フラスコ（通路2）に転送します。 </li></ol> 4。免疫染色を通してキャラ線維芽細胞を<ol><li> 8ウェルチャンバースライドでの培養線維芽細胞は、ゼラチンでコーティング。 </li><li>細胞が80％コンフルエントにあるとき、各ウェルから培地を吸引。 </li><li>室温で10分間4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定する。 </li><li> 1X PBSでウェルを3回洗浄します。 </li><li> 0.3％150μlのトリトンX-100、室温で5分間（PBS中）で細胞を透過性。 </li><li> 1X PBSでウェルを3回洗浄します。 </li><li>室温で1時間、200μlのブロッキング溶液（PBS + 5％正常ヤギ血清（ベクター、S-1000））を加える。 </li><li>ブロッキング溶液でアンチSERPHIN-1（抗ウサギ、MAB、シグマ、S5950-200μL）の1:250希釈を準備します。 </li><li> Aブロッキング溶液をspirate、とAntiSERPINH-1の1:250希釈150μlのを追加します。室温で1〜2時間でインキュベートする、または4℃で一晩。 </li><li> 1X PBSでウェルを3回洗浄します。 </li><li>ブロッキング溶液で1:200ヤギ抗ウサギモノクローナル抗体（Alexaの弗素ヤギ抗ウサギIgG（H + L）、Invitrogen社、A11008）を準備する。 </li><li>各ウェルに1:200ヤギ抗ウサギモノクローナル抗体150μlのを追加します。室温で1時間、暗所で、インキュベートする。 </li><li> 1xPBSで一回井戸を洗浄します。 </li><li> PBSを吸引し、慎重にだけスライドを明らかにするためにチャンバーを持ち上げ。 </li><li> DAPI（ベクター、H-1200）を含む培地を取り付ける2-3滴でスライドをマウントします。 </li><li>蛍光顕微鏡下でスライドを分析します。 </li></ol>

<ol><li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li>
<li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson%27s+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li>
<li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((biopsy+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Fam.+Physician%22%5BJournal%5D)">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li>
<li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1(2001).</li>
<li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin+embedded+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cutan.+Pathol%22%5BJournal%5D)">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルを使用して、皮膚線維芽細胞の比較的純粋な培養物を得ることができる。線維芽細胞は楕円形の細胞核へのラウンド細長い紡錘状細胞体の特徴的な形態学的特徴を持っており、線維芽細胞が整列し、バンドル時合流で育つ。他の細胞集団などのケラチノサイトが追加料金と成長因子を必要とするか、有糸分裂活性が低いのに対し、メディアは線維芽細胞の成長をサポートしています、これは比較的純粋な線維芽細胞培養を可能にします。 線維芽細胞は、その後、1:5比1:3でトリプシンで継代する。文化は4-8週間以内に、線維芽細胞の所望の量（15〜20万円）に展開されます。 この技法を使用して、我々の研究室では、正常線維芽細胞70回線で派生しています。私たちは、マイコプラズマ汚染のために、すべての行をテストし、他の細菌汚染を避けるために、増殖培地に抗生物質を追加しました。 iについてnitial植文化は我々はメディアでは20％FBS、後で10％FBSを通路には、しかし、成長をサポートしていることがわかっただけで十分です。時折、我々は、皮膚やケ...

<table><tbody><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 組織培養用ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル組織培養プレート </td><td>VWR</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス製使い捨て滅菌メス（2）、ブレード No.15、Miltex</td><td>VWR</td><td>21909-660</td><td></td></tr><tr><td>滅菌済み尖端ピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>VWR</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>2 mL セロファンピペット</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 mL セロロジカルピペット</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td></td></tr><tr><td>10 mL セロロジカルピペット</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>パストールピペット</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;提供されたソーステキストがありません。翻訳対象となる英文（jove_content）をご提示ください。&quot;&gt;&lt;強力な&gt;表A. 特定の試薬および機器の一覧&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>1X DMEM：高グルコース</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>20% ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1X L-グルタミン</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>1X MEM 非必須アミノ酸 </td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>1X ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;JoVEの手順&quot;&gt;&lt;強力な&gt;表B. 試薬。&lt;/strong&gt; &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

プライマリーヒト線維芽細胞の導出のために皮膚パンチ生検植文化

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

疾患を有する個体由来の組織および細胞株は、疾患関連細胞表現型を研究するための理想的な供給源である。このプロトコルにおける患者由来の線維芽細胞を正常にモデル疾患1に人工多能性幹細胞の誘導に用いられてきた。これらの線維芽細胞の初期の通路はまた、特定の疾患経路、機構2およびそれに続く薬剤スクリーニング手法を研究するために、細胞ベースの機能アッセイに使用することができる。酵素手続き上提示プロトコルの利点は、1）酵素処理を用いた高齢患者、パーキンソン病、2に罹患例えば患者）より挑戦的な方法論の上に技術的に簡単なアプローチから派生した組織の少量からの技術の再現性、および3ですの）時間を考慮：このプロトコルは、15〜20分かかりますし、生検到着した直後に行うことができます。酵素処理は、4時間までかかるとの問題を抱えていることができます過剰消化、細胞の生存と正しく処理されていない細胞のその後のアタッチメントの削減。このプロトコルは、4mmのヒト皮膚線維芽細胞培養物の誘導のための生検の切開及び調製を記載し、患者由来の組織サンプルを扱うときに重要である、非常に高い成功率を有している。この文化では、ケラチノサイトは、調製後最初の一週間以内に生検組​​織の外に移行します。線維芽細胞は7-10日ケラチノサイトの最初の伸長後に表示されます。 20％FBSを添加したDMEM高グルコース培地はケラチノサイトおよび線維芽細胞上の線維芽細胞の成長がケラチノサイトの過剰増殖します好む。 2継代後ケラチノサイトは線維芽細胞マーカーSERPINH1（HSP-47）を発現する、比較的均質な線維芽細胞培養の結果から希釈されています。このアプローチを使用して、15から20000000線維芽細胞は、細胞バンキングのため4-8週間のうちに誘導することができる。皮膚切開は15-20分ほどかかり、その後、細胞を一日一回監視され顕微鏡下で、メディアは2〜3日ごとに細胞の付着と伸長した後に変更されます。

ケラチノサイトは解剖後の48時間とすぐに生検片の外に成長しています。最初の線維芽細胞の伸長は、処理後1週間程度を観察することができる。井戸がコンフルエントに達した後3 150センチメートルフラスコ（T150）と細胞に到達するには、2つ以上の通路は凍結保存されているため、線維芽細胞を継代する。我々はこの方法で15から20000000までのセルを生成します。線維芽細胞は、小胞体に局在コラーゲン特異的分子シャペロンである抗SERPINH1（また、HSP-47として知られています）（ 図1）、のために陽性である。 HSP47は皮膚線維芽細胞におけるコラーゲン生合成（クロダら 、2004）において重要な役割を果たしている。 タイムライン<table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> デイ </td><td fo:width="3in"> 期待 </td></tr><tr><td> 3日目 - 第7日</td><td>ケラ...

ヒト皮膚パンチ生検からの線維芽細胞移植片培養プロトコルは、低継代数で約15〜20万人の細胞バンキングのため4-8週間以内に皮膚細胞を導出するために、技術的に堅牢かつ簡単な方法です。

疾患を持つ個体から由来する組織および細胞株は、疾患に関連する細胞表現型を研究するための理想的なソースとなります。患者由来の線維芽細胞は...

こんにちは。皮膚生検処理のビデオチュートリアルへようこそ。まず、必要な材料を組織培養フード内に配置します。フードに入れるすべての物品は、70% ethanolでスプレーして拭き上げてください。プレートにPI番号、日付、イニシャル、および培地種類を記入し、0.1% gelatinを1 mLずつ各壁面に加え、プレートを回転させて底面がgelatinでコーティングされるようにします。使用前にプレートを1時間静置します。最初のステップは、チューブからカッティングディッシュに生検試料を移すことです。カッティングディッシュとは、生検試料を解剖するために使用する10 cm Petri plateの蓋のことです。カッティングディッシュの中央に1.5 milliliterのDMEM 20%FBSを加えます。培地を中央から広げます。ここで、皮膚生検組織が確認できます。次のステップは、チューブから切断皿の中心へ生検組織を移すことです。滅菌済みピンセットを使用して、皮膚生検片を中央に配置します。この操作を行う際は、無菌状態を維持することが不可欠であるため、慎重に行ってください。カッティングディッシュに蓋をし、層流クリーンベンチ内の解剖顕微鏡へと移します。次に、生検組織を12〜18個の均等なサイズの断片に解剖します。メスを取り扱う際は十分にご注意ください。準備ができたら、生検検体を露出させます。一方のメスで生検検体を固定します。もう一方のメスを、一方向へのスライス動作で上下に動かします。生検検体を半分に切断します。12～18個の断片になるまで、さらに半分に切断し続けます。各生検片の理想的なサイズは、倒立顕微鏡の左接眼レンズのマイクロメーターの約70～80%を占める大きさです。マイクロメーターカウントの50%未満の破片は避けてください。12個から18個の破片があることを確認してください。次のステップは組織培養用クリーンベンチ内で行います。カッティングディッシュに蓋をし、組織の中に戻します。組織培養フード内で、6ウェルプレートからゼラチンを吸引し、各ウェルに700 µLのDMEM 20% FBSを加えます。培地は容器の壁面に沿って加えるのが適切な方法です。ウェルが培地の薄い膜で覆われていることを確認します。ピンセットを使用して、6ウェルプレートの各ウェルに生検片を2〜3個ずつ投入します。タッピングまたはスライディング動作を用いて、組織片を壁面の底に付着させます。鉗子に生検片が付着している場合は、メスを使用して取り除いてください。このプレート上で増殖する細胞は、継代数0（passage zero）となります。最終的なプレートの状態は、このようになります。倒立顕微鏡で観察した一部の様子がこちらです。これが1日目の皮膚生検組織です。通常、1〜3日以内に接着が確認されます。ケラチノサイトは1週間

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神経筋障害の治療法を調査するヒト線維芽細胞の筋芽細胞への直接リプログラミング

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原発性患者特異的大動脈平滑筋細胞の単離とインビトロでの半定量的リアルタイム収縮測定

筋骨格損傷に関連する創傷治癒の研究は、しばしば、シュワン細胞(SC)、ケラチノサイト、および線維芽細胞間の インビトロ 相互作用の評価を必要とする。このプロトコルは、ヒト包皮からのこれらの初代細胞の単離、培養、および特性評価を記述している。...

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この原稿では、ヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)へのエピソームリプログラミングとその後のポドサイトへの分化 を介して...

皮膚生検からの患者由来足細胞の生成

学ぶヒト皮膚パンチ生検からの線維芽細胞導出培養法。ゼラチンコート培地で組織を培養し、4〜8週間で1,500〜2,000万個の低世代細胞を確立・保存する確実な技術です。

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