同時に電圧クランプとアンペロとドーパミン放出の単一細胞計測

この手順の目的は、同時パッチクランプとパイロメトリーを使用して電圧クランプされたニューロン内のドーパミンの逆輸送を測定し、DAT 媒介性 D 放出を測定することです。これは、最初にパイロメトリック電極の完全性をドーパミンでテストすることによって達成されます。2番目のステップは、パイロメトリック電極を細胞の近くに配置して、パッチピペットでニューロンの全細胞パッチを実現することです。

次に、細胞の電圧をパッチピペットで制御し、細胞から放出されたDAT媒介ドーパミンをパイロメトリック電極で同時に記録します。最後のステップは、DATブロッカーを追加し、細胞全体とパイロメトリー電流を再度記録して、ドーパミントランスポーターによって特異的に媒介される電流を差し引くことです。この技術の重要性は、ドーパミントランスポーターを介したドーパミンの逆輸送を測定すると同時に、ドーパミン作動性ニューロンの電圧を制御する能力です。

パッチクランプとバロメトリーの同時記録システムには、優れたDIC光学系を備えた倒立顕微鏡と、システム用のDC光源を生成するための長い作動距離レンズが必要です。電気ノイズが少ない場合は、顕微鏡灯台を車のバッテリーに接続します。油圧マイクロマニピュレータは、当社の構成の騒音レベルに大きく寄与しないために使用されます。

電圧クランプ、全細胞記録には右利き用マニピュレータ、パイロメトリーには左利き用マニピュレータが使用されます。電極を卸売録音用に準備するには、P 2000プーラーでクォーツピペットを引っ張ります。通常、3〜4メガオームの抵抗を持つピペットを使用します。

次に、1ミリモルのドーパミンを含むピペット溶液を電極に充填します。次に、右側のマニピュレーターのピペットホルダーに取り付けます。ドーパミン入りピペット溶液を入れた容器は必ずアルミホイルで包み、使用しないときは氷の上に置いてください。

ドーパミンは酸化しやすいため、溶液を氷の上に保ち、光から保護すると、酸化速度が低下します。銀線を電極ホルダーに通し、次にamパラメトリックアダプターを電極ホルダーに通します。次に、銀線に接触するのに十分な水銀をtric電極に充填します。

電極をアダプターに取り付けるときは、必ず顕微鏡でpro CFE低ノイズカーボンファイバーとパラメトリック電極を検査して、先端が清潔で損傷していないことを確認してください。カーボンファイバーの先端を損傷から保護するために、カーボンファイバーの遠端を必ず保持してください。次に、pro CFE Tric電極を取り付けます。

続いて、組み立てた電極を左側の油圧マニピュレータに取り付けて、tric電極の完全性を調べます。それを外部溶液を含むガラス底のペトリ皿に下げます。ドーパミンがない場合のベースライン電流を記録します。

次に、1ミリモルのドーパミン溶液を10マイクロリットル皿に加えます。優れたエンパーメトリック電極は、酸化電流の増加を記録する必要があります。実験の前後に、電磁電極の完全性を必ず確認してください。

この手順では、インキュベーターからガラス底のペトリ皿に入れられたドーパミントランスポーターを発現するように操作されたドーパミンニューロンまたは細胞を回収します。細胞またはドーパミンニューロンを温かい外部溶液で3回優しく洗浄します。細胞を可視化して実験を行うには、ガラス底のペトリ皿を顕微鏡ステージに取り付け、細胞を鮮明に可視化するための正しい焦点を見つけます。

次に、パッチ電極に正圧を加えます。1ミリリットルのシリンジを使用して、両方の電極を溶液にゆっくりと下げ、マイクロマニピュレーターで細胞を近づけます。次に、エンパーメトリック電極をセルの左側に配置し、パッチ電極を右側に配置します。

パッチ電極がセルに接触しているとき。口または注射器で軽く吸引して、細胞にギガシールを形成します。その後、吸引でシールを破裂させて全細胞構成を実現し、ドーパミンを含む内部溶液を細胞内に透析するために5〜8分間待ちます。

次に、ピペットを介して、細胞膜電圧をマイナス 40 ミリボルトの保持電位からマイナス 60 ミリボルトからプラス 100 ミリボルトの間でステップすることにより、DAT 媒介電流を記録します。特定のDAT媒介ドーパミンflxを決定するには、DATアンタゴニストの不在下と存在下でエンパーメトリック電流を記録します。次に、特定のDAT媒介トリク電流は、DATアンタゴニストの存在下で記録されたトレースを、アンタゴニストなしで記録されたエンパートレースから差し引くことによって決定されます。

トリク電流の上向きの偏向は、ここに示されているドーパミンの外向きの流れに対応します。DATは、全細胞パッチングモードで2ミリモルドーパミンを含むピペットを使用して、マイナス4Cミリボルトの保持電位からマイナス60からプラス100ミリボルトの間で膜電圧を20ミリボルトステップすることによって記録されたDAT媒介電流。これは、セル全体の電流と同時に取得されたEmperメトリック電流です。

このビデオを見れば、電圧クランプされたニューロンのドーパミントランスポーターを介したドーパミンの逆輸送を測定する方法についてよく理解できるはずです。実験の前後にパラメトリック電極の完全性を確認することを忘れないでください、そして、その拮抗薬の存在下で記録された痕跡を、拮抗薬なしで記録されたtricの痕跡から差し引くことを忘れないでください。