げっ歯類の内側嗅内皮質の背腹軸機構の調査のための矢状スライスの作成

我々は内側嗅内皮質（MEC）の背腹軸を維持する脳スライスからの調製および電気生理学的記録のための手順について説明します。場所の神経エンコーディングはMEC内の背腹軸の組織を次のようなので、これらの手順は、ナビゲーションやメモリのための重要な細胞メカニズムの調査を容易にします。

次の実験の全体的な目標は、内側のニューロンがRH皮質に入るシナプスおよび統合特性の地形的構成を調べることです。これは、背側腹側平面に向けられた内側の RH 皮質に入るスライスを準備することによって達成されます。第 2 のステップとして、パッチ クランプの記録は、そのシナプスおよび統合特性を調査するために、メント RH 皮質ニューロンに作成されます。

次に、記録されたニューロンの位置を決定して、電気生理学的に測定された特性の背側腹側組織を評価します。それらの入力抵抗、膜時定数、および活動電位閾値の測定値に基づいて、第2層の星状細胞の固有の特性の地形的構成を示す結果が得られ、その手順を示すのは、私の研究室の大学院生であるヒュー・パステルです。この手法が、水平方向を向いた脳スライスなどの既存の方法よりも優れている点は、記録されたニューロンの位置を、インターアル・コルテックスの背側腹軸に沿って正確に記録できることである。

この手順を開始するには、マウスから脳を取り外し、すぐに冷間切断に置きます。カルボゲンで泡立った人工脳脊髄液。3分後、へらを使用して、切断されたA CSFから脳を慎重に取り出します。

カットACSFで湿らせた濾紙の上にそっと直立させます。次に、カミソリまたはメスを使用して、大脳の臍帯の極端に位置する内側腸皮質に影響を与えることなく、小脳をできるだけ多く取り除きます。冠状面を切片にして大脳の吻側部分を切除します。

次の半球秒、正中線の垂直面にある脳。その後、半球を泡状に戻し、CSFを切断してから1分半後から取り付けます。ビブラートブレードの刃先が水平から20度の角度になっていることを確認します取り付け面に、ビブラートブレードと平行に、半球の幅とほぼ同じで、2つの半球を端から端まで収容するのに十分な長さの浅い瞬間接着剤のストリップを作成します。

次に、各半球をCSFの切断から取り付け面に移し、半球をその内側がへらに置き、背側の範囲が振動トーンブレードに向くように半球を配置します。半球を瞬間接着剤のストリップにそっとスライドさせ、各半球の内側表面がビブラートベースと平行であることを確認します。その後、すぐに半球を冷間切断に沈めます。

CSFです。スライス手順全体を通して、温度と車と飽和を維持します。ビブラムを使用して、各半球の内側経腸皮質の最も外側の部分が側面から少なくとも600マイクロメートルで識別されるまで、矢状面の両方の半球から皮質を取り除きます。

内側経腸皮質の外側範囲は、海馬の腹側索状曲線の周りに太い白い帯がないことによって識別されます。その吻側境界の非凸形状と角張った背側索状角は、内側経腸皮質の内側範囲に達するまで、両方の半球から400ミクロンの傍矢状切片を切り取りました。各カット後、スライスを35°Cの水浴に維持したカルボゲン飽和標準A CSFに直ちに入れ、約15分間インキュベートします。

15分後、スライスホルダーをウォーターバスから取り出し、室温でカルボゲンで少なくとも45分間バブリングを続けます。スライスを記録チャンバーに移し、カルボゲン飽和標準物質A-C-S-F-A 35°Cで連続的に泡立てます。次に、内側入力RH皮質内のおおよその記録領域を特定します。

次に、高倍率の対物レンズに切り替えます。この領域内の生細胞を同定します。この時点で、従来の全細胞パッチクランプを使用して、同定されたニューロンからの膜電位または膜電流を記録する実験を行うことができます。

ニューロンの同一性は、記録されたニューロンの電気生理学的特性から、また細胞内溶液中に蛍光標識を含めることによって確認することができます。実験後、背側腹軸に沿った記録されたニューロンの位置を決定した後、低倍率の対物レンズに切り替えます。画像に記録電極を含めるか、視野虹彩ダイアフラムをステップダウンして、対象の位置をマークします。

複製画像画像、内側および右皮質領域、および画像内の記録位置をピンポイントで示すために、スライスの内側および右皮質領域およびその周辺領域の関心のある位置の周囲に明るい円を残すために、次いで、複製を記録位置およびその周辺の初期画像に重ね合わせることができる。腹側記録位置から内側内側皮質の背側境界までの領域をカバーするために、最大3つの別々の低倍率画像が必要になる場合があります。これらの画像は、画像操作ソフトウェアを使用してつなぎ合わせることができます。

内側経腸皮質の背側境界は、背側腹側位置を測定するのに便利な目印を提供しますが、内側経腸皮質の腹側境界はそれほど明確に定義されていません。ここは。DICとNIALの傍矢状切片は、円形の海馬と、外側経腸皮質の第1層への傍輪状突起の欠如をそれぞれ示しています。これらは、内側経腸皮質を含む典型的なスライスの画像です。

パラス領域はミサイル染色によってはっきりと明らかになります。対応する画像では、黒い矢印で示されている内側腸皮質の背側境界は、赤い矢印で示されているように、第1層に大きく突き出ている傍輪状細胞のグループに対して腹側にあります。これは、パラ矢状スライスの4倍率の合成画像の例です。

背側細胞と腹側細胞の位置は、それぞれ青と緑の塗りつぶされた円で示されています。黒い矢印は、内側内側皮質の推定背側境界を示し、白い点線で深層に延長されています。白い実線は輪郭経路を示すガイドであり、それに沿って、内側内側皮質の背側境界から、マークされた背側および腹側星状細胞からの腹側に位置する細胞記録までの距離のピクセル測定がここに示されている。

これらの記録は、細胞の同一性を確立し、内側の電気的特性がどのようにr皮質に入るかを説明するのに役立ちます。第2層の星状細胞は、この手順を試みている間、背側と腹側の位置で異なります。高品質のスライスは生産的な電気生理学的記録に不可欠であるため、スライスの準備中には特に注意を払うことを覚えておくことが重要です。