ストップトフロー分光光度法を用いたフラビン依存性モノオキシゲナーゼの還元と酸化の半反応を監視する

この手順では、停止したフロー装置を使用して、SID Aのさまざまなスペクトル形式を検出し、レートを測定します。SID Aによって触媒される反応は、FADの還元的半反応と酸化的半反応に分けることができます。酸化されたフラビンはN-A-D-P-Hに結合して反応し、還元フラビンとNADPに加えて分子状酸素の反応とオルニチンの結合によりC4が形成されます。

オルニチンのヒドロキシル化後のヒドロキシフラビンは、ヒドロキシフラビンが脱水して酸化酵素を形成します。NA DP plusは、触媒サイクル全体を通じて結合したままで、最後に放出される基質です。停止したフロー装置は、少量の反応物とレコードの迅速な混合を容易にします。

時間の経過に伴うスペクトルの変化 スタッフ損失分光光度計は、一過性中間体の酵素触媒反応の形成速度と特に測定することを可能にします。私の研究室の2人のメンバー、リタ・ロビンソンとエンバイロ・ロメロは、モデルシステムとしてフレーバーモノオキシゲナーゼのセットAを使用してこれらの実験を実証します。250ミリリットルの100ミリモルリン酸カリウム緩衝液を、攪拌棒を含む500ミリリットルのブフナーフラスコに注ぎます。

フラスコをゴム栓で密封し、攪拌板に置き、フラスコの短いチューブをシャンクラインに接続します。攪拌しながら室温で1時間真空下で緩衝液を脱気し、続いてアルゴンヌで洗い流します。5回繰り返します。

最後に、フラスコをアルゴンヌで10秒間洗い流します。フラスコをバキュームマニホールドから外し、グローブボックスの中に入れます。フラスコを開けたまま激しくかき混ぜ続けます。

リザーバーシリンジに1ミリリットルあたり18.13単位のグルコースオキシダーゼと100ミリモルのグルコース溶液を入れます。次に、ドライブバルブを負荷位置に設定します。ドライブシリンジを満たします。

次に、Fバルブを駆動位置に回します。プロデータ制御ソフトウェアを使用して、ストップシリンジを空にし、対応するドライブRAMを手動で持ち上げて、ドライブシリンジFからバッファをフロー回路に押し込みます。他の3つのドライブシリンジを1時間平衡化します。

次に、リザーバーシリンジを補充し、停止したフローシステムのフラッシングを繰り返します。酸素飽和緩衝液を調製します。攪拌しながら溶液を100%酸素で1時間泡立てます。

次に、バイアルから短い針を取り出し、10秒待ちます。長い針を取り外し、近くのバイアルをグローブボックスに入れます。N-A-D-P-Hソリューション用。

1.5ミリグラムのN-A-D-P-Hが入った1ミリリットルのアイノアチューブをグローブボックスに入れます。300マイクロリットルの嫌気性100ミリモルリン酸カリウム緩衝液に溶解します。pH 7.5です。

30マイクロリットルを取り出して、NAD-P-H濃度を決定します。次に、酵素ストックから酸素を除去するために、溶液を小麦とストッパー、およびアルミニウムシール付きの攪拌子キャップを含む25ミリリットルのバイアルに移します。氷の上に置きます。

シュリンクラインに接続し、真空で20分間脱気した後、アルゴンヌでフラッシングします。最後に、バイアルをアルゴンヌで10秒間洗い流し、真空マニホールドから外します。グローブボックス内の氷の上にバイアルを置きます。

プロデータ制御ソフトウェアのコントロールパネルウィンドウで。フォトダイオードアレイ、外部トリガ、対数スケールを選択します。また、プロデータビューアソフトウェアを起動し、データファイルストレージのディレクトリを定義します。

次に、リザーバーシリンジCおよびFの溶液を嫌気性100ミリモルリン酸カリウム緩衝液pH7.5と交換します。CバルブとFバルブを駆動位置に回します。プロデータ制御ソフトウェアのストップシリンジを空にします。

次に、対応するドライブRAMを手動で持ち上げて、両方のドライブシリンジからバッファをフロー回路にプッシュします。リザーバーシリンジCとFでフラッシングをさらに3回繰り返します。フロー回路からグルコースオキシダーゼを完全に除去するには、proデータ制御ソフトウェアのベースラインをクリックしてください。

リザーバーシリンジFの溶液を酵素溶液と交換します。Fバルブを駆動位置に回します。プロデータ制御ソフトウェアのストップシリンジを空にします。

対応するドライブラムを手動で持ち上げることにより、ドライブシリンジFから酵素溶液をフロー回路に押し込みます。プロデータコントロールソフトウェアに戻り、取得時間を60秒に設定します。両方のドライブシリンジに対応する溶液が充填されていること、およびドライブ RAM がドライブシリンジに接触していることを確認します。ピストン。

両方のバルブを駆動位置に回し、プロデータ制御ソフトウェアで[取得]をクリックして駆動を実行します。ドライブから得られたA 4 52ナノメートルの値を使用して、酵素の酸化型を三重にスペクトルデータを取得します。混合する前に酵素濃度を決定し、4ミリリットルのNA-D-P-H溶液を調製します。

1.5倍以上に濃縮されたリザーバーシリンジCをNADPh溶液で充填し、前に示したようにストップシリンジを空にして3回補充します。次に、嫌気性 100 ミリモルリン酸カリウム緩衝液 pH 7.5 を使用して、フロー回路から酵素フラッシュ含有量を減少させながらスペクトルを取得します。次に、プロのデータ制御ソフトウェアのベースラインをクリックします。

次に、200マイクロリットルの酵素ストック溶液を1000マイクロリットルの嫌気性100ミリモルリン酸カリウム緩衝液と混合します。pH 7.5。リザーバーシリンジAの溶液を酵素溶液と交換します。

Aバルブをプロデータ制御ソフトウェアのドライブ位置に回します。空の停止シリンジをクリックします。ドライブシリンジAから酵素溶液をフロー回路に押し込み、対応するドライブラムを手動で持ち上げます。

遅延時間を 0.5 秒に、取得時間を 60 秒に設定します。すべてのドライブシリンジに対応する溶液が充填され、ドライブラムがドライブシリンジピストンに接触していることを確認します。次に、すべてのドライブバルブをドライブ位置に回し、プロデータ制御ソフトウェアで[取得]をクリックします。

酵素の酸化型をトリプリケートでスペクトルデータを取得します。次に、リザーバーシリンジBの溶液をN-A-D-P-H溶液と交換します。シリンジAの酵素溶液よりも1.5倍濃縮されています。コントロールパネルウィンドウで前に示したように、Bバルブを駆動位置に回して空にし、ストップシリンジを3回補充します。

遅延時間を 0.5 秒に設定します。20秒での取得は、貯水池シリンジ海の溶液を酸素化バッファーに置き換えます。Cバルブを駆動位置に回します。

プロのデータ制御ソフトウェアで3回フラッシュします。遅延時間を 15 秒、取得時間を 900 秒に設定します。停止したフロー装置で完全に還元された酵素の再酸化中にスペクトルを取得し続けます。

N-A-D-P-HによるSID Aの嫌気性還元性低下は、ここでは452の吸収剤を使用してフラビンの酸化還元状態の変化を測定することで監視できます。スペクトルの変化は、酸化されたSID Aから完全に還元されたSID Aの最後のスペクトルまで経時的に記録されます。この酵素ステップの速度は、データを適切な式に適合させることによって決定できます。酸化速度と反応中間体は、AF Sid A.The C 4 Aヒドロキシフラビン中間体によるこの反応で停止した流れの二重混合モードを使用して決定することもでき、ラムダマックス3 80ナノメートルで検出され、酸化酵素はラムダマックス450ナノメートルです。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4〜6時間で完了できます。溶液が嫌気性であることを確認してください。このビデオを見た後、FLA非依存モノラルの相対イオンと潰瘍性イオンの両方を、ラピッドケミカルのようなさらに下流の実験で調査する方法をよく理解できるはずです。

クエンティンは、中間体の悲しい性質を解明するのを助けることができます。