ストップトフロー分光光度法を用いたフラビン依存性モノオキシゲナーゼの還元と酸化の半反応を監視する

本手順では、ストップトフロー装置を用いてSID Aの異なるスペクトル形態を検出し、速度を測定します。SID Aによって触媒される反応は、FADの還元半反応と酸化半反応に分けることができます。酸化型フラビンがN-A-D-P-Hに結合して反応し、還元型フラビンとNADPが生成されます。続いて、分子状酸素との反応およびオルニチンの結合により、C fourが形成されます。

オルニチンが水酸化された後のヒドロキシフラビンは、脱水されて酸化型酵素を形成します。NADPHは触媒サイクル全体を通じて結合しており、最後に放出される基質となります。ストップフロー装置により、少量の反応物の迅速な混合と記録が可能になります。

分光光度計を用いて時間経過に伴うスペクトルの変化を測定することで、酵素触媒反応における、特に一過性中間体の生成速度および消失速度を測定することができます。私の研究室のメンバーであるRita RobinsonとEnviro Romeroが、モデルシステムとしてset Aのフラボモノオキシゲナーゼを用いたこれらの実験を実演します。攪拌子を入れた500 mLのブフナーフラスコに、100 mMのリン酸カリウム緩衝液を250 mL注ぎます。

フラスコをゴム栓で密閉し、スターラープレートの上に置いて、フラスコの短いチューブをシュレンクラインに接続します。室温で撹拌しながら、真空下で1時間バッファーを脱気し、続いてアルゴンで置換します。この操作を5回繰り返します。

最後に、フラスコ内をアルゴンで10秒間フラッシュします。フラスコを真空マニホールドから取り外し、グローブボックス内に配置します。フラスコを開けた状態で、引き続き激しく撹拌します。

リザーバーシリンジに、18.13 units/mLのグルコースオキシダーゼ溶液および100 mMのグルコース溶液を満たします。次に、駆動バルブをロード位置に設定します。駆動シリンジを満たしてください。

次に、Fバルブをドライブ位置に回します。pro dataコントロールソフトウェアを使用して、「stop syringeを空にする」をクリックし、対応するドライブラムを手動で上昇させて、ドライブシリンジFからフロー回路にバッファーを押し出します。他の3つのドライブシリンジについても同様に行い、1時間平衡化させます。

次に、リザーバーシリンジを補充し、停止していたフローシステムのフラッシングを繰り返します。酸素飽和バッファーを調製するには、溶液を100% oxygenで1時間、撹拌しながらバブリングしてください。

次に、バイアルから短い針を抜き、10秒間待ちます。続いて長い針を抜き、密閉したバイアルをグローブボックスに入れます。これはN-A-D-P-H溶液に対する操作です。

1 mgのN-A-D-P-Hを含む1.5 mLのエルノチューブをグローブボックスに入れる。pH 7.5の100 mM 嫌気性リン酸カリウム緩衝液300 µLに溶解させる。

30 µLを分取し、NADP H濃度を決定します。次に、酵素ストックから酸素を除去するため、溶液を攪拌子、ストッパー、およびアルミニウムシールを備えた25 mLバイアルに移します。氷上に置きます。

シュレンクラインに接続し、真空状態で20分間脱気した後、アルゴンで置換します。最後に、バイアル内をアルゴンで10秒間パージし、真空マニホールドから取り外します。バイアルをグローブボックス内の氷上に置きます。

ProData制御ソフトウェアのコントロールパネルウィンドウにおいて、フォトダイオードアレイ、外部トリガー、および対数スケールを選択します。また、ProDataビューアソフトウェアを起動し、データファイルの保存先ディレクトリを指定します。

次に、リザーバーシリンジCおよびF内の溶液を、嫌気性の100 millimolarリン酸カリウム緩衝液（pH 7.5）に交換します。CおよびFのバルブをドライブ位置に回します。pro data制御ソフトウェアの「empty the stop syringe」をクリックしてください。

次に、対応する駆動ラムを手動で押し上げ、両方の駆動シリンジからフロー回路にバッファーを押し出します。リザーバーシリンジCおよびFを用いたフラッシングをさらに3回繰り返します。フロー回路からグルコースオキシダーゼを完全に除去するため、pro dataコントロールソフトウェアのbaselineをクリックしてください。

リザーバーシリンジFの溶液を酵素溶液に交換します。Fバルブをドライブ位置に回します。Pro Dataコントロールソフトウェアの「stop syringe」を空にする（empty）をクリックします。

対応する駆動ラムを手動で上昇させ、駆動シリンジFから酵素溶液をフロー回路に押し出します。プロデータ制御ソフトウェアに戻り、収集時間を60秒に設定します。両方の駆動シリンジにそれぞれの溶液が充填されており、駆動ラムが駆動シリンジのピストンに接触していることを確認してください。

両方のバルブをドライブ位置に回し、Pro Data Controlソフトウェアの「acquire」をクリックしてドライブを実行します。ドライブから得られた452 nmの吸光度値を用い、酸化型の酵素のスペクトルデータを3回測定します。混合前の酵素濃度を決定し、4 mLのNADPH溶液を調製します。

1.5倍濃縮したN-A-D-P-H溶液でリザーバーシリンジCを満たし、前述の手順に従い、ストップシリンジの排液と充填を3回繰り返します。次に、酵素を還元させる間に、嫌気的な100 millimolarリン酸カリウム緩衝液（pH 7.5）を用いてフロー回路内の内容物をフラッシュし、スペクトルを取得します。その後、Pro Data制御ソフトウェアの「baseline」をクリックします。

次に、200 µLの酵素ストック溶液と、1000 µLの嫌気性100 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.5）を混合します。リザーバーシリンジAの溶液を、この酵素溶液に交換します。

pro data制御ソフトウェアで、Aバルブをドライブ位置に切り替えます。「stop syringe empty」をクリックします。対応するドライブラムを手動で上げることで、ドライブシリンジAから酵素溶液をフロー回路に押し出します。

ディレイ時間を0.5秒に、収集時間を60秒に設定します。すべての駆動シリンジに適切な溶液が満たされており、駆動ラムが駆動シリンジのピストンに接触していることを確認してください。次に、すべての駆動バルブを駆動位置（drive position）に回し、Pro Data Controlソフトウェアの「acquire」をクリックします。

酸化状態の酵素のスペクトルデータを3回測定します。次に、リザーバーシリンジBの溶液を、シリンジA内の酵素溶液の1.5倍濃度のN-A-D-P-H溶液に交換します。Bバルブをドライブ位置に回し、コントロールパネルウィンドウに先に示した通り、ストップシリンジを3回空にしてから再充填します。

ディレイ時間を0.5秒に設定します。20秒後のデータ収集時に、リザーバーシリンジの溶液を酸素供給バッファーに交換します。Cバルブをドライブポジションに回します。

Pro Data Controlソフトウェアで3回フラッシュを行います。遅延時間を15秒に、測定時間を900秒に設定します。ストップトフロー装置内で完全に還元された酵素の再酸化が行われている間、スペクトルの測定を継続します。

N-A-D-P-HによるSID Aの嫌気的還元は、452 nmにおける吸光度を用いてフラビンの還元状態の変化を測定することでモニタリングできます。酸化型SID Aから完全に還元されたSID Aの最終スペクトルに至るまでのスペクトル変化を時間経過とともに記録します。この酵素反応ステップの速度は、データを適切な方程式にフィッティングさせることで決定できます。また、ストップトフローのダブルミキシングモードを用いることで、本反応における酸化速度および反応中間体を決定することも可能です。C4a-ヒドロキシフラビン中間体はλmax 380 nmで明確に検出され、酸化型酵素のλmaxは450 nmとなります。

この手法を習得すれば、適切に実施することで4時間から6時間で完了させることができます。溶液が嫌気状態であることを必ず確認してください。このビデオを視聴することで、迅速化学などのさらなるダウンストリーム実験に先立ち、FLA独立モノの相対的なイオンおよび潰瘍性イオンの両方を調査する方法について、十分に理解できるはずです。

Quentinを用いることで、中間体の複雑な性質を解明することができます。