Name: ストップトフロー分光光度法を用いたフラビン依存性モノオキシゲナーゼの還元と酸化の半反応を監視する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 学ぶストップトロー分光光度法を用いたフラビン依存性モノオキシゲナーゼの還元・酸化半反応の動的解析。Aspergillus fumigatus SidAの反応中間体と速度定数を測定し、酵素触媒サイクルの機構解明に貢献します。

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1。嫌気性バッファーの調製<ol><li> 100mMリン酸カリウム緩衝液1 L、pHが7.5を準備します。攪拌棒を500 mLのブフナーフラスコにバッファー250mLのを注ぐ。 </li><li>ゴム栓とフラスコを密封し、攪拌プレート上に置きます。シュレンクラインにフラスコの短いチューブを接続します。 </li><li>ドガ攪拌しながら室温で5時間真空下でのバッファ。この期間中、毎時間脱気し、アルゴンでフラッシング真空の5つの連続した​​ラウンドを実行します。 </li><li> 10秒間のアルゴンとフラスコをフラッシュし、真空マニホールドから外します。グローブボックス内にフラスコを置きます。 </li><li>激しく攪拌しながら一晩グローブボックス内でフラスコを開いたままにします。 </li></ol> 2。ストップトフローシステムから酸素を除去する<ol><li> 0.1 M酢酸ナトリウム、pH5.0の1リットルを準備します。 250mLのブフナーフラスコに、このバッファ125 mLを注ぎ、ステップ1.2から1.4を実行します。 </li><li> 5を秤量アスペルギルスニジェール （181300 U / g）と0.9グラムのグルコース1.5mlのエッペンドルフチューブと50mlのファルコンコニカルチューブを使用して、それぞれからmgのグルコースオキシダーゼ。グローブボックスに両方のコンテナを配置します。 </li><li>嫌気性0.1 M酢酸ナトリウム、pH5.0（それぞれ18.13 U / mLと100 mMの、最終濃度）の50 mLのグルコースオキシダーゼとグルコースを溶解する。この溶液（ 図1）貯水池シリンジを満たします。 </li><li>ドライブのバルブは&quot;負荷&quot;の位置にあることを確認し、ドライブのシリンジ（ 図1）を記入してください。 &quot;ドライブ&quot;の位置にFバルブを回します。プロデータコントロールソフトウェアで空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジFからバッファを押してください。このステップの合計で10回繰り返します。他の3つのドライブシリンジと同じ手順を実行します。一時間待ちます。 </li><li>同じバッファcontaiとリザーバーシリンジのソリューションを置き換えるグルコースオキシダーゼとグルコース寧。手順2.4を繰り返します。 </li><li>手順2.5を繰り返し、解決策は一晩フローシステムに立つことができます。 </li><li>一晩インキュベートした後、手順2.5を繰り返します。 </li></ol> 3。酸素飽和バッファーの調製<ol><li> 100mMのリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）を調製し、攪拌棒を50-mLバイアルに50mLを注ぎます。ウィートンのストッパーとウィートンのアルミシールでバイアルをキャップ。 </li><li>氷の上でバイアルを置きます。溶液中に100％の酸素を含むタンクに接続されて長い針を浸します。ベントとして、バイアルの栓を介して別の短い針を挿入します。 </li><li>泡攪拌しながら1時間100％の酸素とソリューションを提供します。 </li><li>最初のバイアルから短い針を除去し、長い針を取り外す前に、10秒待ちます。グローブボックス内で閉じたバイアルを置きます。 </li></ol> 4。 NADPH溶液の調製<ol><li> 1.5 mLのエッペンドルフチュー​​ブにNADPH 1mgを秤量し、iを置くグローブボックスにトン。 </li><li>嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）300μLでNADPHを溶かす。分光光度計（ε340 nmの = 6270 M -1 cm -1を ）とNADPH濃度を決定するためにグローブボックスから、この溶液の30μLを削除します。 </li></ol> 5。酵素溶液からの酸素の除去<ol><li>グローブボックス内の冷凍庫で、解凍から酵素ストック溶液400μLを取る。酵素原液（360μM）は、以前に100mM NaClを含む100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）で調製し、液体窒素中で凍結させた。 </li><li>攪拌棒25 mLバイアル中に酵素溶液を移し、ウィートンのストッパーとウィートンのアルミシールでバイアルをキャップ、グローブボックスから削除します。 </li><li>氷の上でバイアルを置き、バイアルの栓に針を挿入することによって、シュレンクラインに接続します。 </li><li>ドガの連続した​​5ラウンドを行うことにより、酵素溶液1時間ごとに20分を脱気し、アルゴンでフラッシング真空。 </li><li> 10秒間アルゴンバイアルをフラッシュし、真空マニホールドから外します。グローブボックス内の氷の上に瓶を置きます。 </li></ol> 6。還元的半反応：監視フラビン還元<ol><li>製造業者のプロトコルに従って、単​​一の混合モードでのストップトフロー測定器とPro-Dataの制御ソフトウェアを準備します。 </li><li>循環水浴（15℃）をオンにします。 20分間それを通して窒素をバブリングすることにより水から酸素を除去します。これは、フロー回路を介して酸素の混入を防ぐことができます。 </li><li>循環浴にストップトフローの水浴ハウジングを接続することにより、ドライブシリンジの温度と15の観測セル°Cを維持しています。 </li><li>プロのデータの制御ソフトウェアを選択してフォトダイオードアレイ、外部トリガ（ストップトフローの動作をアクティブにする）、およびLogaritの[コントロールパネル]ウィンドウでHMIC規模。 </li><li>プロのデータビューアソフトウェアを起動し、データファイルが格納されるディレクトリを定義します。 </li><li>嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）と貯水池シリンジCとFのソリューションに置き換えます。 &quot;ドライブ&quot;の位置にCとFバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で（RAMのそれぞれの動きの前に空にするをクリックします）、合計で5回、対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジの両方からのバッファを押してください。 </li><li>そのグルコースオキシダーゼが流れ回路から完全に削除されていることを確認するためには、合計で6.6の4倍をステップ実行します。 </li><li>プロのデータ制御ソフトウェアのベースラインをクリックします。 </li><li>嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（15μMの停止流れの中で混合後の最終濃度）の1100μLに酵素原液の100μLを混和します。 </li><li>貯水池SYRのソリューションを置き換える酵素溶液とFをインゲ。 &quot;ドライブ&quot;の位置にFバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジFから酵素液をプッシュします。合計で、この三回を実行します。プロのデータの制御ソフトウェアでは、60秒に取得時間を設定します。 </li><li>両方のドライブシリンジは、ドライブシリンジのピストンと接触しているそれらに対応するソリューションとドライブの雄羊で満たされていることを確認してください。 &quot;ドライブ&quot;の位置に両方のバルブを回して、ドライブを実行するためにプロのデータ制御ソフトウェアの取得]をクリックします 。三重内のデータを取得するために2倍以上、この手順を繰り返します。酵素の酸化型のこの収量スペクトル。 </li><li>ドライブから得られた452 nmの値を使用して、（ε452 NM = 13700 M -1 cm -1）を混合する前に酵素濃度を決定し、NADPH solutio 4 mLの準備を■1.5倍以上濃縮した。 </li><li> 6.10で説明したようにNADPH溶液と空の補充停止シリンジで3回リザーバーシリンジCの溶液を交換してください。 </li><li>ステップ6.11を繰り返します。酵素の減少時にこの収量スペクトルを示す。 </li></ol> 7。酸化半反応：監視フラビンの酸化<ol><li>ストップトフロー測定器および製造業者のプロトコルに従って、ダブルミキシング·モードのPro-Dataの制御ソフトウェアを準備します。 </li><li>ステップ6.2から6.5を繰り返します。 </li><li>嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）を持つ4つのリザーバーシリンジ内の溶液を交換してください。 &quot;ドライブ&quot;の位置にFバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって流路を介して駆動シリンジFからバッファを押してください。各ドライブシリンジとの合計でこのステップを5回実行します。 </li><li> TOTには7.3の4倍をステップ実行します。らは、完全に流れ回路からコンテンツを削除します。 </li><li>プロのデータ制御ソフトウェアのベースラインをクリックします 。 </li><li>嫌気性の100mMリン酸カリウム緩衝液（15μMの停止流れの中で混合後の最終濃度）の1000μLに酵素原液の200μLを混和します。 </li><li>酵素溶液をリザーバーシリンジのソリューションに置き換えます。 &quot;ドライブ&quot;の位置にバルブを回します。プロのデータ制御ソフトウェアの空をクリックして、ストップシリンジを空にします。手動で対応するドライブのRAMを上げることによって、ドライブシリンジから流れ回路を介して酵素溶液をプッシュします。このステップを合計3回を実行します。プロのデータの制御ソフトウェアでは、0.5秒の遅延時間と60秒の取得時間を設定します。 </li><li>すべてのドライブシリンジは、ドライブシリンジのピストンと接触しているそれらに対応するソリューションとドライブの雄羊で満たされていることを確認してください。 &quot;ドライブ&quot;の位置にすべてのバルブを回しとPro-DATの取得をクリックしますドライブを実行する制御ソフトウェア。三重内のデータを取得するためにこのステップを2回以上繰り返します。酵素の酸化型のこの収量スペクトル。 </li><li>注射器Aの酵素溶液 &quot;ドライブ&quot;の位置と空の補充停止注射器のように7.7で説明されて三回にBバルブを回して、1.5倍より濃縮されたNADPH溶液とリザーバーシリンジBの溶液を交換してください。 </li><li>酸素バッファを持つ貯水池注射器Cの溶液を交換してください。ストップシリンジに7.7で説明したように三回の &quot;ドライブ&quot;の位置と空にCのバルブを回して補充。プロのデータの制御ソフトウェアでは、それぞれ、15、900秒での遅延と取得時間を設定します。 </li><li>手順7.8を繰り返します。完全に減少し、酵素の再酸化の間にこの収量スペクトルを示す。 </li></ol> 8。データ解析<ol><li>プロのデータコンバータソフトを起動します。 オプションアイコンをクリックするとProDataCSVに保存]を選択します。 </li><li>開くデータファイルが格納されていたディレクトリにコピーします。 APLプロのデータコンバータのウィンドウにファイルをドラッグします。データは同じディレクトリ内のCSV形式ファイルとして自動的に保存されます。 </li><li>をMicrosoft Excel（マイクロソフト、レッドモンド、ワシントン州、米国）を使用してCSV形式のファイルを開きます。 700 nmで対応する吸収を差し引くことによってストップトフロー·トレースのベースラインを正規化します。 </li><li>適切な指数関数に対応する最大時間に対する吸光度のプロットをフィッティングすることにより、カレイダグラフ（Synergyソフトウェア、読書、PA）を用いて補正トレースを分析する。 図2Bに示すように、452 nmの吸光度をストップトフロー装置内酵素およびNADPHを混合した後、フラビンの削減率を決定するために、時間の関数としてプロットした。この場合、データのベストフィットは、還元、resの第1および第2の位相を計算した二重指数関数方程式と0.65と0.23 s -1の速度を用いて得られたpectively。 C4A-hydroperoxyflavin中間体の形成の速度と酸素が ​​減少する酵素を反応させた後、再酸化を決定するために、我々は、それぞれ380および452 nmであり、（ 図3B）で停止したフローのトレースを分析した。単一の指数関数の式を使用して、我々は、それぞれ、酸化半反応の第一および第二のステップで1.4と0.006 s -1の速度を算出した。 </li></ol> 9。代表的な結果前のセクションで説明した実験結果からは、fキンゴジカの還元の半反応はフラビンの酸化還元状態の変化に対応する452 nmの吸光度の変化を測定することにより監視することができる方法を示しています。このステップの速度は、適切な式（;ステップ8.4 図2）にデータをフィッティングすることにより決定することができます。得られた削減率（0.65秒-1）と計算されたk個の猫値に似ています還元反応の律速段階であることを示唆している定常状態の実験2。ストップトフローのダブルミキシング·モードを活用して、酸化し、この半反応における中間体の速度が（;ステップ8.4 図3）決定することができます。 Fキンゴジカによって触媒される反応では、C4A-hydroperoxyflavinは明らかに（380nmのλmax）で検出され、形成と崩壊の速度を計算することができます。得られた再酸化（0.006秒-1）の遅い速度は、C4A-hydroperoxyflavinが存在しない場合にオルニチン非常に安定であることを示します。 <img alt="スキーム1" src="/files/ftp_upload/3803/3803scheme1.jpg" /> スキーム1。Fキンゴジカのメカニズム。 FAD補のisoallozaxineリングが表示されます。酸化フラビン（）は、NADPH（B）に結合してフラビンとNADP +（C）を還元型に反応します。酸素分子との結合との反応後オルニチン、C4A-hydroperoxyflavin（D）が形成される。これは、ヒドロキシル化種である。オルニチンの水酸化の後、hydroxyflavin（E）は、酸化酵素を形成するために脱水する必要があります。 NADP +は、触媒サイクルを通して結合したままで、（F）をリリースする最後の製品です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig1.jpg" /> 図1ストップトフロー測定器。 A）応用光物性SX20のコンポーネントの写真ストップトフロー分光光度計を。サンプルハンドリングユニットのB）画像。ダブルミキシング·モードでのフロー回路のC）スキーム。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig2.jpg" /> 図2。ストップトフロー測定器でNADPHとキンゴジカの嫌気性減少。 30μMと45μMキンゴジカのNADPHの等量を混合した後に記録された）スペクトルの変化。第一スペクトル（酸化SIDA）と最後のスペクトル（完全に削減シド）は、それぞれ青と赤で強調表示されます。 B）の吸光度は時間の関数として記録された452 nmでトレースします。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3803/3803fig3.jpg" /> ストップトフロー測定器でキンゴジカの図3。酸化。 A）スペクトルの変化は完全に低下しキンゴジカと酸素バッファの等量を混合した後に記録されます。最終濃度は15μMSIDA、22.5μMのNADPH、および0.95 mMの酸素であった。スペクトルは、0.034、4.268で記録され、727.494 sは、それぞれ完全に減少する酵素、C4A-hydroperoxyflavin中間体（380nmのλmax）、および酸化酵素（450nmのλmax）に対応しています。 B）382及び452 nmでの吸光度トレースは時間の関数として記録されます。

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我々は、開示することは何もありません。

酸化還元反応を触媒する酵素は、通常、触媒サイクルの間に有意な吸光度の変化がヘムとフラビンなどの補因子が含まれています。フラビンの酸化型では、〜360と450nmの吸光度の最大値を示し、その減少は一般的に450 nmの7での吸光度の減少に従うことによって監視されています。一般的には、いくつかの一時的な中間体は存在するが、通常の分光光度計で測定される形と減衰が速すぎです。応用光物性SX20ストップトフロー分光光度計（または類似の楽器）を使用して、それはミリ秒の時間スケールでの吸光度の変化を（デッドタイム、2ミリ秒）を測定することが可能です。ここでは、モデルとして、フラビン依存性モノオキシゲナーゼFキンゴジカの還元的および酸化的半反応を調べた。水素化物の転送速度は、嫌気的条件下でNADPHと酵素を混合した後、452 nmでの吸光度の変化を測定することにより決定した。その後、advantagを取る完全な削減が達成されるまでストップトフロー装置の二重混合モードのE、酵素は、まず減少し、酵素NADP +複合体は酸素と混合し、NADPHと反応させた。この手順に続いて、それは一時的な酸素フラビン中間体を検出するための形成と崩壊の速度を測定することが可能です。これらの中間体の同定は、触媒の反応種の性質についての実験データを提供します。 F SIDA、ヒドロキシル種であるC4A-hydroperoxyflavin（通常は370から380 nmでモニター）の形成の場合である。さらに、各ステップの速度定数を測定すると、1つは、反応の律速段階に関する情報を取得し、酵素の速度論的および化学的メカニズムを解明するのに役立つことができます。 一般的には、同様のアプローチは、他のflavoenzymes、またはそのようなCONTそのタンパク質などの吸光度の変化が発生したタンパク質は、使用することができAINヘム、ピリドキサール、リン酸、または非ヘム鉄8-10このメソッドへの制限は、精製酵素の大量が必要であることですが、これは高収率で発現系を用いることにより克服することができます。一つは、十分に強い信号が観測できるように十分なタンパク質を使用して記録スペクトルの最適なタンパク質濃度を決定するではなく、多すぎるように酵素が浪費されていません。一般的に、ストップトフロー実験に使用したフラビン含有酵素の最も低い酵素濃度は6-10μM（混合した後）であり、酵素の対応するモル吸光係数を用いて決定される。 Fキンゴジカの場合には、酵素結合したFADの割合は50から65パーセント2です。バインドされたFAD補因子が触媒作用に必要となりますので、アポ蛋白質は、これらの実験では非アクティブと見なされます。このメソッドへのもう一つの可能​​性の制限は、酵素のプロセスは、彼らが観察されることはありません2ミリ秒（ストップトフローのデッドタイム）よりも速いが発生した場合ですが、目EREは、レートは、この問題を克服するために減少させることができる戦略を報告されています。このための一つの例は、フェレドキシン-NADP +還元酵素11の反応で、高NaCl濃度を使用して含まれています。ストップトフローの流路からの酸素のスクラブは、多くの場合、この実験ではトリッキーなステップであり、特別な注意が必要です。それが効果的かつ安価な方法としてここで説明したグルコースオキシダーゼグルコースシステムは、ほとんどの研究室で正常に使用されています。しかしながら、H 2 O 2の産生を含め、いくつかのアプリケーションのためprotocatechuateオキシゲナーゼ-protocatechuateシステムなど、他の選択肢が12考慮すべきいくつかの欠点があります。嫌気性グローブボックスの利用は、簡単に嫌気的条件を確保することができるが、必須ではありません。我々は酵素は酸素の存在下で減少する場合や、濃度の酸素と反応し、酸素が停止してフローの流路から除去しなければならない我々は指定されたの。ストップトフローは、グローブボックス内でですが、我々は以前の実験で好気性のバッファを使用した場合、酸素が流れ回路である。吸光度測定に加えて、蛍光および円偏光二色性アッセイは、対応するアクセサリと応用光物性SX20ストップトフロー分光光度計で行うことができます。

<table border="1"><tbody><tr><td> 一般的な実験装置 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>真空ポンプ</td><td>ウェルチ</td><td> - </td></tr><tr><td>ブフナーフラスコ</td><td>フィッシャー</td><td> 70340-500 </td></tr><tr><td>棒をかき混ぜる</td><td>フィッシャー</td><td> 14-512-129 </td></tr><tr><td>プレートをかき混ぜる</td><td>フィッシャー</td><td> 11から100-49S </td></tr><tr><td>シュレンク行</td><td> Kontesグラス</td><td> - </td></tr><tr><td>アルゴンタンク</td><td> Airgasの</td><td> AR UPC300 </td></tr><tr><td>窒素タンク</td><td> Airgasの</td><td> NI200 </td></tr><tr><td>窒素タンク、超高純度グレード</td><td> Airgasの</td><td> NI UHP200 </td></tr><tr><td>酸素タンク</td><td> Airgasの</td><td> OX 40 </td></tr><tr><td> 5％の水素バランス窒素タンク</td><td> Airgasの</td><td> X02NI95B200H998 </td></tr><tr><td> SX20セントoppedフロー分光光度計</td><td> AppliedPhotophysics </td><td> - </td></tr><tr><td>グローブボックス</td><td>遠慮がちな</td><td> - </td></tr><tr><td>水浴</td><td>ブリンクマンラウダ</td><td> - </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 用品 </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 mLのBDファルコンチューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 14-432-23 </td></tr><tr><td> 15 mLのBDファルコンコニカルチューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 05-527-90 </td></tr><tr><td>の1.5 mLエッペンドルフ微量遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 05-402-18 </td></tr><tr><td> 50および25mLのガラスバイアル</td><td>フィッシャー</td><td> 06から402 </td></tr><tr><td>ゴム栓</td><td>フィッシャー</td><td> 06-447H </td></tr><tr><td>アルミシール</td><td>フィッシャー</td><td> 06-406-15 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ReagenTS </td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム、一塩基</td><td>フィッシャー</td><td> AC2714080025 </td></tr><tr><td>リン酸カリウム、二塩基性</td><td>フィッシャー</td><td> P288-500 </td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S-2889 </td></tr><tr><td> A.からのグルコースオキシダーゼニジェール </td><td>シグマ</td><td> G7141-250KU </td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td>フィッシャー</td><td> D16-500 </td></tr><tr><td> β-NADPH </td><td>フィッシャー</td><td> ICN10116783 </td></tr><tr><td> L（+）-オルニチン塩酸塩</td><td>フィッシャー</td><td> ICN10116783 </td></tr></tbody></table>

ストップトフロー分光光度法を用いたフラビン依存性モノオキシゲナーゼの還元と酸化の半反応を監視する

Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry

アスペルギルスシデロフォアA（SIDA）が（例えばferricrocinまたはN &#39;、N &quot;、N&#39;&#39;&#39; - triacetylfusarinine C）1病原性に必須であるヒドロキシデロフォアの生合成にオルニチンのヒドロキシル化を触媒するFAD含有モノオキシゲナーゼである。キンゴジカによって触媒される反応は、還元と酸化の半反応（スキーム1）に分割することができます。半反応の還元では、fキンゴジカにバインドされた酸化FADは、NADPH 2,3削減されます。酸化半反応では、 、還元型補因子は、オルニチンに酸素原子を転送C4A-hydroperoxyflavin中間体を形成し、分子状​​酸素と反応します。ここでは、速度を測定し、にインストールされているストップトフロー装置を用いてキンゴジカの異なるスペクトルフォームを検出するための手順について説明します。嫌気性グローブボックス。ストップトフロー装置では、反応物の少量が急速に混合され、流れた後、目によって停止されeは注射器（ 図1）を停止し 、観測セル内に配置ソリューションのスペクトルの変化を経時的に記録されます。実験の最初の部分では、我々はNADPHによるfキンゴジカにおけるフラビンの嫌気性低下が直接測定された単一モードでストップトフロー測定器を使用する方法を示しています。次にfをキンゴジカが最初に嫌気的に高齢化、ループ内での時間指定されている期間内においてNADPH削減され、ダブルミキシング設定を使用して、観察細胞（ 図1）分子状酸素と反応した。還元的半反応が監視されている場合にのみ、ソリューション内の任意の酸素が減少しフラビン補因子と反応して最終的に酸化されたフラビンに戻って減衰しますC4A-hydroperoxyflavin中間体を形成するので、この実験を実行するために、嫌気性のバッファが必要です。 ENZの完全なターンオーバーがあるだろうので、これは、ユーザーが正確に縮小率を測定することができませんでしたYME。還元と酸化の間にちょうどステップが観察されるように、酸化半反応が検討されているときにこの酵素は酸素の存在下で還元される必要があります。この実験で使用されるバッファの1つは、我々は、酸素の高濃度で酸化半反応を調べることができる飽和酸素である。これらは、しばしば手続きであるフラビン含有モノオキシゲナーゼとの還元または酸化半反応のいずれかを勉強したときに実施した。ストップトフローで実行前の定常状態の実験の時間スケールは、固有の速度定数の決定と反応4の中間体の検出および同定を可能にする秒、ミリ秒です。ここで説明する手順は、他のフラビン依存性モノオキシゲナーゼに適用することができます。5,6

我々は、還元および酸化半反応の両方を調査するストップトフロー装置の使用を記述<em&gt;アスペルギルス</em&gt;シデロフォアA（SIDA）、フラビン依存性モノオキシゲナーゼ。次にキンゴジカの反応の種に対応するスペクトルを示し、我々はそれらの形成のための速度定数を計算します。

Aspergillus fumigatusシデロフォアA（SidA）は、...の生合成においてオルニチンの水酸化を触媒するFAD含有モノオキシゲナーゼである。

この手順では、ストップトフロー装置を用いてSID Aの異なるスペクトル形態を検出し、速度を測定します。SID Aによって触媒される反応は、FADの還元半反応と酸化半反応に分けることができます。酸化型フラビンがN-A-D-P-Hに結合して反応し、還元型フラビンとNADPが生成されます。さらに、分子状酸素との反応およびオルニシンの結合により、C fourが形成されます。オルニチンの水酸化後、ヒドロキシフラビンが脱水して酸化型酵素が形成されます。NADP⁺は触媒サイクル全体を通じて結合しており、最後に放出される基質となります。ストップフロー装置を用いることで、少量の反応物の迅速な混合と記録が可能になります。分光光度計を用いて時間の経過に伴うスペクトルの変化を追跡することで、酵素触媒反応、特に一過性中間体の生成速度および消失速度を測定することができます。当研究室のメンバーであるRita RobinsonとEnviro Romeroが、モデルシステムとしてフラビンモノオキシゲナーゼを用い、セットAを使用してこれらの実験を実演します。スターバーを入れた500 mLのブフナーフラスコに、100 mMのリン酸カリウム緩衝液を250 mL注ぎます。フラスコをゴムストッパーで密閉し、スターラープレートの上に置いて、フラスコの短いチューブをシュレンクラインに接続します。室温で撹拌しながら真空下で1時間、バッファーを脱気し、続いてアルゴンで置換します。この操作を5回繰り返します。最後に、フラスコ内をArgonで10秒間パージします。真空マニホールドからフラスコを取り外し、グローブボックス内に入れます。フラスコを開いた状態で、引き続き激しく撹拌してください。リザーバーシリンジに 18.13 units/mL のグルコースオキシダーゼおよび 100 mM のグルコース溶液を満たします。次に、駆動バルブをロード位置に設定します。駆動シリンジを満たします。次に、Fバルブをドライブ位置に回します。Pro Dataコントロールソフトウェアを使用して、「empty the stop syringe（ストップシリンジの空にする）」をクリックし、対応するドライブラムを手動で上昇させ、ドライブシリンジFからフロー回路にバッファーを押し出します。他の3本のドライブシリンジについても同様に操作し、1時間平衡化させます。次に、リザーバーシリンジを補充し、停止していたフローシステムのフラッシングを繰り返します。酸素飽和バッファーを調製するには、溶液を撹拌しながら100% oxygenで1時間バブリングします。次に、バイアルから短い針を抜き、10秒間待ちます。続いて長い針を抜き、閉じたバイアルをグローブボックスに入れます。これはN-A-D-P-H溶液に対する手順です。1 mgのNADPHを含む1.5 mLのエプンドチューブをグローブボックス内に入れます。100 mMの嫌気性リン酸カリウム緩衝液（pH 7.5）300 µLに溶解させます。N-A-D-P-H濃度を測定するため、30 µLを取り出します。次に、酵素ストックから酸素を除去するため、溶液を撹拌子、キャップ、ストッパー、およびアルミシールを備えた25 mLバイアルに移します。氷上に保持してください。シュレンクラインに接続し、真空状態で20分間脱気した後、アルゴンで置換します。最後に、バイアル内をアルゴンで10秒間パージし、真空マニホールドから取り外します。バイアルをグローブボックス内の氷上に置きます。ProDataコントロールソフトウェアのコントロールパネルウィンドウで、フォトダイオードアレイ、外部トリガー、および対数スケールを選択します。また、ProDataビューアソフトウェアを起動し、データファイルの保存ディレクトリを指定します。次に、リザーバーシリンジCおよびFの溶液を、嫌気性の100 millimolarリン酸カリウム緩衝液 pH 7.5に交換します。CおよびFのバルブをドライブ位置に回します。pro data制御ソフトウェアの「empty the stop syringe」をクリックします。次に、対応する駆動ラムを手動で上昇させ、両方の駆動シリンジからバッファーを流路に押し出します。リザーバーシリンジCおよびFを用いた洗浄をさらに3回繰り返します。流路からグルコースオキシダーゼを完全に除去するため、pro data controlソフトウェアのbaselineをクリックしてください。リザーバーシリンジFの溶液を酵素溶液に交換します。Fバルブをドライブ位置に回します。pro data controlソフトウェアの「empty the stop syringe」をクリックします。対応する駆動ラムを手動で上昇させ、駆動シリンジFから流路に沿って酵素溶液を押し出します。プロデータ制御ソフトウェアに戻り、収集時間を60秒に設定します。両方の駆動シリンジにそれぞれの溶液が充填されており、駆動ラムが駆動シリンジのピストンに接触していることを確認してください。両方のバルブをドライブ位置に回し、Pro Data Controlソフトウェアのacquireをクリックしてドライブを実行します。ドライブから得られたA 452 nanometerの値を用いて、酸化型酵素のスペクトルデータを3回測定します。混合前の酵素濃度を決定し、4 mLのN-A-D-P-H溶液を調製します。1.5倍に濃縮したN-A-D-P-H溶液で充填リザーバーシリンジCを満たし、前述のとおりストップシリンジの排出と再充填を3回行います。次に、酵素を還元させる間に、嫌気性100 millimolarリン酸カリウム緩衝液 pH 7.5を用いてフロー回路内の内容物をフラッシュしながらスペクトルを取得します。その後、pro data制御ソフトウェアのbaselineをクリックしてください。次に、200 µLの酵素ストック溶液を、1000 µLの嫌気性100 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.5）と混合します。リザーバーシリンジAの溶液を、この酵素溶液に交換します。pro dataコントロールソフトウェアで、Aバルブをドライブ位置に切り替えます。「stop syringe empty」をクリックします。対応するドライブラムを手動で上昇させ、ドライブシリンジAから酵素溶液をフロー回路に押し出します。ディレイ時間を0.5秒に、測定時間を60秒に設定します。すべてのドライブシリンジに該当する溶液が満たされており、ドライブラムがドライブシリンジのピストンに接触していることを確認してください。次に、すべてのドライブバルブをドライブ位置に回し、pro dataコントロールソフトウェアのacquireをクリックします。酸化型の酵素のスペクトルデータを3回測定します。次に、リザーバーシリンジBの溶液を、シリンジAの酵素溶液よりも1.5倍濃度が高いN-A-D-P-H溶液に交換します。Bバルブをドライブ位置に回し、コントロールパネルウィンドウに表示されている通りに、ストップシリンジの空にすることと充填することを3回繰り返します。ディレイ時間を0.5秒に設定します。20秒で採取を行い、リザーバーシリンジの溶液を酸素飽和バッファーに交換します。Cバルブをドライブポジションに回します。pro data controlソフトウェアで3回フラッシュを行います。ディレイ時間を15秒、収集時間を900秒に設定します。ストップトフロー装置内にて、完全に還元された酵素の再酸化が行われている間、スペクトルの収集を継続します。N-A-D-P-HによるSID Aの嫌気的還元は、452 nmでの吸光度を用いてフラビンの還元状態の変化を測定することでモニターできます。酸化型SID Aから完全に還元されたSID Aの最終スペクトルまで、スペクトルの変化を時間とともに記録します。この酵素反応の速度は、データを適切な方程式に当てはめることで決定できます。また、ストップトフローのダブルミキシングモードを用いることで、この反応における酸化速度および反応中間体を決定することも可能です。C4a-ヒドロキシフラビン中間体は、極大吸収波長（λmax）380 nmで明確に検出され、酸化型酵素のλmaxは450 nmとなります。この手法を習得すれば、適切に実施することで4時間から6時間で完了させることができます。溶液が嫌気状態であることを必ず確認してください。このビデオを視聴することで、迅速化学などのさらなるダウンストリーム実験に独立したmonoを用いたFLAの相対的および潰瘍性イオンの両方を調査する方法について、十分に理解できるはずです。Quentinを用いることで、中間体の不飽和な性質を解明できる可能性があります。

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