Name: 同時に電圧クランプとアンペロとドーパミン放出の単一細胞計測 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 30 s
Description: 学ぶ電圧クランプとアンペロメトリーによるドーパミン逆輸送の同時計測法。DAT介在性ドーパミン放出をリアルタイムで測定し、ドーパミン作動性シグナル伝達の機構解明に貢献します。

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我々は、この原稿の重要なレビューのために博士Sanika Chirwaに感謝します。この作品は、国立衛生研究所（DA026947、DA021471、そしてNS071122）によってサポートされていました。

1。用品<ol><li>バックグラウンドノイズを低減する防振台（TMI）の上にファラデーケージをマウントします。 </li><li>同時パッチクランプアンペロメトリー記録システムは、優れたDICの光学系と長作動距離レンズを備えた倒立顕微鏡を必要とします。車のバッテリーに灯台顕微鏡を接続します。システムのこのDC光源はさらに、電気ノイズを減少させるであろう。 </li><li>油圧マイクロマニピュレーター（Siskiyou）さらに減少ノイズ。私達の構成では、我々は、全細胞記録のために右利きのマニピュレータを使用し、電流測定のために左利き。 </li></ol> 2。記録用の電極を準備<ol><li> P-2000プラー（サター）に石英ピペットを用いてパッチ電極を引き出します。私たちのプルは、2つの熱サイクルで、約5秒続く。この熱時間は私たちの全細胞パッチピペットで一貫抵抗（MΩ3-4​​）をもたらしました。 </li><li>に電極を埋めるピペットは、2mMのドーパミンを含む溶液と右マニピュレーターにマウントします。アルミホイルでDAを含むピペット溶液を保持する容器を包む。氷上で保存する。ドーパミンは酸化可能である。光から保護し、氷の上で解決策を維持すると、ドーパミンの酸化速度が低下します。 </li><li>優しく、収納ボックスからProCFE（ダガン）低ノイズカーボンファイバーアンペロメトリー電極を取り外します（ 図1に示すように）アンペロメトリアダプタに水銀、マウントと入力し、[右maniupulatorにマウントされます。炭素繊維の遠端を保持することによって損傷から炭素繊維の先端を保護します。先端を清潔にし、無傷であることを確認するために、ラボ顕微鏡で電極を点検してください。 </li><li>外液を含有するガラスボトムシャーレに電極を入れて電流滴電極の整合性を調べます。ドーパミンの非存在下での現在のベースラインを記録します。皿に1mmのDA溶液10μlを追加します。良いアンペロメトリー電極REコー​​ド酸化電流の増加。アンペロメトリー電極が正常に動作して確実にし、各実験の開始時と終了時に、この手順を繰り返します。 </li></ol> 3。グラスボトムペトリ皿内ド​​ーパミントランスポーターを発現するように遺伝子ドーパミン神経細胞や神経細胞の初代培養を始めて<ol><li>優しく暖かい外液と細胞やドーパミンニューロン3回洗浄する。 </li><li>顕微鏡ステージ上にグラスボトムシャーレをマウントします。 </li></ol> 4。セルを視覚化し、実験を行う<ol><li>明らかに細胞を可視化するための正しい焦点を見つける。パッチ電極に正の圧力をかける。その後、静かに溶液中に両方の電極をダウンさせると、セルに近接しています。 </li><li>セル（左側）、右側にパッチ電極の隣にアンペロメトリー電極を配置します。 </li><li>パッチ電極付きセルでgigaohmシールを達成。破裂に吸引シール細胞全体の構成を実現。 </li><li>細胞内にドーパミンを含む内部液の透析のための5月8日分を許可します。 </li><li>所望の電圧ステップまたはランプ·プロトコルを使用しています。同時にパッチピペットと膜電位はパッチピペットを介して制御されながら、ドーパミントランスポーターを介して全細胞電流とドーパミンの逆輸送を測定する電流測定型電極の両方からデータを取得します。 </li></ol>

<ol><li>Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+contributing+to+the+recovery+of+striatal+releasable+dopamine+following+MFB+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation.</a> Brain Res. 421, 325-335 (1987).</li>
<li>Gonon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+and+extrasynaptic+excitatory+action+of+dopamine+mediated+by+D1+receptors+in+the+rat+striatum+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prolonged and extrasynaptic excitatory action of dopamine mediated by D1 receptors in the rat striatum in vivo.</a> J. Neurosci. 17, 5972-5978 (1997).</li>
<li>Sulzer, D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+quantal+size+by+presynaptic+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of quantal size by presynaptic mechanisms.</a> Rev. Neurosci. 11, 159-212 (2000).</li>
<li>Napolitano, A., Cesura, A. M., Da Prada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+monoamine+oxidase+and+catechol+O-methyltransferase+in+dopaminergic+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neural.+Transm.+Suppl%22%5BJournal%5D)">The role of monoamine oxidase and catechol O-methyltransferase in dopaminergic neurotransmission.</a> J. Neural. Transm. Suppl. 45, 35-45 (1995).</li>
<li>Sulzer, D., Maidment, N. T., Rayport, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+other+weak+bases+act+to+promote+reverse+transport+of+dopamine+in+ventral+midbrain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and other weak bases act to promote reverse transport of dopamine in ventral midbrain neurons.</a> J. Neurochem. 60, 527-535 (1993).</li>
<li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+amphetamine-induced+hyperactivity+and+reward+in+mice+overexpressing+the+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Increased amphetamine-induced hyperactivity and reward in mice overexpressing the dopamine transporter.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4405-4410 (2008).</li>
<li>Khoshbouei, H., Wang, H., Lechleiter, J. D., Javitch, J. A., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine-induced+dopamine+efflux.+A+voltage-sensitive+and+intracellular+Na%2B-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amphetamine-induced dopamine efflux. A voltage-sensitive and intracellular Na+-dependent mechanism.</a> J. Biol. Chem. 278, 12070-12077 (2003).</li>
<li>Goodwin, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+and+methamphetamine+differentially+affect+dopamine+transporters+in+vitro+and+in%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Amphetamine and methamphetamine differentially affect dopamine transporters in vitro and in.</a> , 284-2978 (2009).</li>
<li>Kahlig, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+induces+dopamine+efflux+through+a+dopamine+transporter+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3495-3500 (2005).</li>
<li>Swant, J., Chirwa, S., Stanwood, G., Khoshbouei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methamphetamine+reduces+LTP+and+increases+baseline+synaptic+transmission+in+the+CA1+region+of+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Methamphetamine reduces LTP and increases baseline synaptic transmission in the CA1 region of mouse hippocampus.</a> PLoS One. 5, e11382(2010).</li>
<li>Gnegy, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca2%2B+regulates+amphetamine-induced+dopamine+efflux+and+currents+mediated+by+the+human+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca2+ regulates amphetamine-induced dopamine efflux and currents mediated by the human dopamine transporter.</a> Mol. Pharmacol. 66, 137-143 (2004).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

同時に電圧クランプとアンペロメトリーは、次の利点があります。すべての細胞型はアクセス可能であり、記録のために使用することができます。レコーディングが行われた細胞またはニューロンの同定は、シンプルで簡単です。特に、細胞が蛍光実験者が容易に目的の細胞や神経細胞を選択することができ、目的のタンパク質に蛍光タグを追加することで、ラベルが付いていた場合。実験的な構成では、パッチピペットを介して、または浴溶液10〜これらの薬剤を添加することによりどちらか薬理学的薬剤の均一かつ制御された送達を可能にする。同時パッチクランプアンペロメトリー技術は、ミリ秒の時間分解能で酸化され、トランスミッタのリリースによって異なるチャネルやトランスポーターの役割の調査を可能にしながら膜 電位が制御されます。同じ情報は、生化学的方法8を介して取得することはできません。このapproacのユニークな特徴の一つhは、それがパッチピペット7,11を介して、透析により細胞内環境の操作を可能にすることである。ただし、この手法は、電流滴電極が酸化性のみの送信機を検出できないという欠点...

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>防振テーブルのw /ファラデーケージ</td><td>テクニカル·マニュファクチャリング株式会社</td><td> 63から500シリーズ</td><td>私たちはモデル63から543までを使用</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡ニコンTE-2000 </td><td>ニコン</td><td>中止</td><td>これで、EclipseのTi </td></tr><tr><td>二つの低雑音増幅器axopatch 200B </td><td>分子デバイス</td><td></td><td> 800-635-5577 </td></tr><tr><td> 1-CV 203 BUのヘッドステージ</td><td>分子デバイス</td><td></td><td> 800-635-5578 </td></tr><tr><td> 1-HL-Uピペットホルダ</td><td>分子デバイス</td><td></td><td> 800-635-5579 </td></tr><tr><td> Digidata 1440A / Dコンバータ</td><td>分子デバイス</td><td></td><td> 800-635-5580 </td></tr><tr><td> 2つのマニピュレータSiskyou、左と右利き</td><td> Siskiyou </td><td> MX6600R MX6600L </td><td> 877-313-6418 </td></tr><tr><td>レーザーピペットプラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> P-2000 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td>低ノイズの炭素繊維電極アンペロメトリー</td><td> ProCFE </td><td></td><td> <a href="http://www.dagan.com" target="_blank">www.dagan.com</a> </td></tr><tr><td>低ノイズ石英ピペット</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> QF100-70から7.5 </td><td> 888-883-0128 </td></tr><tr><td> 12ボルトのカーバッテリー</td><td></td><td></td><td>広く利用可能</td></tr><tr><td>車のバッテリー充電器</td><td></td><td></td><td>広く利用可能</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td>塩化ナトリウム（NaCl） </td><td>シグマ</td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H3375 </td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>シグマ</td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム（MgSO 4） </td><td>シグマ</td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム（KH 2 PO 4） </td><td>シグマ</td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム（KCl） </td><td>シグマ</td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム水和物（CaCl 2で •2H 2 0） </td><td>シグマ</td><td> 223506 </td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物（MgCl 2を •6H 2 0） </td><td>シグマ</td><td> M2670 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td>シグマ</td><td> E0396 </td><td></td></tr></tbody></table>

同時に電圧クランプとアンペロとドーパミン放出の単一細胞計測

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

シナプス間隙、ドーパミンへのそのリリース後に、その前と後シナプスターゲット1を介して、その生物学的特性を発揮する。ドーパミン信号が拡散2-3、細胞外酵素4、膜輸送体5で終了します。ドーパミンニューロンの周囲のシナプス間隙に位置するドーパミントランスポーターは、内側ドーパミンフラックス（取り込み）を介して放出さアミンをクリアします。ドーパミントランスポーターはまたドーパミン5の外側への輸送または流出と呼ばれるプロセスで、内部から外部へのアミンを解放するために逆方向に働くことができます。 。フォワード（摂取）とリバース（流出）5：20年以上前スルザーらは、ドーパミントランスポーターは、次の2つのアクティビティのモードで動作することができます報告した。トランスポーターを介して流出を介して神経伝達物質放出は、細胞外空間にドーパミンを大量に移動させることができ、細胞外ドーパミンhで主要な調節的役割を果たすことが示されているomeostasis 6。ここでは、同時パッチクランプとアンペロメトリー記録は膜電位が制御されているミリ秒の時間分解能で流出機構を介してドーパミン放出を測定するために使用する方法について説明します。このため、全細胞電流と酸化（アンペロメトリー）信号はAxopatch 200Bアンプ（Molecular Devices社、全細胞電流記録、1,000 Hzのローパスベッセルフィルタが設定された）を使用して同時に測定される。アンペロメトリーは炭素繊維電極を記録するためには、第二増幅器（Axopatch 200B）に接続されており、細胞膜に隣接して配置され、700 mVに保持されます。全細胞と酸化（アンペロメトリー）電流を記録することができ、電流 - 電圧の関係は、電圧ステッププロトコルを使用して生成することができます。濃度への変換を必要とする通常のアンペロメトリックキャリブレーションとは異なり、現在は有効容積7を考慮せずに直接報告されています。従って、得られたデータいくつかの送信機はバルク溶液に失われるので、ドーパミン流出には下限を表しています。

アンペロメトリーとの複合パッチクランプは、電位依存DAT媒介DA流出。 図2Aは、細胞内環境と膜電位が全細胞パッチピペットによってクランプされるDATの媒介DA流出の代表的な実験設定や記録を示して測定することができます。アンペロメトリー電極が細胞膜（ 図2A）上に置かれている間、このテクニックを使用すると、YFP-DATのタンパク質を発現する細胞は全細胞パッチピペットを用いて電圧にクランプされます。全体のセル電極を2mM DAを含むピペット溶液で満たされている。原形質膜に触れるアンペロメトリー電極が700 mVに、DAの酸化還元電位よりも高い電位に保たれる。 DATの媒介電流（全細胞- 図2C及びアンペロメトリー- 図2D）-40 mVの保持電位（ 図2Bから-60〜+100 mVの膜電位に全細胞ピペットを踏んで記録されている</強い&gt;）。特定のDATを媒介DAの流出を決定するために、電流測定電流は、DATのアンタゴニストの不在と存在に記録することができます。 D...

アンペロメトリック技術は自発的ドーパミンの酸化によって生成される酸化電流を検出することにより、単一細胞からのドーパミン放出を測定します。同時電圧クランプとアンペロメトリー方法論はドーパミントランスポーターおよびドーパミンの逆輸送上のこの活動の調節の役割の全体的な &quot;活動&quot;の間の機構的な関係を明らかにする。

シナプス間隙に放出された後、ドーパミンはシナ前およびシナ後の標的を介してその生物学的特性を発揮します1。ドーパミン信号は...

この手順の目的は、パッチクランプ法とパイロメトリー法を同時に用いてニューロンを電位固定し、DAT介在性のドパミン放出を測定することで、ドパミンの逆輸送を測定することです。まず、ドパミンを用いてパイロメトリック電極の健全性を確認します。次に、パイロメトリック電極を細胞の近くに配置し、パッチピペットを用いてニューロンのホールセルパッチを形成します。次に、パッチピペットを用いて細胞の電位を制御しながら、細胞から放出されるDAT介在性のドーパミンをパイロメトリック電極で同時に記録します。最終ステップとして、DATブロッカーを添加し、全細胞電流とパイロメトリー電流を再度記録することで、ドーパミントランスポーターによって特異的に介在される電流を差し引くことができるようにします。この手法の意義は、ドーパミン作動性ニューロンの電位を制御しながら、ドーパミントランスポーターを介したドーパミンの逆輸送を測定できる点にあります。同時パッチクランプおよび気圧測定記録システムには、システムのDC光源を生成するために、優れたDIC光学系と長作動距離レンズを備えた倒立顕微鏡が必要です。電気ノイズを低く抑えるため、顕微鏡の光源を自動車用バッテリーに接続します。本構成では、油圧マイクロマニピュレーターがノイズレベルにほとんど影響を与えないため、これを使用しています。電位固定法によるホールセル記録には右手のマニピュレーターを、温度測定には左手のマニピュレーターを使用します。ホールセル記録用の電極を準備するために、P 2000 プラーを用いて石英ピペットを引きます。通常、抵抗値が 3〜4 MΩ のピペットを使用します。次に、1 mMのドーパミンを含むピペット溶液を電極に充填します。その後、右側のマニピュレーターにあるピペットホルダーに電極を装着します。ドーパミン含有ピペット溶液を入れた容器は、必ずアルミホイルで包み、使用しないときは氷上に保持してください。ドーパミンは酸化しやすいため、溶液を氷上に置き遮光して保存することで酸化速度を抑制できます。銀線を電極ホルダーに通し、次にamパラメトリックアダプターを電極ホルダーに取り付けます。続いて、銀線に接触する十分な量の水銀をtric電極に充填します。電極をアダプターに取り付ける際は、必ず顕微鏡でpro CFE低ノイズカーボンファイバーおよびパラメトリック電極を検査し、チップが清潔で損傷していないことを確認してください。カーボンファイバーのチップを損傷から保護するため、必ずカーボンファイバーの端の方を持つようにしてください。その後、pro CFE Tric電極を取り付けます。続いて、組み立てた電極を左側の油圧マニピュレーターに取り付け、tric電極の完全性を確認します。これを外部溶液の入ったガラス底ペトリ皿に浸します。ドーパミンがない状態でのベースライ

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神経科学

このビデオでは、我々はラット脳スライスにおける全細胞の構成で記録されたドーパミン作動性ニューロンへのコンダクタンスを適用する方法を示します。この手法は、ダイナミッククランプと呼ばれています。...

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高速スキャンサイクリックボルタンメトリーによる線条体の脳スライスにおけるシナプス前ドーパミンのダイナミクス

このビデオは、麻酔をかけたラットに電極とカニューレを埋め込んで、ポテンショスタットを使用して側坐核のドーパミン放出を測定し、腹側被蓋領域のドーパミン作動性活性を調節するための薬物を注入する方法を示しています。...

VTAドーパミン作動性ニューロン受容体操作によるラットモデルにおけるドーパミン放出のモニタリング

このビデオは、全細胞構成を確立することにより、ショウジョウバエのommatidiumの光受容体ニューロンの電気的活動を記録する方法を示しています。これは、光パルスによる一過性受容体電位チャネルの活性化を強調し、測定可能な量子バンプをもたらします。...

ショウジョウバエの光受容体からの全細胞電圧クランプ記録

細胞内パッチクランプ記録は、樹状突起の機能的特性を調査する可能性を提供します。しかし、これらの微細な構造物は、直径が小さいため、簡単にはアクセスできません。ここで説明するプロトコルは、in...

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

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QNsim1.0を用いた電気刺激されたドーパミン神経伝達データからの高速スキャンサイクリックボルタンメトリーデータのモデリング

ショウジョウバエmelanogaster光受容体からの全細胞記録は、様々な条件下での自然発生的な暗いバンプ、量子隆起、光に対する肉眼的応答、および電流 - 電圧関係の測定を可能にする。 D. melanogaster遺伝子操作ツールと組み合わせて、この方法は、遍在するイノシトール - 脂質シグナル伝達経路およびその標的であるTRPチャネルの研究を可能にする。...

全細胞電圧クランプ記録のための電気生理学的方法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;感光体

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当然やりがい雌ハムスターの行動中に細胞外の神経伝達物質の生体内変化を測定

ここでは、高速モジュラーフォトメトリーシステムを用いた誘導多能性幹細胞由来心筋細胞からの作用電位の光学的獲得および特性評価について述べている。...

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急性脳スライスを用いた内因性モノアミン放出の検出に関する簡単な手法を紹介する。セットアップはモノアミン放出のためのティッシュホールダーを含んでいる48ウェル版を使用する。放出されたモノアミンは、HPLCによって電気化学的検出と結合して分析される。さらに、この技術は、創薬のためのスクリーニング方法を提供する。...

急性脳スライスにおける内因性モノアミン放出測定用プレートベースアッセイ

学ぶ電圧クランプとアンペロメトリーによるドーパミン逆輸送の同時計測法。DAT介在性ドーパミン放出をリアルタイムで測定し、ドーパミン作動性シグナル伝達の機構解明に貢献します。

同時に電圧クランプとアンペロとドーパミン放出の単一細胞計測

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