GFPをレトロウイルスベクターを用いた誘導多能性幹細胞（性IPSC）にヒト体細胞を再プログラミングする
2012年4月3日
OCT4、SOX2、KLF4とMYCのレトロウイルス媒介性異所性発現を介してヒトの人工多能性幹細胞（性IPSC）を生成する方法が記載されている。 GFP発現に基づいて人間のIPSCコロニーを識別するための実用的な方法についても説明されています。
この手順の全体的な目標は、GFPレポーターシステムを使用して、レトロウイルスを介したOCT 4、SOX 2K LF 4、およびMの過剰発現を介してヒトIPS細胞を作製することです。これは、まずレトロウイルスを発現する個々のGFPを適切な量で添加することによって達成されます。次に、GFPを発現するウイルス感染細胞を、マウス胚性線維芽細胞を用いて0.1%ゼラチン被覆プレートに移します。
手順の3番目のステップは、培地をヒト胚性幹細胞培養培地に置き換えることです。最後に、ヒト胚性幹細胞と同様の形態を示すGFPサイレンシングIPSコロニーを単離します。最終的に、結果は免疫蛍光染色とR-T-Q-P-C-Rによる内因性多能性マーカーの発現を示しています。
この手法は、多能性表面マーカーによる生活習慣染色や形態変化の観察など、既存の方法の主な利点が望ましいiPadです。細胞コロニーは、多能性細胞のマーカーとしてGFP発現の喪失を用いて容易に単離することができ、培養を開始する。感染プレートの1日前に線維芽細胞培地のヒト線維芽細胞は、10回から5番目のヒト線維芽細胞を6ウェルプレートの1ウェルに1回、翌日、培地を吸引して死んだ細胞を除去し、2ミリリットルの新鮮な線維芽細胞培地を5ミリリットルの硫酸プロタミン1ミリリットルあたり追加します。
次に、5つの感染の多様性に対応する各GFP発現ウイルスの適切な量を慎重に追加します。感染の翌日に細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。ウイルス上清を2ミリリットルのPBSで3回洗浄します。
その後、感染の3日後に2ミリリットル、線維芽細胞培地を追加します。GFP蛍光を確認し、ウェルに2ミリリットルを補充します。翌日の線維芽細胞培地を、0.1%ゼラチンでコーティングした10センチメートルのシャーレに、照射したマウス、胚性線維芽細胞またはメスフィーダー細胞を1平方センチメートルあたり10〜4
回プレートします。細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、感染したヒト線維芽細胞を1ミリリットルの0.05%tripsin EDTAで5分間摂氏37度で剥離し、200Gで5分間遠心分離します。24時間後。
培地をHESC培地に交換し、毎日培地を交換します。ESC様コロニーは、蛍光顕微鏡下でESC様コロニーが出現してから感染後20〜27日で出現し始めます。HSCと同様の形態を示すコロニーにGFP蛍光が存在しないことを確認します。
10マイクロリットルのピペットを使用。個々のIPSCコロニーを選択し、ゼラチンとメスでコーティングされた12ウェルプレートの1つのウェルに入れ、HESC培地を補充します。1ミリリットルのDMM F12でプレートを洗浄することにより、細胞を毎日媒体を通過させます。
次に、0.5ミリリットルのコラゲナーゼを加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。細胞をDM A MF 12で2回洗浄します。次に、2ミリリットルの新鮮なHESC培地を追加します。
次に、セルリフターを使用してコロニーを細かく分割し、残りの細胞をプレートから分離します。再懸濁したコロニー片をゼラチンとMEFコーティング6の1つのウェルに移します。ウェルプレートをプレートに取り、摂氏37度で2日間インキュベートします。
免疫蛍光法で細胞を確認します。PBSで3回洗浄し、室温で4%パラアルデヒドで20分間固定します。細胞をPBSで3回穏やかに洗浄し、PBS中の0.2%トリットン×100を30分間透過させます。
非特異的結合をブロックし、細胞をPBS中の3%BSAと2時間インキュベートします。次に、細胞を一次抗体と併用して4°Cで一晩インキュベートします。その後、PBSで細胞を3回洗浄し、二次抗体と室温で暗所で1時間インキュベートします。
最後の洗浄中に細胞をPBSで3回洗浄します。ダピーを加え、室温で5分間インキュベートします。蛍光顕微鏡を使用して細胞を画像化し、定量的にリアルタイムで行います。
PCRは、ヒト線維芽細胞に由来するヒトIPCから全RNAを分離します。RNA単離キットを使用する。逆転写酵素を使用して最初の鎖cDNAを合成します。
次に、それをQPCRのテンプレートとして使用して、多能性遺伝子を検出します。ここに示されているヒト線維芽細胞、OCT 4、SOX 2、KLF 4、およびミックを保有するレトロウイルスのカクテルに感染したBJ 1は、5日目からの再プログラミング中に観察された形態学的変化です。今日の10、14、および21では、細胞は21日後にHESC様の形態を示し始め、IPCはGFP蛍光によって認識されます。
ESCやIPCなどの多能性幹細胞は、プロウイルス遺伝子の発現を抑制する分子機構を発現しています。しかし、ここで用いるレトロウイルスベクターは、レトロウイルスLTRにより遺伝子のリプログラミングとともにGFPを発現します。このように、GFPを連続的に発現する細胞は、ここで見られるように、プロウイルス遺伝子のサイレンシングを伴わずに導入遺伝子を発現すると考えられ、Pluripotency Molecular Networkを獲得した再プログラムされたIPSCコロニーは、GFPの発現がないことが示されている。
この図は、デトロイト5 51線維芽細胞に由来するコロニーの免疫組織化学分析を示しており、TRA 180 1、TRA 1、60 SSEA、4、T、4、およびナノに対する抗体を使用して、成功裏に見ることができます。再プログラムされたIPCは、これらすべてのマーカーを発現します。また、遺伝子発現解析のために定量R-T-P-C-Rを実施したところ、親線維芽細胞と比較して、T4、SOX2、KLF4、M、nanoが有意に増加し、H9の造血幹細胞と同等であることが明らかになった。
このビデオを見れば、ウイルスに感染する方法、蛍光顕微鏡を使用して完全にリッププログラムされたIPA細胞を特定し、取り出す方法について十分に理解できるはずです。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この記事では、重要な多能性因子のレトロウイルスを介した発現を利用してヒトのiPS細胞（iPSCs）を生成する方法について説明しています。また、GFP発現を通じてiPSCコロニーを特定するための実践的なアプローチについても議論しています。
主要な研究要素
科学の領域
- 幹細胞生物学
- 細胞リプログラミング
- 再生医療
背景
- 誘導多能性幹細胞（iPSCs）は、研究と治療応用に不可欠です。
- レトロウイルスベクターは幹細胞研究で遺伝子送達によく使用されます。
- GFP（Green Fluorescent Protein）は、正常にリプログラミングされた細胞を特定するためのマーカーとして機能します。
- 多能性の理解は再生医療の進歩に不可欠です。
研究の目的
- ヒトのiPSCを生成するための信頼性の高い方法を確立すること。
- GFPレポーターシステムを利用してiPSCコロニーを特定すること。
- 生成されたiPSCにおける多能性マーカーの発現を示すこと。
使用された方法
- GFP発現レトロウイルスによる標的細胞の感染。
- 感染細胞のマウス胚胎線維芽細胞をコーティングしたゼラチンプレートへの移行。
- 培地をヒト胚胎幹細胞培養培地に置き換えること。
- 胚胎幹細胞様の形態を示すGFP陽性iPSCコロニーの分離。
主な結果
- GFP発現によって確認されたiPSCの成功的な生成。
- ヒト胚胎幹細胞様の形態を示すコロニーの分離。
- 免疫蛍光染色によって検証された内因性多能性マーカーの発現。
- RT-qPCRによる多能性マーカーの定量分析。
結論
- 記述された方法はヒトiPSCを効果的に生成します。
- GFP発現はiPSCコロニーを特定するための信頼性の高いマーカーとして機能します。
- このアプローチは幹細胞生物学と再生医療のさらなる研究を促進する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Reprogramming human somatic cells into iPSCs using retroviral vectors with GFP enables robust target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides a reproducible platform for generating pluripotent cells, supporting predictive confidence in disease modeling and translational research. The method's quantitative outputs and marker-based selection streamline portfolio triage and accelerate preclinical pipeline advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates interrogation of reprogramming hypotheses and pluripotency pathway activation.
- Enables biological de-risking by confirming endogenous pluripotency marker expression.
- Supports predictive confidence for downstream disease modeling and cell-based assays.
- Provides a standardized system for functional target validation in regenerative research.
Screening & Assay Development
- Prepares validated iPSC lines for scalable compound screening and phenotypic assays.
- Delivers reproducible, marker-defined cell populations for assay standardization.
- Enables quantitative assessment of pluripotency via immunofluorescence and RT-qPCR.
- Supports reliable evaluation of reprogramming efficiency and transgene silencing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns iPSC generation with disease-relevant model development for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of cell-based therapies and biomarker studies.
- Provides mechanistic de-risking for preclinical validation of pluripotency and differentiation potential.
Pipeline & Workflow Integration
This iPSC reprogramming protocol integrates from early discovery through preclinical model development, supporting lead identification and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct assessment of pluripotency induction.
- Screening: Delivers reproducible, marker-validated iPSC lines for downstream assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative outputs via immunofluorescence and RT-qPCR for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation by generating disease-relevant pluripotent cells.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating iPSCs from diverse somatic sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pluripotency induction.
- Operational Value: Standardizes iPSC generation and selection for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of cell-based programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of regenerative and disease modeling initiatives.
Implementation Considerations
- Requires expertise in retroviral transduction and stem cell culture techniques.
- Demands access to fluorescence microscopy and quantitative PCR infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of marker validation and colony selection criteria.
- Adaptation may be needed for different somatic cell sources or feeder systems.
- Potential limitations include retroviral integration and transgene silencing variability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:28
Infecting Cells with Retrovirus Expression Reprogramming Factors
3:31
Isolation and Expansion of Induced Pluripotent Stem Cells
4:42
Analysis of Pluripotent Markers by Immunofluorescence and Quantitative Real-time PCR
6:06
Representative Cell-reprogramming Results
8:03
Conclusion
